文摘

目前的研究旨在评估芹黄素的治疗意义,阐明底层机制。的叔丁基氢过氧化物(t必和必拓)200μ米被用来诱导氧化损伤来ARPE-19细胞。芹黄素在浓度小于800μ米没有造成对ARPE-19细胞细胞毒性的影响。细胞生存能力分析表明,芹黄素,享年200岁μ显著促进细胞存活t-BHP-treated ARPE-19细胞。此外,芹黄素,享年100岁μM显著ARPE-19细胞保护t-BHP-induced细胞凋亡。分子考试证明芹黄素在400μ米的mRNA和蛋白表达显著调节Nrf2并刺激其核易位ARPE-19细胞治疗或没有t必和必拓。芹黄素400μ米也显著升高HO-1的表达,NQO1、GCLM mRNA和蛋白水平的存在与否t必和必拓。此外,芹黄素,享年400岁μ显著提高SOD的活动,猫,氧化酶,T-AOC和减少ROS、MDA的水平t-BHP-treated ARPE-19细胞。然而,这些影响芹黄素与Nrf2 siRNA都废除被转染。总的来说,我们目前的数据表明,芹黄素ARPE-19细胞施加强有力的抗氧化性能挑战t必和必拓,依赖激活Nrf2信号。

1。介绍

年龄相关性黄斑变性(AMD)是老年人失明的主要原因,及其与患病率显著增加每十年后世界各地的50岁(1]。AMD的早期阶段,改变视网膜色素上皮(RPE)和视网膜下存款RPE和布鲁赫膜(2]。AMD可以开发脉络膜新生血管形成的特点是新的血管,入侵黄斑,AMD的迅速恶化阶段,也称为湿性AMD (3]。因此,血管内皮生长因子(VEGF)是最重要的血管生成网络的监管机构被认为是当前治疗湿性AMD的一个关键目标和几个VEGF抑制剂如贝伐单抗,pegaptanib或初已经证明有前途的疗效临床上下文(4]。此外,干AMD可以慢慢进步地理萎缩,这是迟发性的形式,导致RPE黄斑变性(5]。不幸的是,没有可用的治疗干AMD目前为止。

越来越多的证据表明,氧化应激在干AMD的发病机制中发挥着关键作用。氧化应激是指细胞或分子损伤引起的活性氧(ROS),特别是发生在与年龄有关的症状的结果破坏了平衡生产活性氧和抗氧化防御反应(6]。它已经成熟的转录因子Nrf2核因子红细胞两个相关因子(2)函数的主监管机构高度保守的保护性分子反应在哺乳动物细胞氧化应激。在基础条件下,Nrf2身体结合的-调节器Keap1泛素化和细胞质内的蛋白酶体降解,从而限制Nrf2活性。然而,在氧化环境下,Nrf2从Keap1释放出来,把进入细胞核,它结合抗氧化反应元素(战神),因此其目标基因的转录激活编码二期代谢酶和antioxidases,包括血红素oxygenase-1 (HO-1),醌oxidoreductase-1 (NQO1)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶),glutamate-cysteine连接酶修饰符单元(GCLM)、谷胱甘肽和环氧化物水解酶(7]。已经有证据表明Nrf2-deficient老鼠发达眼部病变类似人类AMD和管制的基本特征自噬可能是机械的氧化损伤和炎症之间的联系(8]。更多的了解的潜在作用Nrf2干AMD的发病机理可能为治疗干预提供新的机会发展先进的疾病的预防。

芹黄素是一种黄酮类化合物多存在于常见的水果,如柚子、和植物的饮料和蔬菜,比如芹菜、洋葱、柑橘、茶叶、菊花,和小麦芽,在一些调味料(9]。据报道,这种化合物已经被越来越多的各种药理作用包括抗炎(10),杀毒软件(11],抗氧化作用[12),和抗癌13]。鉴于芹黄素的强有力的抗氧化效果,我们在此推测,这种化合物可能干AMD的治疗意义。为此,叔丁基氢过氧化物(t必和必拓)是用于建立人类RPE细胞中的细胞氧化应激模型ARPE-19行,这是孤立的从人类视网膜色素上皮细胞和稳定层表现出形态和功能单极性(14]。ARPE-19细胞结构和功能属性RPE细胞的特征在活的有机体内和是有价值的在体外RPE生理学的研究。我们使用这一模型来检查芹黄素的保护作用,并阐明底层机制。

