文摘

白藜芦醇抑制单胺氧化酶类报道(毛)。许多毛神经元相互作用的底物或抑制剂也与其他胺氧化酶类(AO)周边器官,如semicarbazide-sensitive AO (SSAO),称为伯胺氧化酶,在神经元缺席,但丰富的脂肪细胞。我们问是否酚类化合物(白藜芦醇,紫檀芪、槲皮素和咖啡酸)像毛泽东和SSAO抑制剂。AO活动决心在人类脂肪组织。计算对接和葡萄糖摄取化验进行3 d模型的人类AO蛋白质和脂肪细胞,分别。酚类化合物完全抑制荧光检测H2O2在毛泽东和SSAO激活生成酪胺、苄胺。他们也熄了H2O2在没有全身的荧光生物材料,无法废除放射性标记酪胺、苄胺的氧化。因此,酚类化合物阻碍了H2O2检测,但没有阻止AO活动。只有白藜芦醇和槲皮素部分受损MAO-dependent [14C]酪胺氧化和表现得像毛抑制剂。酚类化合物在H2O2端依赖benzylamine-stimulated葡萄糖运输。这表明各种酚类化合物块H的下游效应2O2由生物或没有直接抑制AO外生胺氧化。酚类化合物仍感兴趣的关于限制氧化应激的能力而不是抑制AO。

1。介绍

白藜芦醇是一个著名的非酶的抗氧化分子,据报道发挥神经保护行动十年以上1]。最近,反式白藜芦醇和独联体描述了白藜芦醇作为重组人类单胺氧化酶类的抑制剂,是缺氧,两种形式的胺氧化酶类(AO)参与神经递质代谢和清除内源性或外源性胺(2]。后来,反式白藜芦醇已经证明剂量依赖性抑制是老鼠大脑的方式可能参与其抗抑郁作用,而对缺氧(不活跃3),发现这是在协议与开创性的观察周et al。4]。这样的白藜芦醇/毛交互吸引了极大的兴趣,因为人物形象可以被视为目标神经退行性和精神障碍的治疗方法。然而,这些前进行了研究与本机形式的人类自然毛黄素蛋白表达大脑或外围组织。此外,至少有几个问题被引起的不完全破译白藜芦醇和毛之间的互动。(1)白藜芦醇是否只与大脑毛或互动与AO家族的其他成员吗?(2)以外的酚类抗氧化剂白藜芦醇与先进的互动吗?这种情况下促使我们进一步研究酚类化合物之间的相互作用和代谢。

AO家族包括FAD-dependent酶(本质上是毛泽东和聚胺氧化酶)和铜的胺氧化酶类,拥有的产品为主要成员基因AOC1, 2和3,后者被任命为semicarbazide-sensitive胺氧化酶(SSAO)或伯胺氧化酶,目前也被称为血管粘附蛋白1 (SSAO / VAP-1) (5,6]。很多毛分子相互作用,即使是在一种抑制的方式,也可以与其他先进的7]。给只有例子,它可以提到苯乙肼,被毛抑制剂作为抗抑郁药物,还能抑制SSAO / VAP-1 [8,9)和具有神经保护属性(10,11]。虽然AO家庭的不同成员由不同的基因编码,施加不同的生物功能,他们只有一些特定的底物和抑制剂,因为许多内源性或外源性胺表现出较差的选择性向不同的代谢(对于一个详尽的评论,看到这本书:[12])。不管它的本质,任何AO家族的酶氧化胺在水的存在和双氧释放相应的醛、氨和过氧化氢13]。虽然不是一个激进的,后者最终产品,H2O2,属于活性氧(ROS)很容易参与氧化应激。因此,假如可以包含在细胞ROS-generating系统(13]。因此,我们调查了假定的酚类化合物之间的相互作用(天然成分具有抗氧化特性的生化)和AO酶,应该采取行动以相反的方式在氧化应激。

