文摘
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是肝脏疾病的主要表现在肥胖和代谢综合征。通过比较hypertriglyceridemic转基因小鼠表达载脂蛋白(apo) CIII控制nontransgenic (NTg)的同胞,我们表明,过度apoCIII,独立的高脂肪饮食(HFD),产生NAFLD-like特性,包括肝脏脂质含量增加;抗氧化能力下降;肿瘤坏死因子表达增加α,肿瘤坏死因子α受体,裂解caspase-1, interleukin-1β;降低脂联素受体2的表达;和增加细胞死亡。这种表型是加剧和额外的非酒精性脂肪肝功能不同诱导apoCIII白鼠HFD。HFD诱导葡萄糖耐受不良一起增加糖质新生,表明肝胰岛素抵抗。此外,HFD导致显著增加血浆肿瘤坏死因子α(八)和il - 6在apoCIII老鼠(60%)。细胞死亡信号(伯灵顿/ Bcl2)效应(caspase-3)和细胞凋亡增强apoCIII老鼠无论HFD或低脂肪饮食。与饮食相关的非诺贝特治疗逆转的影响和apoCIII表达但没有正常化炎症特征甚至当肝脏脂质含量完全纠正。这些结果表明,apoCIII和/或高甘油三酯血症在肝脏炎症和细胞死亡中起着重要作用,进而增加易感性和食源性非酒精性脂肪肝的严重程度。
1。介绍
高甘油三酯血症是一种常见的条件引起的多种环境和遗传因素(1,2]。等离子体水平升高的甘油三酯(TG)丰富的遗迹脂蛋白是心血管疾病(CVD)的独立危险因素(3]。临床与实验研究表明强烈的相关性和因果联系血浆TG和载脂蛋白CIII (apoCIII)水平4,5]。对糖尿病患者血浆apoCIII水平也增加(6,7]。此外,功能丧失apoCIII基因的突变与低TG水平相关,降低心血管疾病的风险8,9]。因此,TG水平apoCIII导致心血管疾病,和apoCIII抑制剂已经在临床开发降低心血管疾病风险10]。
高甘油三酯血症和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是常见的特性在肥胖和代谢综合征(11]。非酒精性脂肪肝的患病率在西方国家从25到35%不等(12),和肝脏脂肪变性是观察到80%的患者肥胖(13]。肝胰岛素抵抗和2型糖尿病被认为是NAFLD的后遗症(14]。此外,持久的脂肪变性可能进展性脂肪肝(纳什),肝硬化和肝癌15]。
采取“两步假设法”(16)提出了解释非酒精性脂肪肝发病机制。在这个假设中,脂肪变性表示“第一次打击。“肝脏脂肪变性的脆弱性增加各种“第二次打击”,进而导致炎症、纤维化和细胞死亡。氧化应激是一个这样的第二次打击。炎性反应,包括生产大量的促炎的发病分子,也有一个关键的角色在该疾病的发生和发展17]。促炎细胞因子可以引起肝损伤直接或间接通过增加氧化应激;反过来,氧化应激可以直接或间接损害肝功能,延续一个恶性循环18]。氧化应激和炎症通路控制构成许多代谢疾病的疾病,包括肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化。因此,最近的证据表明,与非酒精性脂肪肝相关的发病率和死亡率并不局限于肝脏的变化,大部分的死亡相关的非酒精性脂肪肝患者心血管疾病(19]。
我们之前证明hypertriglyceridemic转基因老鼠overexpressing apoCIII展览增加肝glycerolipid内容和肝脏氧化应激。后者与NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶活动增加,即使老鼠食用普通低脂肪饮食(最晚完成日期)20.]。另一个最近的研究报道,apoCIII-overexpressing老鼠开发非酒精性脂肪肝与严重的肝胰岛素抵抗,增加肝脏脂质吸收和减少食用高脂肪饮食后脂质分泌(HFD) [21]。
本研究旨在调查apoCIII是否过度和/或由此产生的高甘油三酯血症引发脂肪变性的主要事件驱动演化纳什,即炎症和细胞死亡。此外,我们测试是否PPARa受体激动剂非诺贝特,调节许多基因与炎症和脂质代谢有关,包括apoCIII,能减少对非酒精性脂肪肝。
2。材料和方法
2.1。动物和治疗