2。材料和方法

2.1。评议和抗体

t必和必拓和芹黄素从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。主要的抗体Nrf2 HO-1, GCL, NQO1、β肌动蛋白,核纤层蛋白B和二级抗体山羊Anti-Rabbit免疫球蛋白/合用于免疫印迹分析都是来自Abcam(英国剑桥)。

2.2。细胞培养

人类RPE细胞线ARPE-19购买来自美国文化(美国)集合类型。ARPE-19杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM;表达载体、大岛屿,美国纽约)补充10%胎牛血清(的边后卫;四季青生物工程材料有限公司,杭州,中国),100 U /毫升青霉素和链霉素100毫克/毫升,生长在空气和95% 5%的股份有限公司₂调湿大气在37°C。

2.3。在ARPE-19细胞氧化损伤模型的建立

ARPE-19细胞被播种在96孔板(1×10⁴/)和10%的边后卫,在DMEM培养24小时。细胞治疗t必和必拓在50浓度,100,200,300,400,500μ米24 h。然后用100中被取代μL磷酸缓冲盐含0.5毫克/毫升3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑(MTT)在37°C酝酿4 h。接下来,200年二甲亚砜μL添加溶解晶体。在490纳米光谱吸光度测量由SPECTRAmax™微型板块分光光度计(分子器件、桑尼维尔,美国)。细胞生长抑制曲线绘制和half-inhibition浓度(IC₅₀)被选为合适的浓度t必和必拓建立ARPE-19细胞氧化损伤模型。细胞生长抑制率=(测试OD值−空白OD值)/(控制OD值−空白OD值)×100%。细胞存活率=[1−−(测试OD值空白OD值)/(控制OD值−空白OD值]×100%。实验进行了一式三份。

2.4。评估在ARPE-19芹黄素细胞的毒性

ARPE-19细胞被播种在96孔板(1×10⁴/)和10%的边后卫,在DMEM培养24小时。细胞治疗芹黄素在10浓度,50岁,100年,200年、400年和800年μ米24 h。细胞生存能力评估使用MTT测定如上所述。细胞存活率计算评估芹黄素的细胞毒性。实验进行了一式三份。

2.5。评价芹黄素ARPE-19保护细胞免受氧化损伤

ARPE-19细胞被播种在96孔板(1×10⁴/)和10%的边后卫,在DMEM培养24小时。细胞浓度使用芹黄素在100年,200年和400年μ米6 h。然后细胞被另外处理t必和必拓在200μ米24 h。细胞生存能力评估使用MTT测定如上所述评估芹黄素在ARPE-19细胞免受氧化损伤。实验进行了一式三份。

2.6。分析细胞凋亡

ARPE-19与芹黄素细胞治疗浓度的100年,200年和400年μM 6 h,然后另外处理t必和必拓在200μ米24 h。凋亡率由流式细胞术使用膜联蛋白V-FITC细胞凋亡测定包(南京凯基生物生物技术有限公司,南京,中国)根据协议。凋亡细胞被定义为细胞位于正确的每个情节和百分比两象限流式细胞术测定(FACSCalibur;Becton, Dickinson和公司,富兰克林湖,新泽西,美国)。使用软件CELLQuest数据进行了分析。实验进行了一式三份。

2.7。细胞转染Nrf2 siRNA

Nrf2核(上海GenePharma有限公司、上海、中国)100 pmol添加到100年μL介质在室温下无血清和抗生素和孵化为5分钟。的最终浓度Nrf2 siRNA 100海里。Lipofectamine 2000试剂(美国表达载体)25μ我于75年加入μL介质在室温下无血清和抗生素和孵化为5分钟。以上两种解决方案在室温下混合好了20分钟,和大约200μL转染复杂。那么800年的媒介μL无血清和抗生素添加到200年μL转染复杂和混合好,1000年的转染复杂的解决方案μL。ARPE-19细胞转染孵育复杂的解决方案在37°C 8 h,然后在完全培养基reincubated 37°C的额外的16 h。控制核(上海GenePharma有限公司、上海、中国)是一个不属预定目标的20 - 25元核设计作为一个消极的控制。