事实上,考虑到各种所谓毛抑制剂还可以与其他先进的交互,我们问是否白藜芦醇,发挥抗氧化活动,能激活sirtuins蛋白(14,15抑制毛[的],最近描述2,16),也能够与SSAO交互。另一条线的观察还促使我们进行这样的验证。现在,酚类化合物具有抗炎作用[17,18]。考虑这样一个事实:许多抑制剂SSAO / VAP-1(工程抗体或可溶性小分子)也具有强大的抗炎操作在不同的实验模型(19- - - - - -21),相关利益确定白藜芦醇也可能抑制SSAO / VAP-1和这样的假定的抑制是否导致其抗炎行动。所有这些因素导致我们测试几种酚类化合物是否能抑制人类毛和SSAO / VAP-1和这样的抑制是否可能占一部分多个效果。

因此,我们工作的目的是专注于测试的能力,如果有的话,被选中的酚类化合物在这些酶的活性在本国形式在人,种间差异一直以来对底物和抑制剂选择性报道人物形象和SSAO [22,23]。对称二苯代乙烯中,我们比较反式白藜芦醇(最丰富的食品和饮料),紫檀芪羟化的衍生品,因为他们两人已报告在脂肪细胞抑制脂肪生成(24- - - - - -26)(见下文)。咖啡酸酚酸的被选为代表,因为它也被认为是抑制脂肪生成(27]。我们在比较研究中还包括槲皮素,因为它是最重要的酚类化合物存在于食品定量(表示的酚类化合物数据库:http://www.phenol-explorer.eu/(28])。下面的结果对人类脂肪组织不仅与肥胖相关的研究,也有价值对氧化应激方面因为《超能ROS-generating酶和酚类化合物,但最重要的低分子量的分子吸收食物能引起非酶的抗氧化剂在消费者行为,几乎被描述损害毛(2- - - - - -4]。

2。材料和方法

2.1。主题和脂肪组织抽样

腹部皮下脂肪组织的样本获得的39个超重女性Rangueil医院进行整形手术,图卢兹,法国(平均年龄: 年,范围:18 - 66,意味着身体质量指数: 公斤/米2)。人类脂肪组织的切除部分(帽子),视为手术浪费,是在不到一个小时转移到实验室,根据协议INSERM的准则和伦理委员会。这些作品都冻结在−80°C的帽子和派遣进行进一步分析。此外,脂肪样本的一部分立即受到liberase消化在37°C获得新鲜分离脂肪细胞葡萄糖运输分析如下详细。

2.2。胺氧化酶活性测定过氧化氢的荧光测定

氧化酶活性测定采用荧光探针Amplex红(10-acetyl-3 7-dihydrophenoxazine)设计用于检测过氧化氢的生物环境。化验进行相应地我们之前描述(29日,30.),这与轻微的修改从毛这种荧光方法的适应活动的决心(31日]。短暂,过氧化氢释放量化由于显色混合物40μM Amplex红色和4 U /毫升辣根过氧化物酶和过氧化氢的并行使用标准的解决方案从0.05到5μ(最终浓度)(32]。解冻的帽子样品在200毫米均质磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)在30秒以均质器组织大师- 125(美国Omni国际,肯尼索,GA)之前确定的胺氧化酶活动,如前所报道(32),除了没有antiprotease鸡尾酒补充道。匀浆分布在黑暗的微型板块(96 -好 μg蛋白/)和孵化37°C在黑暗中在200年至少30分钟μL最后卷30分钟后预培养没有(控制)或1毫米优降宁或氨基脲抑制毛或SSAO活性,分别,甚至与参考抑制剂废除所有AO活动。所有酚类化合物抑制性能的测试也添加在此预培养的步骤。酪胺、苄胺添加到媒体为了获得1毫米浓度和AO活动作为基质,正如已经提到29日]。DMSO车辆用于酚类化合物溶解出席最后更高浓度的1% w / v和抑制amine-induced信号由不到5%。