所有实验协议批准了这项研究在动物实验伦理委员会大学(CEUA /由协议号码2436),和研究进行了符合公共卫生服务策略。雄性小鼠转基因对人类apoCIII nontransgenic控制和维护部门的生理学和生物物理学,生物学研究所的坎皮纳斯州立大学(巴西圣保罗)。人类apoCIII创始人转基因小鼠(第3707行)(22)捐赠了阿兰·r·高博士(哥伦比亚大学,纽约,纽约),1996年以来一直与野生型杂交(NTg) C57BL / 6小鼠(多学科生物研究中心的坎皮纳斯大学的)。apoCIII转基因老鼠筛选根据他们禁食TG等离子体水平(apoCIII老鼠> 300毫克/分升;控制老鼠< 100 mg / dL),住在一个房间22°C±2°C和12小时光暗周期与免费的水和食物。该部雄性老鼠(转基因和NTg同窝出生的)最晚完成日期或喂食HFD直到4个月大的时候。额外的组老鼠喂食HFD服用非诺贝特(100毫克/公斤体重,爱力根、SP、巴西、可溶性阿拉伯树胶)5%或5%的阿拉伯树胶(控制治疗组)在过去两周HFD消费的日常填喂法。在4个月大的时候,禁食小鼠经腹腔麻醉(IP)注射氯胺酮和甲苯噻嗪(50和10毫克/公斤)和安乐死通过retro-orbital放血丛(见表1)。
2.2。生化分析
血浆总胆固醇、甘油三酯(Chod-Pap;罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国),nonesterified脂肪酸(Wako化学,诺伊斯,德国)和肝脏转氨酶(Biotecnica、SP、巴西)化验使用enzymatic-colorimetric方法根据制造商的指示。瘦素、脂联素(默克密理博,达姆施塔特,德国)、c反应蛋白(美国明尼阿波利斯IBL-America)、肿瘤坏死因子α,il - 1β(研发系统,明尼阿波利斯,美国)血浆浓度测定用ELISA。il - 1的分析β在肝组织中表达,50毫克组织样本中均质2毫升裂解缓冲2(研发系统,明尼阿波利斯,美国)。使用多路检测il - 6等离子体水平进行了分析(默克密理博,达姆施塔特,德国)。肝脏蛋白质羰基含量测定用比色测定试剂盒(美国密歇根州开曼化学公司)。
2.3。水平的降低,氧化谷胱甘肽在肝脏和血浆
肝脏(50毫克)和等离子体(50μL)的水平减少谷胱甘肽(GSH)和氧化谷胱甘肽(GSSG)化验分别根据荧光orthophthalaldehyde Hissin报告的(选择)方法和自己23]。这种方法是基于事实,选择与谷胱甘肽和GSSG反应酸度8.0和12日分别产生一个高度可以激活荧光产品在350 nm 420海里的一个发射峰。GSSG水平测定与N-ethylmaleimide样品处理,确保完整切除后谷胱甘肽。谷胱甘肽的浓度和GSSG样本计算根据标准曲线分别与谷胱甘肽和GSSG做好准备。
2.4。肝脏甘油三酯含量
肝脏脂质提取使用Folch [24)方法。脂质提取在特里同resuspended缓冲区(20毫升0.5磷酸钾,pH值7.4,0.25 M氯化钠,25毫米胆酸,0.5% Triton®x - 100),和TG水平测定使用enzymatic-colorimetric方法根据制造商的指示(Chod-Pap;罗氏诊断GmbH德国曼海姆)。
2.5。肝脏组织学分析
肝组织样本取自左叶和孵化磷酸盐10%甲醛在室温下过夜。样本然后洗3次磷酸盐(PBS)和固定在70%乙醇。固定后,嵌入到石蜡组织,切片的厚度5μm和沾hematoxylin-eosin(他)。
2.6。油红O染色
肝脏样本在4%甲醛固定,用PBS,嵌入在10月Tissue-Tek嵌入化合物,和冷冻。冻结的部分(10μm厚)水化,中性脂质积累被油红O染色法检测。然后,部分与60%异丙醇冲洗和18分钟准备油红O染色溶液(0.5%在异丙醇与蒸馏水稀释到60%和过滤)。幻灯片是在60%的异丙醇,蒸馏水洗两次。数字图像是用一个奥林巴斯BX51显微镜连接到一个奥林巴斯DP72数码相机。
2.7。免疫荧光显微镜
肝脏部分固定在4%多聚甲醛在室温下在PBS为30分钟,然后用PBS。非特异性结合被孵化5%牛血清白蛋白(BSA)在PBS 1 h。与主要抗体特定部分被孵化TNFR1(1: 50,圣克鲁斯生物技术)或摘要意思β(1:100年,细胞信号)在一夜之间(4°C),其次是孵化主要抗体CD68(1: 250年,Serotec) 3 h(室温)。接下来,组织部分和Alexa孵化Fluor-labeled二级抗体(表达载体)1 h(室温)。在徕卡DMI600B显微镜拍摄照片,与地区随机领域每节/鼠标(1)使用ImageJ软件进行了分析。
