文摘

虽然nucleotide-binding寡聚化域——(点头)像受体pyrin域包含3 (NLRP3) inflammasome最近发现的心脏,它的作用在心肌缺血/再灌注(IR)仍然是有争议的。在这里,我们调查是否药理调制NLRP3 inflammasome施加在一个保护作用体外红外损伤模型。孤立的心从雄性Wistar鼠(5 - 6个月)进行局部缺血(30分钟),其次是再灌注(20 - 60分钟)最近与没有预处理形成NLRP3 inflammasome抑制剂INF4E (50μ米,缺血前20分钟)。INF4E施加保护心肌红外显示显著减少梗塞大小和乳酸脱氢酶释放和改善缺血后左心室压力。的形成NLRP3 inflammasome复杂被INF4E心肌IR和衰减时间的方式。有趣的是,的心INF4E-pretreated动物显示显著改善防护风险途径,这种效应的表达增加有关线粒体氧化磷酸化的标志。我们的研究结果首次证明INF4E防止IR-induced心肌损伤和功能障碍,通过机制包括抑制NLRP3 inflammasome,导致prosurvival风险通路的激活和改善线粒体功能。

1。介绍

缺血性心脏病是疾病和死亡的主要原因之一(1,2]。短暂心肌缺血的主要结果是左心室收缩功能的逐步下降,经常平行由线粒体能量代谢障碍(3,4]。在再灌注阶段突然线粒体氧过载诱导氧化应激,进一步加剧了代谢紊乱(4),因此矛盾加剧心肌损伤和诱导pyroptosis [2,5]。Pyroptosis caspase-1-dependent过程导致细胞溶菌作用,已被证明是强烈受multiprotein平台复杂nucleotide-binding寡聚化域——(点头)像受体pyrin域包含3 (NLRP3) inflammasome。NLRP3的NLRP3 inflammasome包含(a)、(b)一个凋亡speck-like蛋白质含有半胱天冬酶激活招聘领域(ASC)和(c) procaspase-1。为了应对各种危险信号,包括氧自由基,K⁺流出,或线粒体应激(6- - - - - -8),NLRP3新兵适配器蛋白质ASC进而与procaspase-1交互。procaspase-1 Inflammasome寡聚化促进催化活化和处理prointerleukin - (IL) 1β(2]。最近,一个新的蛋白质已被确认为成员的NLRP3 inflammasome复杂,Gasdermin D (GSDMD),与动力学招募所需类似caspase-1激活。GSDMD的蛋白水解乳沟caspase-1分离其氨基端片段,这有助于调解il - 1β分泌和pyroptosis9]。因为NLRP3检测在许多心脏细胞类型,包括cardiofibroblasts(心中最重要的细胞类型的细胞的数量)和心肌细胞最重要的细胞类型的细胞(卷),很可能它可能发挥关键作用在急性心肌梗死(10,11]。事实上,我们和其他人表明NLRP3调节缺血/再灌注(IR)损伤和心肌激活是加剧了代谢紊乱12,13]。有趣的是,遗传调制NLRP3报道减少心肌梗塞大小在红外(13]。然而,最近的一项研究没有找到任何的角色NLRP3决定心肌红外损伤(14),另一个调查支持心血管效应由于NLRP3 inflammasome激活,因此强调解释NLRP3 inflammasome作用心肌红外受伤还远不清楚。然而,相声NLRP3与线粒体之间,红外光谱的主要球员受伤,已被描述,NLRP3能够感觉的存在产生的活性氧簇(ROS)正常或不正常的线粒体(15]。因此,本研究旨在调查新合成的影响NLRP3 inflammasome抑制剂,名叫INF4E [16),在一个体外模型心肌红外受伤。深化我们的调查评估的能力,大鼠心脏,(我)干扰IR-induced NLRP3 inflammasome激活和pyroptotic级联(2)改善线粒体代谢反应红外侮辱。

