文摘

氧化应激和炎症的一部分cisplatin-induced肾毒性。这项工作的目的是研究大豆异黄酮成分的作用,大豆苷cisplatin-induced肾损害。Cisplatin-induced肾毒性是明显的组织学损伤在近端小管细胞和血清中性粒细胞增加gelatinase-associated lipocalin (NGAL)、血尿素氮(BUN)测定,肌酐,尿肾损伤molecule-1 (KIM-1)。Cisplatin-induced细胞死亡被TUNEL染色显示,caspase-3/7活动。黄豆苷治疗减少肾损伤标记(NGAL、包子、肌酐和KIM-1)和减毒细胞死亡(凋亡标记)。在cisplatin-induced肾损伤,肾脏氧化/ nitrative压力日益增加的脂质过氧化作用和蛋白质硝化。顺铂诱导活性氧species-generating酶NOX-2和抗氧化防御酶活性减弱,如谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)的活动。Cisplatin-induced氧化/ nitrative压力是减毒黄素的治疗。顺铂诱导大豆苷减毒CD11b-positive CD11b-positive巨噬细胞在肾脏和细胞。黄素减毒cisplatin-induced炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)、白介素10 (il - 10)、白介素18(地震)和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)。黄素减毒细胞死亡在体外。我们的数据表明,大豆苷减毒cisplatin-induced肾损伤的氧化/ nitrative差别通过对这些压力,免疫细胞,炎症细胞因子,和凋亡细胞死亡,从而提高肾脏再生。

1。介绍

顺铂是一种常用的抗癌药物治疗实体肿瘤。癌症细胞死亡的机制是通过其dna结合特性形成加合物和停止癌细胞的复制。的一个主要的副作用顺铂肾毒性,并由优惠顺铂在近端小管通过特定的吸收转运体(1]。水合作用被用来缓解这个问题与一些成功。然而,存在剂量依赖的相关性肾毒性顺铂化疗期间是一个限制因素。机制cisplatin-mediated肾毒性是由氧化应激和炎症引起的凋亡细胞死亡。

顺铂是主要由肾脏排泄,高浓度的顺铂积累,由于基底外侧有机阳离子系统[2]。顺铂在线粒体也积累和调节其生物能学3]。然而,大量的文献表明,氧化应激在肾损害中起着至关重要的作用4]。细胞死亡与氧化应激导致炎症反应和高度相关的发病机制cisplatin-induced肾毒性(5]。

各种天然生物活性化合物,具有抗氧化和消炎作用,表现出renoprotective活动顺铂肾毒性的动物模型。黄素在大豆和成分的中药Nao梅通公式。黄素是一种异黄酮抗氧化,抗炎,phytoestrogenic属性。大豆苷显示抗炎作用endotoxin-induced生264.7巨噬细胞(6]。在临床试验中,大豆和大豆苷改善肾功能纯化(7]。黄素抑制STAT-1和NF -κB激活的激活巨噬细胞(8]。黄素心血管和antiarthritogenic对类风湿性关节炎的影响。临床试验(ClinicalTrials.govNCT02075112期间与大豆补充剂)是目前正在进行的顺铂化疗和放疗治疗头颈癌减少副作用引起的治疗。

在这里,我们表明,大豆苷是预防cisplatin-induced肾毒性。保护作用是由其抗氧化和消炎作用。

2。材料和方法

2.1。老鼠实验

所有协议都是动物实验的伦理委员会批准的第一附属医院、医学院、浙江大学,中国科学院的指导下。鼠标像之前描述的那样使用应变C57BL / 6 (9]。雄性老鼠的~ 8周的年龄在18到22岁的权重被用于所有实验。老鼠牺牲深度与5%异氟烷麻醉下颈椎脱位后第三天(72小时)一个注射顺铂(cis-diammineplatinum (II)二氯化,σ)在剂量25毫克/公斤ip 5% DMSO /生理盐水。高质量的大豆苷(> 98%纯)购自南京Zelang医疗技术有限公司大豆苷在DMSO /生理盐水溶解,在200毫克/公斤,i.p。后两天,开始1 h顺铂。黄素和车辆也独自管理(不含顺铂治疗)作为一个单独的组。