2.8。分析细胞凋亡
细胞凋亡分析通过末端转移酶的dUTP尼克原位末端标记(TUNEL)方法使用一个细胞检测设备(罗氏诊断)。细胞核被贴上4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;西格玛奥德里奇)。只有TUNEL-positive细胞与DAPI-stained核被认为是凋亡和计算。每节随机领域(5)10μm是计算每个鼠标。
2.9。口服葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验
口服葡萄糖耐量试验(OGTT),禁食12小时后,老鼠接受口服剂量的葡萄糖溶液(1.5克/公斤体重)。基底收集血液样本的尾巴尖前(30分钟)和15日,60岁,90分钟后葡萄糖摄取。胰岛素耐量试验(ITT),小鼠禁食三3小时,并立即收集血液样本在IP胰岛素注射(0.75 U /公斤体重的普通人类胰岛素(礼来制药厂有限公司),在5、10、15、30、60分钟后注入葡萄糖分析。血糖浓度测量使用葡萄糖分析器(Accu-Chek优势,罗氏诊断、瑞士)。
2.10。Pyruvate-Derived葡萄糖生产测试
禁食16小时后,老鼠注入丙酮酸溶液(1.5克/公斤体重)。收集血液样本的尾巴尖前(30分钟)和15日,60岁,90分钟后注入。血糖浓度测量使用葡萄糖分析器(Accu-Chek优势,罗氏诊断、瑞士)。
2.11。分析肝脏低密度Lipoprotein-Triglyceride分泌
禁食12小时后,基底收集血液样本从老鼠通过尾巴尖(分钟)。然后,老鼠收到IP注入Triton WR 1339(500毫克/公斤盐溶液;σ)抑制脂蛋白脂肪酶活性以及TG水解和间隙。额外的血液样本收集Triton注射后在120和150分钟。进行分析的低密度脂蛋白(VLDL) TG分泌,等离子体TG水平决定使用一个enzymatic-colorimetric试验根据制造商的指示(Chod-Pap;罗氏诊断GmbH德国曼海姆)。
2.12。RNA提取和实时逆转录聚合酶链反应
肝脏总RNA提取从大约50毫克的组织使用试剂盒试剂(美国纽约表达载体,大岛)。RNA完整性评估使用Tris-borate 1.2%琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色。RNA数量和纯度测定通过光密度在260和280海里度数(基因定量,Amersham-Pharmacia生物技术)。基因组DNA污染排除通过运行聚合酶链反应(PCR)的RNA样品。2的互补脱氧核糖核酸准备一式两份μ克总RNA通过逆转录使用一个应用生物系统公司高容量cDNA逆转录装备根据制造商的指示。基因表达是决定使用实时逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)(第一步实时PCR系统,应用生物系统公司,促进城市、钙、美国)与SYBRGreen PCR大师混合和特定的引物。ΔΔCT方法被用来量化基因表达。阈值周期被规范化β肌动蛋白,然后表示相对于对照组(见表2)。
2.13。西方墨点法
肝组织样本在尿素均相裂解缓冲(2 M硫脲,5毫米EDTA,氟化钠1毫米,1毫米原钒酸钠、焦磷酸钠1毫米,1%抑肽酶、2毫米PMSF和1% Triton-X 100),和蛋白质浓度测定用布拉德福德(25)方法。Forty-microgram样品蛋白质的溶解产物决定SDS-polyacrylamide凝胶,转移到硝化纤维膜和沾染了朱红色年代(σ)来验证传输效率和公平的示例加载。膜被封锁的5%白蛋白Tris-HCl pH值7.6中包含150毫米氯化钠和0.1% Tween-20 (TBST)和孵化2小时在室温下与抗体caspase-1(1: 500年,Abcam) caspase-3(1: 100年,圣克鲁斯生物技术)、Bcl2(1: 1000年,细胞信号),或伯灵顿(1:1000年,细胞信号)。抗体对微管蛋白作为内部控制(σ1:20000)。然后,膜与TBST洗,孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体稀释1:1000年,再次清洗。反应是使用一个增强化学发光检测系统开发(皮尔斯ECL免疫印迹基质,热科学、罗克福德,美国)。使用ImageQuant LAS 400迷你设备捕获图像,通过光学测密度术和带强度量化使用ImageJ软件。