2。材料和方法

2.1。INF4E准备

INF4E溶解在200毫米在DMSO浓度。股票的解决方案的最终浓度被稀释50µ在灌注缓冲区(见下文)。合成的描述中包含的特异性抑制剂(网上的补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/5271251根据以前的出版物(),16,17]。

2.2。动物协议和体外缺血/再灌注(IR)损伤

雄性Wistar鼠(哈伦实验室,乌迪内,意大利)5 - 6个月大的时候,体重达到450 - 550克,是关心符合欧盟指令2010/63 /欧盟的保护动物用于科学目的。动物协议是在这项研究中被批准的当地“动物使用和保健委员会。“经过一个星期的检疫,饮料和食物随意,老鼠麻醉和杀害。心被迅速灌注。保持恒流来获得一个典型的冠状动脉灌注压约80毫米汞柱与Krebs-Henseleit Langendorff技术包含(mm)氯化钠118碳酸氢盐缓冲,NaHCO₃25日,4.7氯化钾,KH₂阿宝₄1.2,MgSO₄1.2,CaCl₂1.25,和葡萄糖11。缓冲区被毒气毒死O为95%₂:5%的公司₂。灌注系统的温度保持在37°C。人心稳定进行了30分钟,然后受到全球流体的30分钟,性常温缺血紧随其后的是一段20到60分钟的再灌注。心从子群的老鼠(红外+ INF4E)是使用50μM INF4E灌流液的前20分钟缺血(前10分钟后稳定)。心从虚假的动物暴露在60分钟只灌注,在免疫印迹分析作为参照组。

心中电踱步在280 - 300 bpm和保存在一个温控室(37°C)。停止了踱步的缺血和再灌注的第三分钟后重新启动。左心室(LVP)和冠状动脉灌注压(CPP)记录和监控两个电子压强计放置在左心室和灌注的思路,分别。冠状流、CPP和LVP被用作制备条件的指标。此外,舒张期LVP结束时记录为挛缩发展指数I / R和发达心室压力指数的收缩活动在整个实验过程中使用PowerLab使用图表数据采集系统和分析软件(ADInstruments,牛津大学,英国)。

心脏灌流液流出收集测量乳酸脱氢酶(LDH)释放的前5分钟缺血和整个再灌注期。评估冠状动脉流量实验制备的条件是由灌流液的数量以一个特定的时期。心被切成两部分由日冕部分(垂直于长轴)。顶端部分(少于1/3的心室质量)是用于分子分析,因此,在液氮快速冻结和储存在−80°C。梗塞大小评估使用的基底部分是由心室。

2.3。梗塞大小的测量

梗塞质量评估结束时再灌注与nitro-blue-tetrazolium(电视台)技术通过使用重量法(18]。心室基底的部分是由横向切割部分成两/三片,是孵化20分钟解决方案的电视台在磷酸盐缓冲剂(0.1%)。两个独立的和盲目的观察家们仔细分离,然后加权染色和清白的组织。总质量的坏死然后计算心室质量的百分数表示。既然缺血是全球性的,我们只分析了心室的基底部分坏死的质量表示为一个百分比的分析缺血性组织。

2.4。LDH测定

光谱分析在340海里进行灌注废水收集测量LDH释放心脏。

2.5。准备组织提取

总蛋白提取获得10% (w / v)的顶端匀浆里帕缓冲区(0.5%诺乃清洁剂p 40, 0.5%钠脱氧胆酸盐,0.1% SDS, 10 l更易与EDTA和蛋白酶抑制剂)如前所述[19]。由布拉德福德测定蛋白质浓度的测定(美国BioRad大力神,CA)然后样本存储在−80°C进行后续分析。