2.8。测定抗氧化系统

ARPE-19细胞治疗芹黄素,享年400岁μM和/或转染Nrf2 siRNA 6 h,然后另外处理t必和必拓在200μ米24 h。由超声波细胞破碎的治疗和受到离心得到上层清液。活动的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、氧化酶、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)测定使用相应的酶联免疫吸附测定试剂盒(南京建成生物工程研究所、南京、中国)根据制造商的指示。实验进行了一式三份。

2.9。ROS水平测定

ARPE-19细胞治疗芹黄素,享年400岁μM和/或转染Nrf2 siRNA 6 h,然后另外处理t必和必拓在200μ米24 h。荧光探针2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA)是用来测量细胞内ROS的生成。ARPE-19细胞治疗10μM DCFH-DA 37°C的20分钟,然后洗了三次与媒介。细胞被孵化芹黄素在400日圆μM和/或转染Nrf2 siRNA 6 h,然后另外处理t必和必拓在200μ米24 h。荧光是由流式细胞术(FACSCalibur;Becton, Dickinson和公司,富兰克林湖,新泽西,美国)在488 nm波长。实验进行了一式三份。

2.10。实时聚合酶链反应

从治疗细胞总RNA分离使用试剂盒试剂(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)协议后,由制造商提供。如前所述(执行实时聚合酶链反应15]。β肌动蛋白是作为不变量控制。褶皱的变化目标基因的mRNA水平相关β肌动蛋白所建议计算Schmittgen et al。16]。实验进行了一式三份。基因的引物(GenScript,南京,中国)如下:Nrf2(向前)5′-TGAGGTTTCTTCGGCTACGTT-3′(反向)5′-CTTCTGTCAGTTTGGCTTCTGG-3′;HO-1(向前)5′-CTGGAGGAGGAGATTGAGCG-3′(反向)5′-ATGGCTGGTGTGTAGGGGAT-3′;NQO1(向前)5′-GCGTCTGGAGACTGTCTGGG-3′(反向)5′-CGGCTGGAATGGACTTGC-3′;GCLM(向前)5′-ATCAAACTCTTCATCATCAAC-3′(反向)5′-GATTAACTCCATCTTCAATAGG-3′;β肌动蛋白(向前)5′-CCACACCTTCTACAATGAGC-3′(反向)5′-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3′。

2.11。免疫印迹分析

全细胞蛋白提取与radioimmunoprecipitation准备从治疗细胞分析缓冲区包含150毫米氯化钠,50毫米三,0.1%钠十二烷基硫酸盐,1%诺乃清洁剂p 40,和0.5%脱氧胆酸盐补充了蛋白酶抑制剂phenylmethylsulfonyl氟化物。检查Nrf2表达式,核蛋白质和细胞质蛋白质分离使用Bioepitope核和胞质提取工具包(Bioworld技术,圣路易斯公园,锰、美国)根据协议。蛋白质(50μg /)被SDS-polyacrylamide凝胶分离,转移到PVDF膜(美国微孔,伯灵顿,MA),脱脂牛奶和屏蔽5% Tris-buffered盐水含0.1%渐变20。目标蛋白质检测到相应的主要抗体,随后通过辣根peroxidase-conjugated二级抗体。蛋白质乐队可视化使用化学发光试剂(美国微孔,伯灵顿,MA)。等效加载被确认使用抗体β肌动蛋白对核纤层蛋白B核总蛋白质和蛋白质。代表墨迹来自三个独立的实验。靶蛋白的水平乐队是densitometrically 4.4.1使用数量决定的。乐队的密度的变化表示为褶皱变化比控制在归一化后的污点β肌动蛋白和核纤层蛋白B。

2.12。统计分析

数据被当作平均数±标准差和结果使用SPSS16.0软件进行了分析。差异的重要性是通过单向方差分析确定事后Dunnett的测试。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。芹黄素能抵抗t在ARPE-19 -BHP-Induced氧化损伤细胞

为了建立一个在ARPE-19细胞氧化损伤模型,我们使用MTT试验来确定细胞生长的t必和必拓,一个著名的氧化剂。结果表明,t必和必拓的细胞生长抑制率增加浓度的方式(图1(一)),t必和必拓在200μM导致细胞存活率显著降低ARPE-19细胞(图1 (b))。因此,t必和必拓在200μ米被用来诱导这些细胞氧化损伤对后续实验。此外,我们发现芹黄素含量高达800μ米没有明显影响ARPE-19细胞生存能力,表明芹黄素可能没有对这些细胞的毒性(图1 (c))。接下来,我们观察到,芹黄素浓度依赖性细胞存活率ARPE-19细胞接触t必和必拓(图1 (d))。细胞凋亡是使用流式细胞仪检测,结果表明,ARPE-19细胞接触t必和必拓控制相比有显著的凋亡率,但芹黄素明显减少了t-BHP-induced APRE-19细胞凋亡(数字1 (e)和1 (f))。综上所述,这些数据都表明,芹黄素ARPE-19保护细胞对抗t-BHP-induced氧化损伤。