2.14。统计分析
结果给出了平均值±标准错误决定的数量()表示。统计分析了使用双向方差分析Bonferroni调整紧随其后。被定义为统计意义。
3所示。结果
3.1。ApoCIII过度增加食源性肥胖
Hypertriglyceridemic apoCIII-overexpressing老鼠相比,控制nontransgenic (NTg)同窝出生后最晚完成日期或消费HFD。形态学和血浆生化参数评估(表3)。HFD每日卡路里的摄入量,增加体重,和白色perigonadal脂肪组织质量,但在两组相对肝脏质量下降。apoCIII白鼠HFD显示更大的肥胖伴有血浆瘦素水平增加。正如预期的那样,有一个genotype-dependent但diet-independent hyperlipidemic apoCIII小鼠表型,如图所示,等离子体的TG水平升高,胆固醇和游离脂肪酸(表3)。
接下来,我们评估了几个指标与非酒精性脂肪肝的自然历史,包括脂质积累,氧化还原平衡,炎症和细胞死亡。
3.2。过度的ApoCIII促进肝脂肪变性和肝功能异常
超表达apoCIII导致肝脏脂质含量增加独立的饮食类型。这是观察到的微小脂肪在组织学分析使用他(图执行1(一)),油红O染色(图1 (b)),增加肝脏TG含量(38%最小的致命剂量组和HFD集团)的28%(图1 (c))。证实肝损伤的存在,apoCIII老鼠增加等离子体的肝转氨酶水平下的ALT AST下饮食和HFD(数据1 (d)和1 (e))。
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3.3。过度的ApoCIII促进葡萄糖耐受不良和HFD增加肝葡萄糖生产后消费
干扰葡萄糖代谢与肝脏脂肪变性;因此,我们下一步评价葡萄糖在老鼠体内平衡。如图2两组,HFD消费诱导葡萄糖耐受不良,虽然HFD的效果是在apoCIII老鼠(图更有效2(一个)),这表明血糖曲线下的面积增加了12%相比NTg组。ITT结果显示没有饮食或基因型效应(数据未显示)。然而,在确定pyruvate-derived肝葡萄糖生产速率(图2 (b)),我们表明,HFD-fed apoCIII小鼠糖质新生能力的提高。这些小鼠葡萄糖耐受不良一起展出,这些结果表明,肝胰岛素抵抗存在于HFD apoCIII白鼠。
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3.4。影响ApoCIII过度和HFD消耗细胞内脂质代谢相关基因表达和肝脏VLDL-TG分泌
识别过程驱动观察肝脏脂质含量的增加,我们分析了脂质吸收相关基因的表达,合成、分解代谢和分泌(数字3和4)。我们观察到mRNA CD36的表达,它负责脂质吸收,没有明显调制通过饮食或基因型(图3)。相比之下,mRNA的表达ChREBP(碳水化合物反应元件结合蛋白),一个转录因子参与脂肪生成和激活葡萄糖,只增加了肝脏的HFD-fed apoCIII老鼠。HFD也增加的mRNA水平SREBP1c(甾醇反应元件结合蛋白)和它的一个目标,ACC(乙酰辅酶a羧化酶),独立的基因型。表达stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD-1)明显降低HFD(图3 (f))。
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基因的表达水平与脂质分解代谢和分泌图所示4。ATGL的mRNA水平(脂肪组织甘油三酯脂肪酶),负责最初的TG水解,降低了HFD消费无关的基因型。CPT1水平(肉毒碱棕榈酰酰基转移酶)和UCP2(线粒体解偶联protein-2),既加速脂肪酸氧化,减少在LFD-fed apoCIII老鼠和HFD组。PGC1α(PPARγcoactivator-1α和线粒体生物起源的诱导物)由两组HFD水平相对较低。VLDL大会后续TG分泌是一个复杂的过程,涉及脂质与飞机观测协会,由MTP(微粒体甘油三酸酯转运蛋白)。我们观察到mRNA的减少大量的MTP HFD下两组,而飞机观测mRNA在apoCIII减少小鼠两种饮食。总之,HFD基因型(独立)诱导lipogenesis-related基因的表达(SREBP1c和ACC)和减少分解代谢,secretion-related基因的表达(SCD1、ATGL PGC1α,MTP),而apoCIII超表达(在最晚完成日期)的表达显著降低CPT1, UCP2和apoB100基因。