自发的匀浆过氧化氢形成解冻材料也是量化没有任何添加外源性胺抑制剂和定义为基底。化合物或生化制剂的影响荧光读数过氧化氢生成的执行标准曲线也没有任何的帽子在一组实验中被称为“生物材料。“在所有情况下,荧光数据收集(例/ em: 540/590 nm)在Fluoroskan提升板读者(ThermoLabsystems、芬兰)。

2.3。放射化学分析的胺氧化酶活动

脂肪组织的样本均质如上所述。50μL原油匀浆被孵化30分钟在200年37°CμL(200毫米磷酸盐缓冲剂的放射性标记胺后30分钟无预培养、抑制剂(年代)。MAO-dependent氧化抑制被定义为敏感优降宁1毫米,而SSAO-dependent 1毫米氨基脲氧化被废除。化验被贴上衬底的开始和停止通过添加50μL 4 M盐酸。胺的反应产物氧化提取1毫升的有机溶剂(甲苯/乙酸乙酯,1/1 v / v),根据蒂普敦的方法(23]。然后,0.7毫升整除有机相的放射性。最大速度和最优测定条件的胺氧化酶活动已经详细的人类脂肪细胞,培养preadipose细胞,或帽子匀浆33- - - - - -35]。因此,抑制研究只进行了氧化条件下达到最大速度,即对应于酪胺、苄胺的使用同位素稀释给1毫米最终浓度和达到大约640000 dpm / 50μL为(14C]酪胺(通过PerkinElmer提供,埃夫里市,法国,或由Sigma-Aldrich)或200000 dpm / 50μL为(14C)苄胺(NEC 835050加州大学从PerkinElmer购买)。有机相中的放射性物质提取时间0 (t0)代表了不到0.5%的总放射性/管每个标签的胺和酪胺被减去所有项和苄胺氧化抑制剂平均 dpm ( ), dpm ( ),分别。这些绝对值差异很大从一个人到另一个极端,在每个主题设置为100%引用的抑制百分比的计算。

2.4。己糖吸收的脂肪细胞

确定葡萄糖运输活动,帽子非常碎,消化在37°C下摇动20毫升Krebs-Ringer中含0.015毫克/毫升liberase (TM型,罗氏诊断),15毫米碳酸氢钠,10毫米玫瑰,和3.5%的牛血清白蛋白。活跃的脂肪细胞分离过滤通过尼龙屏幕,仔细洗在同一介质pH值7.4没有liberase获得脂肪细胞悬浮液已经描述(36]。刚分离脂肪细胞被孵化前的45分钟测试代理(3H] 2-deoxy-glucose吸收化验(PerkinElmer)在10分钟37°C plasticware已经描述(37]。

2.5。化学物质

酪胺盐酸盐、盐酸苄胺、胺氧化酶抑制剂,槲皮素,反式白藜芦醇,和其他试剂获得Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier、法国),除非另有规定。

2.6。计算的分子对接研究胺氧化酶类的活性部位

的结构反式白藜芦醇(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/445154)是用于计算结构的对接是共晶与骆驼蓬碱决议(2.2http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=2Z5X),缺氧与coumarin-analogue共晶(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/11616886分辨率(1.7)http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?pdbId=2V61),SSAO / VAP-1共晶pyridazinone模拟分辨率2.8 (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?pdbId=4BTW)。灵活的配体的方法与标准的执行精度(SP)薛定谔的软件包(发布2015 - 2),使用滑动软件版本6.7 (http://www.schrodinger.com/Glide/)。酚类化合物被视为码头到衬底的口袋共价的配体:在时尚是(大约4距离)和缺氧(约5.5距离)和旁边topaquinone残渣距离(约8.5)SSAO / VAP-1。对接框放置在共晶配体,20箱的大小是在每一个方向,也没有限制。

2.7。统计分析

结果意味着±标准错误的方法(SEM)。统计学意义是利用学生的评估 以及。显著性水平是设定在 。集成电路50值的计算是通过非线性回归使用GraphPad棱镜(美国CA)。