3.2。芹黄素激活Nrf2及其目标基因在ARPE-19细胞抗氧化系统

我们下一个检查的作用Nrf2芹黄素ARPE-19保护细胞信号使用Nrf2 siRNA-mediated基因敲除的方法。实时PCR分析表明,Nrf2 mRNA芹黄素显著调节,但明显减少了小干扰rna的存在与否与Nrf2转染芹黄素ARPE-19细胞有或没有治疗t必和必拓(图2(一个)和2 (b))。一致,免疫印迹分析表明,蛋白质丰富的Nrf2细胞质和细胞核明显增加了芹黄素但显著降低转染Nrf2核的存在与否芹黄素ARPE-19细胞有或没有治疗t必和必拓(图2 (c)和2 (d))。这些数据表明,芹黄素可以激活这些细胞Nrf2信号的表达式和核易位Nrf2 Nrf2 siRNA可有效地抑制。此外,我们研究了Nrf2几个目标基因的表达,是极度参与细胞内的抗氧化系统。NQO1 mRNA的表达HO-1, glutamate-cysteine连接酶修饰符单元(GCLM)均显著地调节t必和必拓与控制。芹黄素相比他们的mRNA表达显著升高t-BHP-treated细胞,但是转染Nrf2 siRNA导致HO-1 mRNA表达降低,NQO1、GCLM(图3(一个))。芹黄素也显著增加他们的mRNA表达ARPE-19细胞没有t必和必拓(图3 (b))。免疫印迹分析显示类似的一致的结果ARPE-19细胞的存在与否t必和必拓在蛋白质水平(数字3 (c)和3 (d))。总的来说,这些数据表明,芹黄素Nrf2表达增加,促进了其核易位,导致增强的目标基因的表达与保护在ARPE-19 oxidative-caused伤害细胞。

3.3。需要激活Nrf2芹黄素发挥抗氧化特性t-BHP-Treated ARPE-19细胞

我们下一个评估芹黄素的抗氧化效果及其对激活Nrf2信号。我们测量的一系列的活动第二阶段代谢酶和antioxidasest-BHP-treated ARPE-19细胞。结果表明,SOD酶活性,猫,和氧化酶水平显著降低t-BHP-treated ARPE-19细胞,但是芹黄素,享年400岁μM显著恢复这些酶的活动。然而,芹黄素明显废除的影响通过转染Nrf2 ARPE-19细胞暴露于核t必和必拓(图4(一)- - - - - -4 (c))。此外,水平的ROS、MDA和T-AOC,三个参数表明细胞内氧化状态,测定。ARPE-19细胞被质疑t必和必拓表现出显著ROS、MDA水平升高和降低T-AOC水平。然而,芹黄素显著降低ROS、MDA水平,增强T-AOC水平t-BHP-treated ARPE-19细胞,但是这些影响显然是被转染Nrf2 siRNA(数字4 (d)- - - - - -4 (f))。总之,这些结果表明激活Nrf2是芹黄素所需发挥抗氧化特性t-BHP-treated ARPE-19细胞。

4所示。讨论

有效治疗方法干AMD迫切需要在当前临床上下文。增加的证据基础和临床研究亮点,氧化损伤是非常与干AMD的发病机理,因此代理具有抗氧化特性可能是有前途的治疗选择干AMD (17]。例如,一个年龄相关性眼病研究(火鸟)评估等抗氧化制剂药理剂量的影响β胡萝卜素、维生素C、维生素E、锌和铜在AMD和视力的发展,证明政府的抗氧化剂可能导致先进的AMD发展风险减少25%,中度视力丧失风险减少19%在5年内(18]。此外,最近的一次调查评估的安全性和有效性ot - 551,一个双取代的羟胺具有抗氧化特性,治疗地理萎缩,AMD的先进萎缩性形式,证明了这个代理可以有利于维护AMD患者的视力(19]。在目前的研究中,我们证明了黄酮类化合物芹黄素是安全ARPE-19细胞,显著提高生存率和降低这些细胞的凋亡率与氧化损伤所致t必和必拓。芹黄素在400μ米,尤其是能提供有利的ARPE-19细胞对氧化损伤的保护作用。我们的发现表明芹黄素作为AMD治疗候选人。此外,针对氧化应激是最有可能的一个早期和持久的不良刺激,我们假设芹黄素还可以作为防止代理AMD。考虑到类黄酮的抗氧化特性是众所周知的,因此,我们集中在信号通路调节细胞内氧化还原系统的希望阐明芹黄素的机制与治疗AMD。