测量实际肝脏TG分泌率在上述实验条件下,我们直接进行功能分析,如图5。结果表明,肝VLDL-TG分泌率增加apoCIII-overexpressing老鼠不管的饮食和HFD VLDL-TG分泌减少利率apoCIII和NTg老鼠。
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3.5。超表达ApoCIII增加的比率减少肝脏中谷胱甘肽氧化
食源性非酒精性脂肪肝与细胞氧化应激有关。因为谷胱甘肽是一种最丰富的还原能力用于保持细胞氧化还原体内平衡,我们测量肝脏谷胱甘肽的水平。如图6,过度apoCIII肝脏GSSG /谷胱甘肽比增加,饮食类型的独立,虽然HFD加剧了这一效应。蛋白质羰基化反应、蛋白质氧化损伤的指标,增加了基因型的HFD独立。
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3.6。ApoCIII过度引起的肝脏炎症
炎症是一种非酒精性脂肪肝的发病机制中的关键事件。因此,我们测量一组小鼠系统性和肝脏炎性标志物。增加血浆细胞因子白细胞介素6的水平同时呈现在HFD团体,尽管增加观察apoCIII大老鼠。另一个炎症标志物c反应蛋白,是apoCIII显著增加小鼠,独立的饮食类型(表3)。血浆脂联素水平,抗炎介质,减少了HFD两基因型组(图7(一))。肝脏脂联素受体2的水平也减少了HFD apoCIII老鼠,独立于饮食类型(图7 (b))。因此,脂联素信号似乎阻碍HFD消费和apoCIII超表达。
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血浆TNF的HFD诱导高程α水平,并且这种效应更加明显在apoCIII老鼠(图7 (c))。此外,肝脏肿瘤坏死因子αapoCIII老鼠mRNA水平增加,独立于饮食类型(图7 (d))。免疫组织化学分析证实了这些调查结果,显示增加巨噬细胞标记CD68的表达式和colocalization巨噬细胞与细胞表面的肿瘤坏死因子α受体肝脏的apoCIII老鼠,独立的饮食类型(数据7 (e)和7 (f))。
非酒精性脂肪肝的inflammasome途径似乎被激活。这个途径的激活涉及蛋白质的形成和活化multicomplex包含cysteine-aspartate protease-1 (caspase-1)。激活caspase-1反过来激活并导致随后的分泌摘要意思β。不同于最晚完成日期,HFD增加激活的水平(裂解)caspase-1虽然apoCIII老鼠表现出增加激活caspase-1水平无论饮食(图8(一个))。摘要意思的观察同样的模式β:HFD增加肝脏摘要意思β水平在两组,但apoCIII小鼠更高的摘要意思β独立于饮食(图的水平8 (b))。在等离子体中,我们观察到,只有HFD摘要意思的影响β水平(图8 (c))。免疫组织化学分析显示摘要意思β与巨噬细胞与apoCIII小鼠的肝脏,独立的饮食类型(数据8 (d)和8 (e))。
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3.7。ApoCIII过度诱导肝细胞凋亡
细胞凋亡是出席一个更高级的阶段的疾病(肝病,纳什),其中包括内在和外在的细胞死亡通路。如图9(一个),apoCIII老鼠表现出内在的细胞凋亡信号通路的激活,通过减少Bcl2 /伯灵顿比率。HFD也减少NTg组中这个比例。确定细胞死亡的发生,我们测量的水平caspase-3,最后死亡效应,计算使用TUNEL检测凋亡细胞。细胞死亡中更加突出apoCIII老鼠(独立于饮食),进一步增加了HFD就是明证活动(裂解)caspase-3的高水平和高数量的TUNEL-positive凋亡细胞(数字9 (b),9 (c),9 (d))。