3所示。结果

3.1。活性氧释放人体皮下脂肪的仓库,以应对胺

自发和amine-stimulated过氧化氢生产帽子准备30分钟孵化(图上测量1)。当延长孵化条件观察到这些活性氧释放是线性与至少一个小时的时间(没有显示)。苄胺和酪胺在较小程度上,显著增加检测过氧化氢的量。自显色混合已经出现在孵化中添加0时刻当胺和自净荧光强度计算之间的区别t30岁,t0的信号,观察到的数量的增加过氧化氢与一个真正的时间2O2生产帽子制剂及其后续释放到媒介。确定的公认方法AO的活动包括在监测的释放只有一个氧化脱氨基作用的产物,过氧化氢。氧化脱氨基作用的化学计量的基础上,它应该是一个分子的H2O2与一个分子AO的胺氧化。在缺乏胺,这是一个自发的过氧化氢释放:基底活动代表了大约三分之一的最大响应苄胺。


图1
过氧化氢释放人体皮下脂肪组织:胺基板的影响。Amplex Red-based荧光检测过氧化氢进行匀浆中30分钟孵化没有任何添加胺(基底)或指定的胺的1毫米。结果表示为过氧化氢生产速度每分钟每毫克的蛋白质。意味着±SEM 22匀浆。基底在不同 和 。

amine-induced过氧化氢生产被用来测试一个假定的毛泽东和SSAO的酚类化合物与人类互动。

3.2。酚类化合物和毛之间的相互作用——或者SSAO-Induced过氧化氢生产

这是测试对酪胺的反应是否敏感参考抑制剂:优降宁(MAO-selective)和氨基脲(SSAO-selective)。前者抑制剂量依赖性酪胺的行动,而后者是完全低效(图2(一个))。值得注意的是,两种抑制剂的结合没有抑制多优降宁,仅留下不变的大约30%的生产中发现的酪胺的存在。这证实了,在人类脂肪储存,酪胺主要是氧化了毛。在酚类化合物进行了研究在相同的条件下,所有的四个测试分子(见图7化学结构)达到1毫米的最大抑制tyramine-induced H2O2释放(图2 (b))。在1μM剂量,几乎都无法修改1毫米酪胺的响应,因为它是古典AO抑制剂。亲和力的排序是:槲皮素>白藜芦醇>咖啡酸>紫檀芪,与各自的IC50值是62、100和107μm .从这些观察,它可以推断,白藜芦醇和其他酚类化合物能够限制tyramine-induced H2O2释放,抑制毛活动,从而确认先前的报道在白藜芦醇和扩大到其他酚类化合物抑制毛的能力。

(一)
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(b)
(b)
图2
抑制tyramine-induced过氧化氢生产在人体皮下脂肪组织匀浆通过引用毛泽东和SSAO抑制剂和酚类化合物。30分钟孵化后荧光读数减去从相应的值t0和1毫米酪胺净增长是100%没有任何抑制剂。(一)毛(优降宁,暗方块)或SSAO抑制剂(氨基脲、开放广场)是目前在15分钟预培养和30分钟孵化在0.001 - 1毫米或0.01μ分别为m - 1毫米。加入优降宁1毫米+氨基脲1毫米(P + S,黑色三角形)是用来废除所有胺氧化酶活动。意味着±SEM 6 - 22匀浆。当看不见,SEM酒吧躺在符号。(b)表示最后一次剂量的酚类化合物进行了测试在预孵化,孵化:白藜芦醇(黑眼圈),紫檀芪(黑色方块),咖啡酸(黑色三角形),或槲皮素(开放广场)。均值±7到10的SEM匀浆。

图3(一个)表明benzylamine-induced过氧化氢释放被抑制1毫米氨基脲耐优降宁。再次,优降宁和氨基脲没有进一步抑制比SSAO抑制剂氨基脲,留下不变的20%比例的信号。这些数据证实SSAO苄胺主要是氧化的帽子,正如前面报道(34]。