的转录因子Nrf2被广泛承认是在哺乳动物细胞抗氧化途径的关键调节器。大量的研究已经建立了一个重要的链接Nrf2信号AMD的发病机制。研究表明,Nrf2-deficient老鼠表现出显著的AMD-like视网膜病变(8],Nrf2通路的激活药物可以保护对oxidative-caused ARPE细胞损伤(20.,21]。我们目前的数据证明t必和必拓在200μ米没有明显改变Nrf2的转录但显著升高Nrf2 ARPE细胞的核内蛋白丰度。芹黄素也强有力地增加核易位Nrf2和调节的转录一系列二期代谢酶的表达t-BHP-treated ARPE细胞。这些数据表明,Nrf2核易位发生在ARPE细胞在氧化刺激,导致几个二期代谢酶的转录和表达,芹黄素可以强有力地激活这些细胞Nrf2信号。,据报道,芹黄素可能恢复的沉默状态在皮肤表皮JB6 P +细胞Nrf2 CpG脱甲基加上减毒活动DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰酶抑制剂(22]。芹黄素还发现显著激活Nrf2-antioxidant响应element-mediated HepG2细胞基因表达和诱导抗炎活动(23]。

我们进一步证明芹黄素在ARPE细胞有强大的抗氧化性能,因为抗氧化酶SOD的活动,猫,和氧化酶T-AOC水平显著提高,但ROS、MDA的水平被芹黄素显著降低。一致,芹黄素的抗氧化效果也证明了在许多其他的情况下。例如,类黄酮成分Sida cordata充满芹黄素,增加肝脏抗氧化酶的活动包括猫、SOD, POD,销售税,GSR,氧化酶在老鼠和四氯化碳中毒(24]。山药皮提取物,芹黄素是一种主要的组件,可以防止大鼠肝损伤通过提高抗氧化酶和抗炎能力的活动(25]。我们当前研究夺回这些结果在ARPR-19细胞氧化应激,这可能与AMD的治疗。有趣的是,我们观察到,芹黄素的抗氧化特性是依赖于激活的Nrf2 ARPE-19细胞接触t必和必拓,因为丧失方法与siRNA-mediated Nrf2击倒显著废除芹黄素upregulation SOD, CAT,氧化酶,T-AOC活动和获救的差别芹黄素对这些活性氧和疯狂的水平。这些发现表明,Nrf2可能是一个关键的目标分子制药调节器保护人类视网膜色素上皮细胞对氧化损伤,从而发挥有益作用AMD治疗。符合我们当前的数据,据报道,芹黄素增加Nrf2表达或激活它的功能分化PC12细胞(26和大鼠原发性肝细胞27]。然而,对比结果还报道,芹黄素大幅减少Nrf2 mRNA和蛋白表达水平的差别通过对这些PI3 K / Akt通路,导致减少Nrf2-downstream bel - 7402细胞中基因(28]。把这些研究结果结合起来,我们都认为芹黄素的监管Nrf2可能依赖于不同的细胞类型或病理生理环境。针对这一点,我们正在进行动物研究使用Nrf2基因敲除小鼠来验证芹黄素的监管Nrf2信号和芹黄素在AMD的治疗效果在活的有机体内。

总之,芹黄素对ARPE-19细胞表现出强大的保护作用t-BHP-induced氧化损伤,与它的抗氧化效果依赖于激活Nrf2信号。我们目前的研究强烈表明,芹黄素可能是一个安全的治疗干性AMD的治疗选择。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作得到了江苏省科技计划项目,中国(批准号BK20151601)和项目领导人才江苏省中医、中国(批准号LJ200911)。