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3.8。Fibrate治疗解决ApoCIII-Induced胞内脂质积累而不是炎症
我们下一个调查纳什是否可以逆转到相同的程度在不同组的老鼠。为此,老鼠接受非诺贝特在过去2周HFD消费。通过激活PPARα这种药物调节许多基因的表达,调节脂质代谢,主要是通过减少合成和分解代谢增加。一类也被认为是减少apoCIII表达式。如表所示4非诺贝特治疗减少体重,脂肪组织重量,HFD组织和血浆瘦素水平。等离子体TG、胆固醇和FFA水平不受非诺贝特治疗和保持高的apoCIII老鼠。非诺贝特没有改变PPARαmRNA的表达,但它降低了FAS mRNA表达和提高配电网,CPT1, UCP2 mRNA表达HFD组(表5)。非诺贝特也显著减少肝脏TG含量。此外,非诺贝特减少血浆肝转氨酶AST和ALT水平,尽管AST水平仍然高企apoCIII老鼠(表5)。
非诺贝特治疗也有效地衰减氧化应激和炎症(表5)。GSSG /谷胱甘肽比和羰基含量都减少了非诺贝特,尽管后者apoCIII老鼠仍然高企。此外,血浆肿瘤坏死因子α水平相对较低的药物治疗,但仍高apoCIII老鼠。血浆脂联素水平并没有因为非诺贝特而改变,而肝脏脂联素受体2的水平显著增加只有在NTg老鼠。非诺贝特也降低了血浆白细胞介素6的水平,但不是c反应蛋白(表5)。
水平的裂解caspase-1(图10 ())在肝脏以及血浆和肝脏的摘要意思水平β(表5)被非诺贝特治疗减少。然而,肝脏摘要意思β水平(图10 (b))保持升高apoCIII老鼠独立的治疗。非诺贝特还增加了Bcl2 /伯灵顿比率(图10 (c))和激活caspase-3水平降低NTg和apoCIII老鼠参与同行相比。证实了这些结果,减少TUNEL-positive细胞的数量在fenofibrate-treated组(数字10 (d)和10 (e))。
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4所示。讨论
在目前的研究中,我们表明,apoCIII导致非酒精性脂肪肝的过度表达,与饮食无关。非酒精性脂肪肝的发展特点是肝脏TG含量增加,氧化应激,炎症和细胞死亡。病情加重和额外的非酒精性脂肪肝的特性被诱导,如葡萄糖耐量和肝胰岛素抵抗,HFD apoCIII老鼠食用。此外,炎症指标和凋亡细胞数量在HFD-fed增强apoCIII老鼠。正如所料,非诺贝特治疗逆转与HFD相关的几个影响消费和apoCIII超表达。然而,重要的是要强调,非诺贝特没有正常化apoCIII-induced炎症特征,如增加血浆肿瘤坏死因子α水平和增强肝脏TNFr和摘要意思β的水平。这些发现表明,持续的高甘油三酯血症可能比细胞内脂质积聚与肝脏炎症有关。
先前的研究表明,等离子体apoCIII浓度增加使老鼠食源性非酒精性脂肪肝(21]。这些作者集中在胰岛素抵抗中观察到当美联储HFD这只老鼠模型。严重肝胰岛素抵抗是使用hyperinsulinemic-euglycemic夹技术和特征是归因于增加肝甘油二酯含量和蛋白激酶C-epsilon Akt2的激活和降低胰岛素激活(21]。这里,我们证实HFD消费诱发胰岛素抵抗更严重比NTg apoCIII老鼠老鼠,如图所示的同时葡萄糖耐受不良,增加糖质新生发达前组。我们也证实了我们组最近的发现,apoCIII过度加剧食源性肥胖(26]。我们曾表明apoCIII老鼠表现出正常的葡萄糖体内平衡和胰岛素分泌在正常饮食的情况下,这些参数被打扰后引起的急性增加血浆FFA水平肝素(27)或HFD消费(28]。