(一)
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(b)
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图3
抑制benzylamine-induced过氧化氢释放人体皮下脂肪组织通过引用毛泽东和SSAO抑制剂和酚类化合物。30分钟孵化后荧光读数减去从相应的值t0和1毫米苄胺净增加被设定为100%。(一)优降宁(毛、黑方格)或氨基脲(SSAO抑制剂,开放广场)出席表示最终的浓度,而他们的组合测试在1毫米(P + S,黑色的三角形)。均值±SEM至少6匀浆。(b)的酚类化合物在并行测试显示最终的浓度。意味着±8到12的SEM匀浆。

酚类化合物剂量依赖性抑制benzylamine-induced H2O2释放(图3 (b)),这表明它们显然像SSAO抑制剂。在这种情况下,集成电路50值(μM)对咖啡酸、白藜芦醇、槲皮素和紫檀芪是36岁,45岁,69年和136年,分别。然而,白藜芦醇和咖啡酸废除benzylamine-induced信号在1毫米,几乎比参考抑制剂氨基脲在更深的程度上,而槲皮素和紫檀芪受损部分benzylamine-induced信号。

这不同促使我们进一步验证是否酚类化合物被削弱的生成过氧化氢或他们是否削弱了其显色检测的混合物用于荧光检测。

3.3。酚类化合物减少过氧化氢诱导荧光Amplex Red-Based生色混合物

在这个阶段,似乎有必要确定过氧化氢的检测可以直接受酚类化合物不论其来源:生产代谢,生成其他酶系统,甚至被实验者外源性补充。没有任何人类的生物材料化验、古典底物和抑制剂的毛和SSAO并未改变荧光的存在5μM过氧化氢(信号设置为100%),即使出席(图0.1 - 1毫米4)。DMSO也不活跃的多酚剂量用作汽车的解决方案(1%,未显示)。对面,一个强大的交互与荧光读数被发现四个酚类化合物1的范围内进行测试μm - 1毫米。图4清楚地表明,所有的检测酚类化合物剂量依赖性降低几乎相同的效力的荧光信号引起5μ过氧化氢。相应的电子商务50值如下μM:槲皮素2.0、咖啡酸3.5 5.2 5.0白藜芦醇和紫檀芪。1毫米的酚类化合物,甚至有不明原因的低读数低于空白由磷酸盐缓冲剂和显色混合,导致百分比低于0%。所有这一切都表明,酚类化合物阻止检测过氧化氢在最佳条件下,因为它们阻碍了信号生成,可能通过阻止H之间的互动2O2和显色混合组件(Amplex红,过氧化物酶,或resorufin)。这样的交互作用可能依赖于检测酚类化合物的抗氧化性能,值得进一步研究。然而,我们的目标是评估毛和/或SSAO活动是否真的改变了白藜芦醇和相关分子。因此,我们使用另一种方法来测量更直接胺氧化、基于放射性标记底物的使用。

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图4
胺氧化酶的影响底物或抑制剂和酚类化合物fluorescent-based过氧化氢的检测。显色混合用于Amplex Red-based荧光检测过氧化氢与5孵化μM H2O2(控制设定在100%)或独自在决赛的存在表示化学物质浓度的测试。(一)缺乏毛和SSAO底物或抑制剂的影响。酚类化合物(b)摄入量有关废除的荧光信号引起5的μ过氧化氢。意味着±7的扫描电镜测量没有任何人类的物质。
3.4。酚类化合物的影响(14C]酪胺氧化

图5显示,优降宁抑制MAO-dependent [14C]酪胺氧化的帽子。正如所料,和相应的上法、氨基脲几乎是无法取消这个活动。令人惊讶的是,酚类化合物不完全抑制毛活动。只有白藜芦醇和槲皮素表现出部分毛抑制剂属性,因为,在0.1 - 1毫米,它们抑制25 - 60%的活动。与荧光方法对比,紫檀芪和咖啡酸没有废除酶活性时考虑标签的生产氧化的产品(14C]酪胺(图5)。