2.6。测定il - 1β在心脏匀浆

商用酶联免疫试剂盒(研发系统,阿宾顿,英国)是用来测量il - 1的含量β在组织匀浆,根据制造商的指示。

2.7。免疫印迹分析

总蛋白提取分离通过sds - page和涂抹硝化纤维素膜(通用电气医疗集团欧洲、米兰、意大利)。膜与兔子anti-NLRP3孵化(Abcam,剑桥,英国),兔子anti-caspase-1(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX),鼠标anti-GSDMDC1(圣克鲁斯生物技术),兔子anti-IL-1β(圣克鲁斯生物技术),兔子anti-caspase-1(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX),鼠标anti-Tyr^204年ERK1/2(细胞信号技术),兔子anti-total ERK1/2(细胞信号技术),鼠标anti-Ser^473年一种蛋白激酶(细胞信号技术),兔子anti-total Akt(细胞信号技术),兔子anti-Ser⁹GSK-3β(Abcam,剑桥,英国),anti-total GSK-3β(细胞信号技术),兔子anti-mitochondrial转录因子(mtTFA)(罗福斯生物制品,剑桥,英国),鼠标反核呼吸因子- 1 (NRF-1)(圣克鲁斯生物技术),和鼠标anti-sarcomeric线粒体肌酸激酶(sMtCK)(圣克鲁斯生物技术),然后探讨了适当HRP-conjugated二级抗体(BioRad)。明晰西方ECL衬底(BioRad)被用于蛋白质检测和量化是由光密度分析(数量、Bio-Rad软件)。根据相关数据规范化antitubulin光密度值。

2.8。实时聚合酶链反应

总RNA提取心脏样品使用AllPrep®DNA / RNA /蛋白质工具包(试剂盒、希尔登,德国),根据生产指令。总RNA浓度(μg / mL)是由荧光计量子位,Quant-iT™RNA分析工具包(表达载体、米兰、意大利)。500 ng的RNA是使用QuantiTect reverse-transcribed逆转录工具包(试剂盒)。合成cDNA用于实时聚合酶链反应(rt - pcr)。互补脱氧核糖核酸实时PCR扩大了使用SsoFast™EvaGreen (Bio-Rad)和引物特定细胞因子il - 1β(Mm_Il1b_2_SG猫。数量QT01048355试剂盒)。PCR反应是在95°C执行了30年代紧随其后40 95°C的周期5 s, 55°C 10 s。所有的样品都在重复运行。至少两个nontemplate控制被包含在所有PCR。参考核糖体RNA基因的转录18岁(Mm_Rn18s_3_SG,猫。数量QT02448075试剂盒)用于规范化mRNA数据,和量化数据分析利用Bio-Rad大型管理软件CFX 1.6版本(Bio-Rad)根据制造商的指示。

2.9。材料

化合物在这里使用从Sigma-Aldrich有限公司获得,除非另有说明。

2.10。统计分析

数据描述的文本和数据呈现意味着±标准平均误差(s.e.m)的观察,代表的动物数量研究。执行统计分析使用方差分析测试随后Bonferroni期末测验。一个值小于0.05的被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。INF4E预处理限制梗死大小和改善收缩性复苏

老鼠的心脏暴露在全球缺血30分钟和60分钟再灌注了60±3%在心室的基底部分评估梗塞大小电视台染色。心进行预处理时(前20分钟缺血)INF4E灌流液,梗塞大小是未经处理的心(IR)相比显著降低(图1(一))。重要的是,在灌流液LDH释放被药物治疗(图几乎减少了一半1 (b))。此外,INF4E预处理心脏收缩恢复后会增加两个红外,作为评估左心室压力监控(图1 (c))。

值得注意的是,红外导致力学性能的一个障碍,就是明证发达LVP的显著减少(DLVP)后立即缺血和再灌注期间不完全恢复。事实上,发达LVP从大约80毫米汞柱preischemic条件约25毫米汞柱10分钟后再灌注,然后恢复到只有50毫米汞柱在60分钟再灌注,从而达到只有不到65%的preischemic值(数字1 (c)和1 (d))。NLRP3抑制剂没有修改的预处理DLVP复苏的早期再灌注时间(10和20分钟),而改善开始40分钟后检测,达到价值高达85毫米汞柱在60分钟,超过100%的相应preischemic再灌注结束时的值。最后舒张LVP (EDLVP)约5毫米汞柱在稳定;全球缺血30分钟和随后的再灌注引起持续增加该参数在红外光谱和红外+ INF4E组(图1 (e))。实际上,增加EDLVP欣赏立即结束后缺血和再灌注持续在前20分钟。然后EDLVP IR组进一步增加达到值超过30毫米汞柱,在该集团用NLRP3抑制剂预处理后逐步降低约20毫米汞柱再灌注1小时。EDLVP显著的增加()减毒的NLRP3抑制剂只在60分钟再灌注。

