文摘
芹黄素,组件在日常饮食中,表明抗氧化和消炎作用。这里,我们旨在探索机制apigenin-mediated endotoxin-induced心肌损伤和炎症之间的相互作用,其作用氧化应激和自噬。在脂多糖(LPS)诱导心肌损伤模型,芹黄素改善心脏损伤(乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)),细胞死亡(TUNEL染色、DNA碎片和PARP活动),和组织损伤(心肌肌钙蛋白I (cTnI)和心肌肌凝蛋白光chain-1 (cMLC1))和改善心脏功能(舒张期左心室射血分数(EF)和结束的内在维度(LVID))。芹黄素还缓解endotoxin-induced心肌损伤通过调节氧化应激(硝基酪氨酸和蛋白质羰基)和炎性细胞因子(TNF -α,il - 1β,MIP-1α和MIP-2)以及它们的主调节器NFκb .芹黄素调制氧化还原内稳态,其抗炎作用可能与控制自噬的能力。自噬(由LAMP1、ATG5 p62),其转录调节转录因子EB (TFEB)和下游靶基因包括空泡的蛋白质sorting-associated 11 (Vps11)和microtubule-associated蛋白质1 b / 1轻链3 b (Map1lc3)被芹黄素调制。因此,我们的研究表明,芹黄素可能导致的潜在发展新目标在脓毒症治疗或其他心肌氧化和/或inflammation-induced受伤。
1。介绍
脓毒症在全世界影响大量的人在紧急护理和具有显著的成本和惊人的高死亡率1]。在脓毒症病人死亡率甚至更高在过去几年(2]。心血管疾病的风险要高得多从严重脓毒症患者中幸存下来3]。脓毒症是由于革兰氏阴性细菌的细胞壁的成分:脂多糖(LPS)。心脏功能障碍是sepsis-related并发症的关键因素之一4,5]。炎症的重要作用和相关NF的激活κB在LPS-induced败血症已报告在文献[6- - - - - -8]。氧化应激在脓毒症是有据可查9,10]。自噬在脓毒症中的作用是至关重要的,但相关的研究非常有限11,12]。
心血管疾病事件的上升是由于流行的肥胖、糖尿病和高血压(13]。增加氧化应激和慢性低度炎症发生在所有这些疾病除了老化(14,15]。慢性炎症导致循环免疫细胞和血小板,产生超氧化物作为线粒体呼吸的副产品或脂肪氧合酶等酶促反应,髓过氧化物酶,NADPH氧化酶类、黄嘌呤氧化酶(16]。因此,相互作用的炎症和氧化应激在心血管疾病中扮演着至关重要的作用。
黄酮类化合物,存在于水果和蔬菜,多酚类物质,有很大的潜力对心血管并发症包括败血症(17- - - - - -19]。芹黄素、类黄酮是一种传统的中药隔绝芹菜芹菜graveolens。芹黄素也出现在欧芹和洋甘菊。各种研究表明,芹黄素是抗癌,抗氧化,抗炎(20.- - - - - -22]。芹黄素的心血管效应在许多研究已报告。芹黄素改善心肌缺血/再灌注损伤通过p38增殖作用的失活蛋白激酶(23]。芹黄素降低血压、心脏重量、心脏重量指数、心肌细胞横截面积和血清血管紧张素ⅱ通过HIF-1和PPAR在心脏肥大模型α通路(24]。在自身免疫性心肌炎小鼠模型,芹黄素中转保护通过抑制淋巴细胞增殖(25]。芹黄素的促炎细胞因子表达通过灭活NF-kappaB p65磷酸化的抑制体外研究人类单核细胞,减少LPS-induced小鼠的死亡率(26]。在LPS-induced endotoxemic鼠模型,芹黄素变弱的心伤抑制鞘氨醇激酶1 /鞘氨醇1-phosphate信号通路(27]。我们先前已经表明自噬的作用,炎症和氧化应激在脓毒症模型28),白藜芦醇的心血管作用通过NRF2 LPS-induced心肌毒性(29日]。
在这项研究中,我们表明,芹黄素防止LPS-induced心脏组织损伤、心脏损伤、心肌细胞细胞死亡,和心脏功能障碍。心脏保护芹黄素是由其消炎和抗氧化的效果。自噬的芹黄素在心脏保护也扮演了一个角色。
2。方法
2.1。动物实验