2.2。肾脏功能

血清血尿素氮(BUN)和肌酐测定如前所述10]。血清NGAL和尿KIM-1测量使用鼠标从血清NGAL Quantikine酶联免疫试剂盒和鼠标KIM-1 Quantikine酶联免疫试剂盒(长宁研发系统中国有限公司,中国)根据制造商的指示。

2.3。组织学

周期性acid-Schiff (PAS)染色组织学检查是执行如前所述[10]。幻灯片PAS染色是基于以下四个组织学检查和评分标准。管损伤PAS-stained部分是在显微镜下检查和得分基于百分比的皮质小管上皮坏死:0-normal, 1 - < 10%, 2 - 10至25%,3-26至75%,4 - > 75%。肾小管坏死的损失被定义为近端小管刷状缘,顶端细胞膜出泡,管状上皮细胞基底膜分离,或管腔内的聚合的细胞和蛋白质。形态学检查的失明的方式。

使用单克隆抗体anti-nitrotyrosine硝基酪氨酸蛋白染色(开曼化工、NeoBioscience技术,深圳,中国)如前所述执行(10]。

2.4。荧光显微镜

肾脏与切片机,deparaffinized染色,荧光显微镜下面提供。在肾脏细胞凋亡检测TUNEL分析(美国罗氏诊断,印第安纳波利斯)连同核染色使用赫斯特33342 (Solarbio,中国)如前所述10]。CD11b-conjugated FITC(美国BD生物科学),中性粒细胞和单核细胞(白细胞)和核染色赫斯特33342年(中国Solarbio)被用于肾脏部分。

2.5。肾细胞凋亡

Caspase-3/7活动的溶解产物测定使用Apo-ONE同质Caspase-3/7分析工具包(美国Promega Corp .)、麦迪逊、WI)如前所述[9]。Caspase-3/7活动提出了caspase-3活动图和文本。活动被表示为褶皱变化。

2.6。肾HNE蛋白加合物和蛋白质硝化

硝基酪氨酸含量是评价ELISA(描述9]HNE加合物测定使用OxiSelect™HNE加合物酶联免疫试剂盒(细胞生物学实验室,Genetimes技术有限公司、上海、中国)如前所述[9]。

2.7。定量测定SOD活性

从组织SOD活性测定溶菌产物使用SOD活性套件(恩佐生命科学International Inc .,普利茅斯会议上,PA,美国)所述前(9]。

2.8。谷胱甘肽过氧化物酶测定

谷胱甘肽过氧化物酶测定使用谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)试验设备(Abcam贸易有限公司、上海、中国)根据制造商的指示。

2.9。谷胱甘肽含量

谷胱甘肽(GSH)是由使用比色工具包(建成生物工程研究所、中国)根据制造商的指示。

2.10。实时聚合酶链反应

隔离的RNA和实时PCR进行如前所述[9,10]。肿瘤坏死因子的引物组α(PPM03113G)地震(PPM03112B), il - 10 (PPM03017C) MCP-1 (PPM03151G) NOX2 (PPM32951A)β肌动蛋白(PPM02945B)购买试剂盒(浦东,上海,中国)。

2.11。肾免疫印迹

如前所述(执行免疫印迹11]。

2.12。细胞培养,流式细胞术分析

如前所述(HK-2细胞生长和处理9]。顺铂是添加在50岁μM和车辆或在30大豆苷μ米后30分钟延迟顺铂24小时。如前所述的流式细胞仪实验(9]。

2.13。统计分析

所有数据被当作手段±sem。多重比较(图基)进行使用单向方差分析。GraphPad棱镜的分析软件(GraphPad软件有限公司、钙、美国)。一个 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。黄素对Cisplatin-Induced管状损害,肾损伤和细胞死亡