3.2。INF4E预处理防止NLRP3 Inflammasome激活和下游信号

确认的能力INF4E干扰NLRP3 inflammasome复杂地层和激活我们的实验模型,表达水平和激活下游信号NLRP3 inflammasome评估通过免疫印迹分析蛋白质提取物来自心的顶端部分进行预处理或不INF4E和暴露于红外(图2)。此外,老鼠的心脏暴露在两个不同时期的再灌注,短期和长期(20分钟和60分钟,职责。)为了更好地阐明药物的动力学调制的NLRP3 inflammasome和相关的通路。如图2NLRP3蛋白质含量的增加,时间的方式,达到统计学意义只有60分钟后再灌注。值得注意的是,upregulation INF4E预处理有效减少。免疫印迹分析抗体识别的c端地区caspase-1允许两个乐队procaspase-1对应的识别和裂解活性p10 caspase-1的亚基。20分钟后再灌注caspase-1的活性形式是明显增加,procaspase-1的表达没有显著变化,尽管INF4E-pretreated心中出现了轻微的无意义的趋势减少procaspase乳沟。60分钟的再灌注后,前体和活动形式的caspase-1都极大地提高了未经处理的IR组,而INF4E-pretreatment显著预防procaspase乳沟。如图2 (c)caspase-1激活与解理inflammasome GSDMDC1组件的平台,可检测后再灌注时间最长。有趣的是,INF4E预处理显著降低GSDMCD1乳沟。因此,il - 1的活性形式的蛋白质含量β显示一个健壮的增加60分钟再灌注后,通过免疫印迹分析(图2),经ELISA(图3(一个))。INF4E预处理阻止il - 1的轻微增加β生产由于20分钟再灌注和强烈降低il - 1β释放60分钟后再灌注(数据记录2和3(一个))。有趣的是,无论是红外受伤还是药物治疗mRNA水平的il - 1的影响β(图3 (b)),从而确认选择性INF4E对NLRP3 inflammasome-dependent il - 1β乳沟,而不是表达。

3.3。INF4E预处理增强风险途径保护活动

最近,一个角色NLRP3 inflammasome激活调制的再灌注损伤抢救激酶(风险)通路被建议20.]。因此,我们量化表达式和活动(磷酸化)的主要成员的途径。20分钟后再灌注不活动的调制和/或表达水平的风险通路成员的记录(图4)。相反,时间越长红外挑战诱导增加磷酸化ERK1/2(数据4(一)和4(b))和GSK-3β(数据4(一)和4(d)),而一种蛋白激酶的磷酸化倾向于增加,没有达到统计学意义,治疗心暴露在短或长红外协议(数字4(一)和4(c))。有趣的是,INF4E预处理进一步增加了磷酸化ERK1/2, Akt, GSK-3β60分钟再灌注诱导的未经处理的心(数字4(b)和4(c)),提出一个改进的保护通路的激活药理干预。

3.4。INF4E预处理改善线粒体生物起源和能量代谢

由于线粒体代谢是高度参与缺血性细胞反应的侮辱,和一个相声线粒体和NLRP3之间被描述(21),我们分析标记线粒体生物起源的缺血30分钟和60分钟后再灌注。MtTFA和NRF-1被红外明显下调。相反,有丝分裂发生明显INF4E预处理(数据保存5(一)-5(c))。心脏细胞缺氧的重要生理反应的增强线粒体能量生产,建议在我们的模型的后sMtCK IR的表达增加(数据5(一)和5(d))。有趣的是,INF4E预处理进一步刺激的表达对未经治疗的老鼠心脏sMtCK 25%(数据5(一)和5(d))。