4 - 6周大的雄性C57BL / 6小鼠获得山东大学实验动物中心(济南,山东,中国)。有限合伙人购买从σ(中国,北京)。有限合伙人在生理盐水溶解,腹腔内接种(i.p。)如前所述29日]。老鼠给4毫克/公斤剂量的有限合伙人,继续为端点分析18个小时。芹黄素(> 98纯度)是购自上海Winherb医疗科技发展有限公司(中国)和管理在50毫克/公斤体重腹腔内(i.p)。1小时后有限合伙人的挑战。药物的载体为5%二甲亚砜(DMSO)无菌生理盐水。老鼠实验协议批准山东大学动物保健和使用委员会制度,是符合中华人民共和国卫生部。老鼠牺牲深麻醉下完成后超声心动图。
2.2。心脏损伤和组织损伤标记
血浆CK和LDH水平决定使用一个自动化分析仪(Abbott建筑师,方丈公园,伊利诺斯州,美国)如前所述[11]。等离子cTnI浓度是衡量ELISA-based试验根据制造商的协议(Abnova、台湾)。血浆心肌肌凝蛋白光chain-1 (cMLC1)是由ELISA(美国生活诊断Inc .)根据制造商的协议。两人都是前面描述(28]。
2.3。超声心动图
2.4。实时聚合酶链反应
总RNA被QIAzol隔离方法和反向转录提前OneStep rt - pcr试剂盒(试剂盒)。预先设计引物都是购自试剂盒。肿瘤坏死因子- mRNA水平α(肿瘤坏死因子),il - 1β(白介素- 1β),MIP-2(巨噬细胞炎性protein-2) MCP1 (CD46) MAP1lc3 (microtubule-associated蛋白质1轻链3),VPS11(空泡的蛋白sorting-associated蛋白11),或β肌动蛋白被实时PCR检测。褶皱的变化是由相对量化方法如前所述[29日]。
2.5。免疫印迹
心脏组织中均质溶解缓冲区,和蛋白质浓度测定如前所述[29日]。核和细胞质分数被孤立如前所述29日]。PVDF膜与TNF -孵化α(1:200年,圣克鲁斯生物技术),MIP-2 (Abcam 1: 100年,中国),微管蛋白,NFκB p65抗体,anti-TFEB抗体、LAMP1 ATG5, p62,组蛋白H3(1: 200年,圣克鲁斯生物技术)在一夜之间在4°C。三个重复洗后,探讨了膜与相应HRP-conjugated二级抗体(1:2000年,大Gilbertsville)在室温下1 h。三个重复洗后,膜是由化学发光检测和暴露在x射线胶片的放射自显影法。
2.6。心脏细胞死亡标记
DNA碎片是衡量ELISA-based工具包(罗氏)如前所述29日]。PARP活动,我们使用了HT普遍比色PARP分析工具从Trevigen如前所述31日]。
2.7。心脏TUNEL染色
所有与原位TUNEL染色进行细胞死亡检测设备(罗氏应用科学)根据制造商的指示和早些时候发表的32]。
2.8。心肌谷胱甘肽水平
心肌谷胱甘肽水平组织溶解产物测定GSR-DTNB回收试验和使用在以前的出版物(33]。
2.9。心肌氧化应激标记
蛋白质硝基酪氨酸硝化决心使用OxiSelect™硝基酪氨酸酶联免疫试剂盒(细胞生物学实验室)如前所述12]。从组织溶解产物蛋白质羰基含量是由蛋白质羰基比色测定试剂盒(开曼化学)如前所述28]。
2.10。统计分析
数据表示为平均值±标准偏差(SD)和统计分析是利用GraphPad棱镜软件完成的。配对t以及或单向方差分析之后,被认为具有统计显著性图基的后续测试和执行。
3所示。结果与讨论
3.1。芹黄素变弱Endotoxin-Induced心肌细胞在小鼠的心肌损伤和细胞死亡
检查芹黄素的保护作用,我们管理4毫克/公斤的有限合伙人C57BL / 6小鼠18个小时posttreated车辆(控制)或芹黄素。LPS-induced心肌损伤明显增加LDH和CK(图1)。Aginenin治疗显著降低LPS-induced心肌损伤。细胞死亡包括凋亡细胞死亡标记被TUNEL染色(图确定2(一个))。定量细胞死亡标记DNA碎片和PARP活性测定诱导在398%和2.8倍有限合伙人,分别。两个标记、DNA碎片和PARP活性分别降低到55%和57%,分别由芹黄素治疗(图2 (b))。心肌肌钙蛋白I (cTnI)和心脏肌凝蛋白光chain-1 (cMLC1)精通标记的急性心脏疾病专门为心肌细胞死亡。