(一)
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图5
酚类化合物的影响,毛对酪胺氧化抑制剂或SSAO抑制剂的帽子。产生的放射性标记醛生产30分钟孵化的脂肪组织匀浆1毫米的同位素稀释14C]酪胺被设定为100%,没有添加抑制剂的情况下,虽然背景辐射检测t0被设定为0%。(一)抑制优降宁只MAO-dependent酪胺的氧化。(b)酚类化合物对酪胺氧化的影响。每个点的均值±SEM 8(抑制剂)12(酚类化合物)匀浆。
3.5。交互与SSAO-Dependent氧化酚类化合物的14C)苄胺

正如预期的那样,苄胺氧化的帽子是氨基脲敏感。添加优降宁和氨基脲不能抑制进一步比氨基脲,根除标签的生成苯甲醛。SSAO-mediated [14较低的C)苄胺氧化保持不变或高剂量的酚类化合物(图6)。作为一个整体,这些数据表明SSAO / VAP-1独特的催化剂参与苄胺氧化、优降宁以及多酚类物质不能防止这种类型的胺代谢。

(一)
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(b)
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图6
酚类化合物的影响,毛对苄胺氧化抑制剂或SSAO抑制剂的帽子。30分钟(a)氧化1毫米的14C)苄胺通过匀浆生成大量的放射性标记苯甲醛萃取分离的材料和所述信号(控制)方法和设定在100%,而0%的与可榨出的放射性t0。参考毛抑制剂(优降宁)或SSAO(氨基脲)抑制剂,单独或合并使用在1毫米,放射性标记底物的前15分钟。(b)显示剂量的白藜芦醇(黑眼圈),紫檀芪(黑色方块),咖啡酸(黑色三角形),或槲皮素(开放广场)和优降宁(黑眼圈)测试1毫米的氧化14C)苄胺在相同条件下抑制剂供参考。每个点是均值±8匀浆的SEM。

图7
化学结构和酚类化合物的作用机制提出Amplex Red-based荧光测定胺氧化酶活动组织筹备工作。测试与给定结构的酚类化合物并不像毛和SSAO脂肪组织的抑制剂,因为只有部分白藜芦醇抑制(14C]酪胺氧化人体皮下脂肪组织。然而,所有这些抑制过氧化氢检测通过阻止氧物种和辣根过氧化物酶反应(合)和阻碍的生成氧化Amplex红色,荧光探针,resorufin。

因此,酚类化合物,抑制benzylamine-induced氟量计信号,有可能阻止H2O2与显色反应混合物(这是如此没有生物材料)和降低荧光读数而不是真正抑制苄胺氧化和随后的H2O2释放。此外,它可以在这里简要提到过SSAO-mediated氧化的14C)苄胺并不改变Amplex红,过氧化物酶,或DMSO剂量用于荧光方法或通过过氧化氢酶甚至H2O2(没有显示)。

总结、白藜芦醇、槲皮素、紫檀芪和咖啡酸实际受损产生过氧化氢的检测没有防止苄胺降解和表现毛泽东抑制剂和SSAO抑制剂只在外表,图的图示7。只有白藜芦醇和槲皮素共享有限的能力来改变部分毛活动中发现帽子匀浆,在0.1到1毫米的剂量,也就是说,在浓度可以作为supranutritional合格。

3.6。计算对接胺氧化酶类的活性部位

进行了计算模拟对接测试的这4种酚类化合物对人类是,缺氧,SSAO。所有这些小的可溶性分子能够方法几乎氧化酶类的催化网站(图8)。


图8
对接构成的白藜芦醇,紫檀芪、槲皮素和咖啡酸在活动网站的人类是缺氧,SSAO。酶、氨基酸残基周围的催化部位显示在灰色和编号,而对于是缺氧,时尚代数余子式所示绿色黄色。SSAO, topaquinone和铜所示绿色和橙色。格林:共晶抑制剂(见部分2)。黄色:独联体白藜芦醇。橙色:反式白藜芦醇。粉色:紫檀芪。紫色:槲皮素。栗色:咖啡酸。π- - - - - -π与浅蓝色虚线相互作用是显著的,而H-bond交互标有黄色虚线。