顺铂政府C57BL6小鼠导致重大的管状损害72小时PAS染色(图中观察到1)。组织学检查和量化了空泡形成,蛋白质的形成,和脱落的肾小管上皮细胞。大豆苷治疗小鼠明显减毒的损害。也顺铂诱导肾脏功能障碍所发现的肾损伤参数如NGAL,包子,肌酐,尿KIM-1(图2)。顺铂政府导致了2.46,6.92,9.93,和NGAL增加20倍,面包,肌酐,和KIM-1分别。黄素减毒肾损伤标记。黄素在200毫克/公斤减少cisplatin-induced如图所示肾损伤,降低血清水平的NGAL(2.93到1.60),包(153.5到103.6),肌酐(1.65 - 1.11),和泌尿KIM-1(3.7到1.98)。顺铂是导致肾脏凋亡细胞死亡。我们已经观察到显著增加在顺铂肾TUNEL染色,数量减少了大豆苷治疗后(图3(一个))。定量测定caspase-3/7活动表明,顺铂诱导大豆苷治疗增加和减少43.9%的3.86倍(图caspase-3/7活动3 (b))。

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图1
黄素对cisplatin-induced肾小管损伤小鼠的影响。(一)顺铂诱导管状如图所示的损害PAS染色。损坏是减毒黄素(daidz)治疗剂量200毫克/公斤。(b)量化的管状损害得分PAS-stained幻灯片。结果均值±SEM ( /组)。 与车辆和# 与顺铂。
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图2
黄素对cisplatin-induced肾功能障碍小鼠的影响。顺铂引起严重肾机能障碍的水平取决于NGAL (a),面包(b),肌酐(c)和尿KIM-1 72小时(d)。顺铂诱导肾损伤减毒的大豆苷治疗。结果均值±SEM ( /组)。 与车辆和# 与顺铂。
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图3
黄素对cisplatin-induced细胞死亡的影响。组织学检查(a)展示了肾脏cisplatin-induced TUNEL染色(绿色)和TUNEL染色明显减毒黄素管理。核沾染了赫斯特33342年(蓝色)。(b) Caspase-3活动测定和黄素减毒cisplatin-induced Caspase-3活动。结果均值±SEM ( /组)。 与车辆和# 与顺铂。

肾毒性与毒品有关的急性肾损伤住院老年人大约是20%,增加到66% (5]。顺铂在高浓度积累肾脏肾运输系统,及其毒性是剂量依赖12]。整个大豆和大豆苷对肾功能有积极影响其组成在临床试验7]。药物动力学的黄素在人类、老鼠和老鼠演示了其存在葡糖苷酸(13,14]。中医比较药物动力学Nao Mai通在老鼠的一项研究也表明大豆苷的存在(15]。在我们的研究中,大豆苷显著降低cisplatin-induced急性肾损伤,改善肾功能,使肾小管细胞死亡。

3.2。黄素对Cisplatin-Induced氧化应激和抗氧化防御

Cisplatin-induced肾毒性是由氧化应激(16]。我们评估的影响大豆苷等cisplatin-induced氧化足迹HNE蛋白加合物和蛋白质硝化。氧化应激标记HNE蛋白加合物和蛋白质硝化增加2.6——2.9倍cisplatin-treated老鼠(图4(一))。大豆苷降低39.9%和48.7%的治疗HNE蛋白加合物和蛋白质硝化,分别。我们还研究了蛋白质硝化组织学染色,大豆苷显著降低cisplatin-induced蛋白质硝化(图4 (b))。在以上实验中,大豆苷时并没有改变任何氧化应激标记单独管理。

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图4
黄素cisplatin-induced氧化/ nitrative应力的影响。(一)定量测定HNE加合物和蛋白质硝化的ELISA证明cisplatin-induced脂质过氧化作用和蛋白质硝化。黄素减毒cisplatin-induced氧化/ nitrative压力标记。(b)组织学染色蛋白质硝化。这一趋势类似于定量观察蛋白质硝化。结果均值±SEM ( /组)。 与车辆和# 与顺铂。

平衡的活性氧(ROS)生成酶和抗氧化防御酶对顺铂肾毒性(至关重要10,17]。我们发现cisplatin-induced NOX2 ROS-generating酶的基因表达显著减毒黄素(3.8 - 2.3倍,图5(一个))。谷胱甘肽中起关键作用cisplatin-induced肾损伤(18]。黄素也改善了多达66%的cisplatin-mediated损耗减少谷胱甘肽的小鼠肾脏(图5 (b))。此外,大豆苷增强cisplatin-mediated减少谷胱甘肽过氧化物酶活性和总SOD活性高达49%和55%,分别为(数字5 (c)和5 (d))。