我们发现apoCIII过度增加VLDL-TG分泌不管饮食类型。然而,这种分泌增强不足以避免肝脏的脂质积累的apoCIII老鼠。减少脂质分解代谢相关基因的表达(CPT1和UCP2)观察apoCIII老鼠,这或许可以解释,至少在某种程度上,他们的高净肝脏脂质积累。HFD VLDL-TG分泌减少利率apoCIII和NTg老鼠,这解释了脂质积累的发作观察这饮食的老鼠。李等人。21]报道增加FFA和TG肝脏吸收apoCIII老鼠无论饮食类型。别人已经发现,从血浆FFA吸收增加在肝脏和骨骼肌减少脂肪组织在肥胖受试者与非酒精性脂肪肝相比,肥胖受试者正常肝内甘油三酯含量(29日]。尽管我们没有发现差异之间的脂肪/ CD36 mRNA表达apoCIII NTg老鼠,很可能FFA apoCIII老鼠都在饮食中摄取增加由于TG、FFA更大的可用性这些老鼠的等离子体。有趣的是,我们发现HFD apoCIII诱导ChREBP mRNA的表达特别的老鼠。肝脂肪从头合成是通过激活规范的SREBP-1c [30.]和ChREBP [31日),几乎所有基因转录激活参与这个过程。因此,脂肪生成也可能导致肝脏脂肪变性apoCIII老鼠。除了总TG含量增加,在先前的研究中,我们比较了肝脏lipidomes apoCIII和NTg常规饮食的老鼠。我们展示了更高的油酸在磷脂酰胆碱和TGs,较高含量的phosphatidylinositol-containing花生四烯酸,和不同的整体apoCIII老鼠的肝脏FFA的概要文件,显示高油酸的相对丰度(18:1),9 -十六碳烯(16:1),花生四烯酸(20:4),十七(17:0),硬脂酸(18:0)(32]。人们普遍认为,在自然的肝脏疾病,脂质积累,要么从饮食或脂肪从头合成,是触发事件(两面夹攻的第一冲击假说)导致lipotoxicity在肝细胞(16,33]。在肝细胞中,过多的脂质存储可能直接导致器官衰竭,包括线粒体功能障碍和内质网压力和可能在肝胰岛素抵抗中发挥作用34]。我们之前检查肝氧化地位apoCIII常规饮食的老鼠。就是我们发现细胞氧化还原平衡,增加总蛋白质羰基化作用和丙二醛水平和升高GSSG /肝脏中谷胱甘肽比例的apoCIII老鼠相比,NTg老鼠(20.]。此外,我们发现,这种氧化应激的起源与更高的活动相关的两种氧化酶类,NADPH氧化酶,实际上和黄嘌呤氧化酶,而线粒体产生低量的H2O2由于轻微的解偶联适应由ATP-sensitive钾离子通道的开放20.,35]。这里,我们证实apoCIII老鼠的肝脏谷胱甘肽水平较低,无论饮食类型,而消费的HFD诱导的肝脏蛋白质羰基化apoCIII和NTg老鼠。
最近的研究表明,炎症是一个关键过程为非酒精性脂肪肝的发生和发展。例如,caspase-1基因的敲除,街区inflammasome通路,足以保护小鼠免受食源性纳什(36]。因此,缺乏白介素1α或1βcaspase-1(目标)抑制肝脂肪变性的进化性脂肪肝和肝纤维化37]。此外,肿瘤坏死因子的双重淘汰赛α受体1和2能保护小鼠免受肝脏脂质积累和其他特性的非酒精性脂肪肝引起的蛋氨酸/ choline-deficient饮食消费(38),而anti-TNFα抗体治疗是减少脂质含量和物信号通路在HFD-fed ob / ob老鼠(39]。黄等。40证明高脂肪或高蔗糖食源性脂肪变性是可预防的枯氏细胞的肝是耗尽时,和中和抗体对肿瘤坏死因子α减弱枯氏cell-induced改变肝细胞脂质代谢。我们的结果支持在非酒精性脂肪肝炎症的中心作用。在目前的研究中,apoCIII老鼠最晚完成日期表现出广泛的肝脏炎症,包括肿瘤坏死因子的激活α、inflammasome和脂联素途径。炎症持续fibrate治疗后,细胞内脂质积累解决但没有正确的促炎效应物(肿瘤坏死因子的水平α,肿瘤坏死因子α受体,摘要意思β和低adiponectin-R2)。
这里有多种促炎状态的起源这个模型。应该注意的是,没有一个炎症标记物/效应器,测量在这个组织的具体工作。他们可以通过激活当地生产在肝脏枯氏细胞,但也来自激活循环免疫和血管细胞和脂肪组织,特别是扩大内脏脂肪,这是许多细胞因子的重要来源。轻度至中度高甘油三酯血症在健康的年轻男性与浓度增加有关的几个生化标记物的炎症和内皮细胞激活和功能障碍41]。这hypertriglyceridemia-associated系统性炎症可以扭转政府不同程度的一类,白藜芦醇或ω- 3脂肪酸42- - - - - -44]。然而,独立的甘油三酸酯水平,apoCIII炎症和细胞毒性的影响45]。例如,净化人类apoCIII提高附件monocyte-like细胞的人类隐静脉或冠状动脉内皮细胞在静态和层流剪切应力条件下通过诱导VCAM-1 [46]。除了炎症,循环apoCIII水平升高可能导致胰腺β-细胞凋亡和糖尿病(47- - - - - -49),虽然这是有争议的50]。支持发现apoCIII proapoptotic,我们最近证明apoCIII-overexpressing脾脏单核细胞呈现较高的体外细胞凋亡,apoCIII老鼠血液循环淋巴细胞数量减少。此外,细胞色素c的释放到胞质和caspase-8活动都增加apoCIII-overexpressing单核细胞,表明细胞死亡信号的上游开始但这涉及细胞器(线粒体51]。在这里,我们表明,apoCIII小鼠肝脏中展示出明显的凋亡细胞数量的增加在低脂(2倍)和高脂肪饮食(5倍)。