cTnI和cMLC1 LPS引起的政府6.3 ng / ml和0.89 ng / ml小鼠血清从0.34 ng / ml和0.14 ng / ml在对照组,分别(图3)。芹黄素治疗显著减毒LPS-induced血清cTnI cMLC1 4.22和0.42,分别。心脏功能参数,比如左心室(LV)结构和功能被超声心动图评估。有限合伙人管理导致减少射血分数(EF)和增加舒张期左心室的内在维度(LVID),显著减毒芹黄素政府(图4)。老鼠的心率在所有四个治疗组在统计学上没有不同。芹黄素本身没有改变任何治疗心肌损伤标记物或函数在上面的实验。
(一)
(b)
多个因素被证实参与endotoxin-mediated心肌损伤和心脏功能障碍(5,34- - - - - -36]。符合之前的发现,我们的体内实验表明,有限合伙人大幅度增加血浆LDH水平,CK, cMLC1, cTnI, TUNEL染色和细胞死亡标记,DNA碎片,PARP活性。芹黄素治疗显著降低上述标记。细胞死亡在脓毒症的主要机制是细胞凋亡和坏死重叠的信号通路。在细胞凋亡,细胞收缩心肌结构和相关的损失会导致心脏功能障碍(37]。在坏死,炎症反应发生,也引起心脏功能障碍(37]。我们观察到两种类型的细胞死亡和apigenin-reduced细胞死亡和心脏功能障碍。
芹黄素的药物动力学研究表明,大鼠模型系统中可用芹黄素可以10天(38]。芹黄素可以找到人类红细胞后欧芹消费,从而增加其分布和生物利用度39]。我们也观察到,芹黄素治疗改善LPS-induced心脏功能障碍。糖尿病心肌病的一项长期研究老鼠,芹黄素政府改善心脏左心室功能(40]。芹黄素还可以改善心脏功能的恢复在孤立的老鼠心脏缺血/再灌注损伤使用Langedorff系统(23]。因此,我们的数据在apigenin-mediated恢复心肌损伤和心脏功能障碍可能导致潜在的治疗脓毒症的发展。
3.2。芹黄素抑制Endotoxin-Induced促炎细胞因子的生产,NFκB和氧化应激
促炎细胞因子的实时PCR分析表明TNF诱导-α,il - 1β,MIP-1α,MIP-2有限合伙人管理3.9,3.7,3.8,和4.1,分别。芹黄素治疗LPS-induced细胞因子基因表达降低了43%,45%,51%,48%,肿瘤坏死因子-α,il - 1β,MIP-1α分别为,MIP-2(图5(一个))。验证两个促炎细胞因子在蛋白质水平,并与mRNA水平(图一致5 (b))。免疫印迹分析表明NFκB p65在核分数增加心脏等LPS-treated老鼠和溶菌产物增加和芹黄素治疗显著降低(图6(一))。类似的分析与细胞质分数也证明了细胞质p65水平下降了内毒素和芹黄素治疗恢复正常。NFκB途径被认为是一个传统的炎性信号通路(41]。NFκB是涉及的表达促炎的来源包括细胞因子、趋化因子、黏附分子。在脓毒症,NF的规范化途径κB激活发生(42]。NF的作用κB激活抑制lipopolysaccharide-induced冲击的关键(43]。因此,抑制p65核本地化芹黄素endotoxin-induced脓毒症是有益的。
(一)
(b)
(一)
(b)
氧化应激标记蛋白质的定量测定硝基酪氨酸和蛋白质羰基的ELISA证明显著增加3.6和5.1,分别。芹黄素减毒LPS-induced蛋白质硝基酪氨酸和蛋白质羰基61%和515年,分别(图6 (b))。我们还确定氧化(GSSG)和谷胱甘肽水平降低(谷胱甘肽)形式。内毒素诱导氧化谷胱甘肽水平,减少谷胱甘肽水平降低,由芹黄素逆转治疗(图7)。