4所示。讨论

目前的研究可以提高我们的理解的影响NLRP3 inflammasome针对急性心肌梗塞。我们证实,心肌红外诱导转录所有inflammasome组件的时间,和轻微的效果检测心暴露在20分钟时再灌注和健壮的过度激活在再灌注时间最长(60分钟)。这些数据与之前的协议文件显示的表达水平增加NLRP3和procaspase-1梗塞的和noninfarcted区域心肌细胞和nonmyocyte细胞,与增加caspase-1活动(13,22]。之前我们还证明了一个增强对心肌缺血的侮辱,由于代谢紊乱,由大平行NLRP3 inflammasome心中激活(12]。然而,先天免疫的潜在作用NLRP3蛋白质复杂的治疗心肌梗塞病了定义的目标。这主要是由于对比的结果到目前为止获得的目标删除inflammasome组件。一些研究表明的损耗inflammasome复杂的组件之一,传感器(NLRP3)或效应酶(caspase-1),可以防止其激活和保护心脏预防缺血性损伤和不良心脏重塑(22- - - - - -24]。相比之下,芬兰化等。20.)表明,缺乏NLRP3导致增加心肌梗死后大小在活的有机体内红外,而金正日et al。14)认为NLRP3没有作用在急性心肌梗死由于低心脏表达式。如上所述相同的作者,显著差异的使用方法以及感兴趣的特定端点可能有助于解释这种不一致(25]。此外,NLRP3之间的差异的结果^−−/和ASC^−−/小鼠心脏红外后以前观察到(13,26),这表明存在的重要inflammasome-independent效果与目标基因缺陷有关。因此,只有小分子的评价能够选择性地抑制NLRP3 inflammasome可能允许最终说明潜在的NLRP3 inflammasome作为治疗干预心肌药理目标红外受伤。不幸的是,缺乏高度的选择性药理抑制剂限制了调查。INF4E是为数不多的化合物已被证实能直接目标NLRP3 inflammasome和抑制腺苷三磷酸酶活动所需的NLRP3激活。虽然有明确的迹象表明,这种药物对特定影响NLRP3 inflammasome独立激活的刺激,作用的确切机制仍有待澄清(16]。第一次我们证明,管理NLRP3 inflammasome抑制剂INF4E在单一剂量明显减少梗塞面积,心血管研究的主要目标端点。此外,预处理与INF4E保存收缩功能,减少心肌指数令人震惊的。我们所知,到目前为止,只有另一个小分子作为NLRP3 inflammasome抑制剂已经在急性心肌损伤模型,测试显示类似的保护作用在我们的记录体外心肌IR模型损伤(27,28]。有趣的是,这种化合物并没有减少梗塞大小在再灌注3 h,虽然明显减少梗塞大小在24小时,如果在再灌注的开始,而不是3 h后再灌注(29日),从而确认第一阶段的重要性IR的再灌注损伤发展和药理战略的有效性5]。这里我们记录缩小梗塞面积显著甚至60分钟后再灌注,INF4E管理作为预处理。必须指出,我们的体外IR模型损伤可能允许扣除浸润炎症细胞的参与,通常会影响reperfusion-related受伤记录在先前的研究调查的影响NLRP3抑制剂时再灌注期间(28,29日]。因此,我们的数据进一步扩展先前的研究结果表明连续药物抑制NLRP3 inflammasome途径已经在缺血期间可能大大促进再灌注的有利影响记录结束时。再灌注损伤的动力学表达式也会影响药物的实体目标,因此,保护。事实上,当比较20分钟再灌注和60分钟再灌注模型我们观察到一个进步的表达和活性NLRP3 inflammasome复杂,从而确认之前发现的时机NLRP3 inflammasome形成在心脏缺血再灌注(29日]。