总之,我们的研究结果表明,除了过度肝脂质积累和胰岛素抵抗,apoCIII overexpression-induced高甘油三酯血症与肝脏炎症和细胞死亡有关,这些都会增加易感性和食源性脂肪肝的严重程度。
缩写
| ACC: | 乙酰辅酶a羧化酶 |
| 华: | 乙酰辅酶a氧化酶 |
| AdipoQr2: | 脂联素受体2 |
| ALT: | 丙氨酸转氨酶 |
| Apo B: | 载脂蛋白B |
| Apo CIII: | 载脂蛋白CIII |
| AST: | 天冬氨酸转氨酶 |
| ATGL: | 脂肪组织甘油三酯脂肪酶 |
| 伯灵顿: | Bcl2-associated X蛋白 |
| Bcl2: | b细胞淋巴瘤2 |
| CD68: | 68年集群的区别 |
| ChREBP: | 碳水化合物反应元件结合蛋白 |
| CPT1: | 肉毒碱棕榈酰酰基转移酶1 |
| 心血管疾病: | 心血管疾病 |
| DAPI: | Diamidino-2-phenylindole |
| FAS: | 脂肪酸合酶 |
| FFA: | 游离脂肪酸 |
| 谷胱甘肽: | 减少谷胱甘肽 |
| GSSG: | 氧化谷胱甘肽 |
| HFD: | 高脂肪饮食 |
| il - 1β: | Interleukin-1β |
| il - 6: | 白细胞介素- 6 |
| ITT公司: | 胰岛素耐量试验 |
| 最晚完成日期: | 低脂肪饮食 |
| MTP: | 微粒体甘油三酸酯转运蛋白 |
| NADPH: | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 |
| 非酒精性脂肪肝: | 非酒精性脂肪肝病 |
| 纳什: | 非酒精性脂肪肝炎 |
| NTg: | Nontransgenic |
| OGTT: | 口服葡萄糖耐量试验 |
| PBS: | 磷酸盐 |
| PGC1α: | PPARγ共激活剂1α |
| PPARα: | 过氧物酶体proliferator-activated受体α |
| rt - pcr: | 实时聚合酶链反应 |
| SCD1: | Stearoyl-CoA desaturase-1 |
| SREBP1c: | 甾醇反应元件结合蛋白 |
| TG: | 甘油三酸酯 |
| TNFr1: | 肿瘤坏死因子受体1 |
| 肿瘤坏死因子α: | 肿瘤坏死因子 |
| TUNEL: | Deoxynucleotidyl-mediated脱氧尿苷三磷酸结束标签 |
| UCP2: | 线粒体解偶联protein-2 |
| VCAM-1: | 血管细胞粘附分子1 |
| VLDL: | 非常低密度脂蛋白。 |
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
选择(a . Paiva和海伦娜·Raposo同样这项工作。
确认
这项工作是支持由Fundacao德帕罗尽管做Estado de圣保罗(FAPESP 2011/50400-0号必须占州政府和2013/07607-8)和慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)。a . a . Paiva被斗篷奖学金支持(Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比),和h f . Raposo a·c·b·a . Wanchel和t·r·Nardelli FAPESP奖学金必须占州政府支持的。作者特别感谢提供的技术援助朱莉安娜c Rovani Nilton da Cunha。这手稿进行了英文编辑的美国杂志》专家编辑服务。