Endotoxin-induced心肌损伤与缺陷有关氧化还原平衡和抗氧化酶,导致炎症(44]。我们展示了早些时候的角色NRF2败血症和白藜芦醇的保护作用[29日]。早些时候在一致的文献,我们发现增加氧化应激标志物硝基酪氨酸和蛋白质羰基有限合伙人。LPS诱导炎性细胞因子。芹黄素治疗显著降低氧化应激和炎症反应。在脓毒症的老鼠模型,盲肠的结扎和穿刺诱发氧化应激和炎症反应在脾脏和由芹黄素(减毒45]。在另一个LPS-induced脓毒症大鼠模型,芹黄素改善炎症反应通过抑制鞘氨醇激酶1通路,称为转录因子NF的调制器κB (27]。我们还观察到在这项研究中,LPS-induced NF的核易位κB是减毒芹黄素。芹黄素抑制细胞因子的释放,抑制NFκB活动LPS-stimulated单核细胞从人类分离供体(26]。在最近的一份报告中,芹黄素减少NFκ在食源性肥胖大鼠模型[B-associated神经炎症46]。因此,我们的研究证明通过NF芹黄素作为抗氧化剂和抗炎调制器κB在endotoxin-induced心肌损伤可能有效心肌炎等其他炎症性心脏损伤模型。
3.3。芹黄素调节自噬在Endotoxin-Induced心脏损伤
在脓毒症的动物模型和临床脓毒症,心脏自噬增加(47]。自噬也有利于心脏保护在脓毒症(48]。我们通过免疫印迹分析LAMP1检测自噬,ATG5, p62(图8)。所有三个自噬在endotoxin-induced标记增加心脏损伤。芹黄素增强LAMP1和ATG5蛋白质含量而p62水平下降了芹黄素。这些发现与事实一致,芹黄素诱导自噬p62水平下降,是自噬诱导的标志除了被自噬降解ubiquitinated蛋白质与溶酶体的自噬机械(49]。免疫印迹分析核分数表明TFEB,自噬的主要调制器和相关明确的路径,增加了有限合伙人和芹黄素。芹黄素治疗与LPS显著增强核本地化(图9(一个))。了解核的功能角色易位TFEB,我们决定两个目标基因Vps11和Map1lc3实时PCR(图9 (b))。LPS诱导Vps11和Map1lc3基因表达了1.53和1.83倍,分别。芹黄素治疗基因表达增强进一步LPS-induced 2.6——2.9倍Vps11 Map1lc3,分别。
(一)
(b)
黄酮类化合物是已知的调节自噬在各种病理条件或生理过程在动物模型50- - - - - -53]。早些时候,我们已经表明TFEB-mediated自噬是调制在老化(28]。在这项研究中,我们发现芹黄素调节自噬通路在脓毒症。姜黄素、类黄酮、也为诱导自噬(目标TFEB54]。最近的文献证明黄酮类化合物的链接与TFEB和/或自噬(55- - - - - -57]。自噬还监管机构对心血管氧化还原氧化应激的体内平衡,因此相互作用,在心脏保护[apigenin-mediated自噬,炎症是至关重要的58,59]。我们观察到的保护作用TFEB及其下游目标LPS-induced心肌损伤及其调制芹黄素。在doxorubicin-induced心肌病,TFEB也是调制(60]。然而,自噬的激活已被确认为心血管在某些设置,但在其他情况下,持续的自噬已与心脏病理学(61年]。自噬因此出名的是它的功能像一把双刃剑62年,63年]。在这项研究中,自噬可能作为氧化还原内稳态,提高lysomal退化LPS-induced心肌损伤。两者都是重要的apigenin-mediated心脏保护。
apigenin-mediated endotoxin-induced心肌损伤的保护我们的研究证明了相互作用的氧化应激,炎症,和自噬。增加细胞死亡导致炎症,与氧化应激增加。这个过程是循环,从而增强了内毒素的破坏性影响。自噬和抗氧化防御也有关(64年]。自噬调节氧化还原平衡和活性氧的形成和自噬在氧化蛋白质的降解中起着重要作用[65年]。
4所示。结论
我们表明,芹黄素防止LPS-induced心脏损伤,组织损伤,心肌细胞的细胞死亡。芹黄素改善LPS-induced心脏功能障碍。Apigenin-mediated保护LPS-induced心肌毒性是由多个机制,炎症和氧化应激反应被调制芹黄素及其主调节器NFκb .除此之外,自噬途径提高了监管机构TFEB芹黄素。由于自噬增强,芹黄素LPS-induced减少炎症和氧化应激(图10)。因此,自噬的相互作用、炎症和氧化应激及其调制在心脏保护芹黄素扮演了重要的角色。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究得到了山东省科技项目(批准号2014 gsf118187)。