最近,一个角色NLRP3 inflammasome激活在心血管风险途径已经隐约暗示,但不能令人信服地证明(20.]。我们测量了整个风险的途径,其中包括一种蛋白激酶和ERK1/2 GSK3激活和β通过抑制磷酸化(30.]。我们的数据表明,激活ERK / Akt / GSK-3β信号被进一步加强药物抑制NLRP3 inflammasome复杂,这种效应可能大大有助于心血管效应。这些数据证实了我们之前的发现,表明药物抑制NLRP3 inflammasome明显强化的活动prosurvival Akt通路(31日]。此外,相声之间NLRP3 inflammasome和风险途径进一步证实了表达式的比较分析/两通路成员的活动,只显示强劲增加60分钟再灌注模型在两种情况下。

虽然我们演示测试化合物的直接影响NLRP3 inflammasome激活,我们不能排除潜在的相互作用与其他信号通路INF-4E,包括那些参与的规定NLRP3的表达和/或激活的风险通路。因此,进一步严格的评估测试化合物的影响在其他信号通路影响红外需要更好地阐明其药效学资料。

的影响药物抑制NLRP3 inflammasome风险通路密切相关的记录在线粒体代谢反应。事实上,线粒体代谢功能障碍对心脏损伤发展是至关重要的,因为两块线粒体ATP-sensitive钾通道(mitoKATP)和线粒体渗透性转换孔开放注射(mPTP药物)是常见的末端效应器的红外受伤。因此,药理战略旨在开放mitoKATP和注射抑制mPTP药物打开有效降低心肌红外损伤和改善心肌细胞能量通过调节体内平衡的活动成员的风险通路(32- - - - - -35]。我们和其他人证明Akt-mediated GSK-3失活β对心肌红外损伤的预防至关重要,作为一个关键事件的监管细胞凋亡和线粒体生物起源的增强36- - - - - -38]。此外,选择性GSK-3的使用β抑制剂唤起保护红外损伤和促进细胞存活注射通过限制mPTP药物打开(39,40]。同意上述观察,INF4E-induced放大的风险通路激活在这里描述积极对线粒体代谢的影响。事实上,我们的数据清楚地表明,线粒体生物起源的标志,由红外抑制,被INF4E显著调节管理。此外,管理复合线粒体能量代谢增强,所示的钢筋sMtCK的表达,这是一个标记线粒体ATP产量的增加。

不幸的是,我们的研究不允许识别NLRP3-mediated反应所涉及的特定类型的细胞。心肌细胞是最著名的细胞类型的心脏和损失收缩组织最重要的后果是心肌梗塞。然而,在心肌细胞,激活NLRP3 inflammasome唤起caspase-1激活和pyroptosis,但不成熟有关释放il - 1β(22,41]。相比之下,NLRP3 inflammasome激活心肌成纤维细胞诱发大量的成熟的il - 1的生产β,导致的迅速放大炎症反应(13,23,42]。心肌细胞il - 1是至关重要的目标β居民产生的成纤维细胞,损害收缩功能和诱导凋亡细胞死亡,我们可以推测,INF4E的有益影响,至少在某种程度上,一个间接改善心肌细胞功能。

5。结论

综上所述,我们的结果加强NLRP3的关键作用inflammasome激活即使在心肌损伤的早期步骤引起的红外光谱和节目,第一次,其药理抑制INF4E减少器官损伤或功能障碍。INF4E保护心脏功能的,至少在一定程度上归因于一个保护作用介导的激活风险生存途径和线粒体功能的改善,,反过来,可以改善心脏功能和缺血后的结果。但必须强调,缺乏长期的评价药物的影响以及数据再灌注期间管理限制的解释我们的研究结果的临床可转让性。因此,还需要进一步的严格的评估来获得一个更好的理解的作用机制和疗效INF4E在急性心肌梗塞的设置。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作被都灵大学的支持和资助(Ricerca地区2015线和白线B)。

补充材料