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图5
黄素对cisplatin-induced ROS-generating NOX2和抗氧化防御酶的变化在老鼠身上。(a)顺铂诱导ROS-generating酶NOX2信使rna由实时PCR、大豆苷减毒和cisplatin-reduced减少谷胱甘肽,谷胱甘肽过氧化物酶活性、SOD活性。黄素政府恢复这些抗氧化防御接近对照组。结果均值±SEM ( /组)。 与车辆和# 与顺铂。

氧化应激在cisplatin-induced急性肾损伤中起着重要作用[16,19,20.]。先前的研究表明,顺铂介导的脂质过氧化作用的增加(一氧化应激标记)和类黄酮和抗氧化剂21- - - - - -23]。蛋白质硝化的另一个特征是由过氧亚硝基和cisplatin-induced肾脏氧化应激(9]。在这里,我们表明,大豆苷减毒cisplatin-induced蛋白质硝化反应和脂质过氧化(HNE加合物)。NOX2之一几个来源氧化应激(24,25]。黄素减毒cisplatin-induced NOX2表达式。抗氧化防御也是cisplatin-induced肾病的关键(9,26]。顺铂的储备降低减少谷胱甘肽,SOD活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性在肾脏27- - - - - -29日]。与早期的研究一致,顺铂受损的谷胱甘肽储备减少,减少谷胱甘肽过氧化物酶活性和SOD活性。大豆苷改善所有三个抗氧化防御机制,从而改善cisplatin-induced氧化应激。

3.3。黄素对Cisplatin-Induced白细胞浸润的影响和肾脏炎性细胞因子

Cisplatin-induced其次是浸润的中性粒细胞和巨噬细胞炎症反应(早些时候报道10,19,24]。与早期的发现一致,我们观察到CD11b-positive cisplatin-induced肾损伤和黄素细胞显著减少CD11b-positive细胞(图6)。顺铂诱发一些肿瘤坏死因子等细胞因子α,il - 10、地震和MCP-1在肾损伤30.- - - - - -32]。顺铂诱导肿瘤坏死因子α,地震- il - 10和MCP-1 mRNA表达到4.3,3.5,3.4,和2.98倍,分别(图7(一))。大豆苷治疗减39.9%,46.2%,47%,和43.2%的肿瘤坏死因子αil - 10的地震,分别和MCP-1 mRNA表达。我们进一步证实细胞因子肿瘤坏死因子之一α通过免疫印迹分析(图7 (b)),结果是符合mRNA水平。GAPDH是用作加载控制。


图6
黄素对cisplatin-induced CD11b-positive单核细胞/巨噬细胞在小鼠体内。细胞免疫荧光检查发现重大CD11b-positive cisplatin-treated集团(黄色)。核染色(蓝色)是使用赫斯特33342年。顺铂组的缩放图像提供了单个细胞作为插图表明染色覆盖表面染色和一个更大的区域比核染色。大豆苷治疗CD11b-positive细胞的数量减少。车辆(阿明费)或大豆苷(daidz)对照组没有任何CD11b-positive细胞。
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图7
黄素对cisplatin-induced促炎细胞因子在老鼠身上。(一)促炎细胞因子肿瘤坏死因子的实时pcr分析αil - 10,地震,MCP-1表示深刻的增加cisplatin-treated老鼠。大豆苷治疗减毒cisplatin-induced细胞因子MRNA的表达。结果均值±SEM ( /组)。 与车辆和# 与顺铂。(b)肿瘤坏死因子的免疫印迹分析α和控制GAPDH。

的发病机理cisplatin-induced肾毒性、炎症扮演另一个主要角色12,33]。不同的免疫细胞,即中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞和树突细胞,发挥他们在炎症反应中的作用[12]。中性粒细胞和monocyte-derived巨噬细胞是骨髓细胞追求共同目标中和危险cisplatin-mediated肾病(32,34]。CD11b是一个α整合素,整合素家族成员,主要表达在单核细胞/巨噬细胞。与早些时候的数据一致,我们也观察到显著增加在cisplatin-induced CD11b-positive巨噬细胞肾损伤(35]。黄素cisplatin-induced减少巨噬细胞积累的肾脏。黄素抑制一氧化氮和il - 6在lipopolysaccharide-induced巨噬细胞(36]。

顺铂激活NF -κB通路,从而促进肿瘤坏死因子等炎性细胞因子α。黄素减毒cisplatin-induced肿瘤坏死因子α与先前的研究一致,黄连素,姜黄素和绿原酸介导renoprotective效应(21,37,38]。地震在cisplatin-mediated毒性也至关重要39]。基因删除caspase-1,裂解的地震活动,减少顺铂肾损伤和中性粒细胞浸润40]。地震是由顺铂诱导和减毒黄素治疗在我们的研究中。il - 10和MCP-1也扮演一个角色在cisplatin-induced肾损伤(31日,41,42]。我们也观察到,顺铂诱导il - 10和MCP-1 mRNA和减毒黄素。树突细胞产生il - 10,树突细胞的调制黄素在顺铂肾病不能排除在外。

3.4。黄素对Cisplatin-Induced近端肾小管细胞的细胞死亡在体外

黄素减少氧化应激和炎症。我们还研究了它在细胞死亡的影响在体外条件使用HK-2近端肾小管细胞线。顺铂诱导凋亡和坏死细胞死亡50μM(图24小时8(一个))。大豆苷增加30μ米减毒细胞死亡28.29%(图8 (b))。没有黄素对HK-2细胞死亡的影响,当添加没有顺铂。

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图8
黄素对cisplatin-induced细胞死亡的影响在体外。(a)代表点阴谋HK-2细胞仪数据流的处理大豆苷在盐水或顺铂的存在与否。x设在代表膜联蛋白V而凋亡细胞死亡标志y设在代表了死细胞标记SYTOX绿色。(b)定量测定细胞死亡(Q2和Q3)在不同的组。结果均值±SEM ( /组)。 与车辆和# 与顺铂。

Daidzein-mediated保护cisplatin-induced近端肾小管细胞死亡证明其直接作用。Cisplatin-induced肾毒性是一个更复杂的情况下相互作用的氧化应激,炎症和细胞死亡部分相关。因为大豆苷的抗炎特性是早些时候报道和我们的数据证明其在炎症细胞因子直接作用,我们得出的结论是,大豆苷有抗炎作用除了它的功能,以防止细胞死亡。同样重要的是要注意,大豆苷有抗雌激素的属性(43]。然而,这些特定的大豆苷的性质没有影响我们的研究为我们使用雄性老鼠。

4所示。结论

Cisplatin-induced管状细胞损伤,细胞死亡,和相关的肾损伤小鼠明显减毒黄素的政府。保护的分子机制是通过相互作用介导的氧化应激和炎症(图9)。黄素调制cisplatin-induced脂质过氧化反应、蛋白质硝化和NOX2 mRNA。黄素也改善了cisplatin-impaired抗氧化防御如谷胱甘肽储备减少、GPX活性、SOD活性。Cisplatin-induced巨噬细胞积累和促炎细胞因子生产减毒黄素。


图9
原理图的黄素cisplatin-induced肾脏损伤的保护机制。EGCG抑制cisplatin-induced ROS的衰减ROS-generating酶和改善cisplatin-impaired肾小管细胞的抗氧化防御机制导致细胞死亡。细胞死亡也会导致促炎反应和细胞因子浸润白细胞增加活性氧的释放。黄素直接变弱细胞死亡。黄素还中和细胞因子和浸润白细胞。抗氧化和抗炎作用导致减少细胞死亡,从而防止cisplatin-induced肾脏损伤。

信息披露

资助机构没有参与研究设计或结论。

的利益冲突

所有作者特此声明,不存在利益冲突。

作者的贡献

杭州孟、傅Guanghou和杰沈了同样的工作。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(没有。81000302),浙江省科学技术厅(没有。2015 c33214),浙江省医疗卫生科技计划项目(2014 kya070)。