的情况是,所有的测试人员可以停靠在附近的时尚。可能的芳香π- - - - - -π相互作用与Phe208观察,Phe352 Tyr407, Tyr444。一些H-bonds也之间形成的羟基配体和极性氨基酸Asn181 Tyr197, Tyr444。对接分数计算滑移−−8.300和5.682之间的不同与标准精度方法(SP)和−−11.568和5.563之间(XP)的额外的精度水平。预测活动顺序如下:槲皮素>独联体白藜芦醇>反式白藜芦醇>紫檀芪>咖啡酸,SP和XP。

在缺氧的情况下,我们的计算研究允许添加白藜芦醇的列表没有胺的化合物,但毛共价结合在一个广泛的亲和力:diphenylbutane、金合欢醇,香豆素…等等。的形成π- - - - - -πTyr326交互与芳香环表示,Tyr398, Tyr435;H-bonds被发现与172年半胱氨酸,Tyr188, Tyr435。的骨干氧原子Pro102似乎是一个H-bond数配体受体。分数略高于那些是,因为SP分数范围从9.312−−6.849和XP的分数范围从11.020−−6.997。

关于SSAO,两独联体白藜芦醇和反式白藜芦醇可以停靠进周围的口袋里共晶抑制剂(pyridazinone模拟)虽然很小的成绩,表明有可能绑定位置但不确定,白藜芦醇可以像共价抑制剂。事实上,对称二苯代乙烯的对接,以及其他酚类化合物的测试,建立了相对远离topaquinone和铜离子,酶催化两个强制性的代数余子式。π- - - - - -π堆积相互作用形成以下残留:Phe173, Tyr176, Phe389, Tyr394;H-bonds形成与Asp180 Thr210, Tyr394。骨干Thr467氧原子和氮原子支柱Leu469还可以额外H-bonds形式。对接分数低于那些是缺氧:SP−−6.857和5.156之间的分数不同,得分和XP−−9.261和4.100之间变化。这些实力较弱的分数测试与缺乏抑制多酚在协议(14C)苄胺氧化。

虽然不是所有真正的AO抑制剂,然而,测试了天然酚类化合物可以与毛和SSAO角色的命运因为他们能够修改他们的一个常见的反应产物,即H2O2。因此研究酚类化合物是否调制响应苄胺在人体脂肪细胞。

3.7。酚类化合物和Benzylamine-Stimulated人类脂肪细胞葡萄糖摄取

证实了之前报道胰岛素样苄胺对葡萄糖吸收的影响是很容易检测到在人类脂肪细胞从皮下腹部仓库。图9表明,在人类脂肪细胞,100 nM牛胰岛素刺激基底葡萄糖运输三倍到4倍。在100μM,苄胺部分模仿胰腺荷尔蒙的作用,激活以来己糖平均为25 - 30%的最大吸收胰岛素的效果。然而,这种温和的胰岛素样作用非常显著,证明是依赖胺氧化。事实上,氨基脲,加上优降宁,不修改基底或刺激葡萄糖摄取,而很明显抑制苄胺行动(图9)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图9
酚类化合物的影响、苄胺和胰岛素对葡萄糖运输在人类脂肪细胞。刚分离脂肪细胞孵化了45分钟没有与胰岛素(基底)或100海里(ins)或与苄胺与酚类化合物显示剂量。然后2 dg吸收化验进行10分钟的详细部分2。(a)的封锁苄胺类胰岛素刺激的葡萄糖胺氧化酶抑制剂在人类脂肪细胞的吸收。基底、刺激或benzylamine-stimulated 2 dg吸收测试没有(没有,打开列)或优降宁+氨基脲在1毫米(P + S,黑暗的列)。意味着±SEM 39例。不同于基底独自住在 。不同于单独苄胺 。(b)胰岛素被用作参考的经纪人最大运输刺激,定为100%。苄胺测试仅在1毫米(控制,打开列)或100年的存在μ的酚类化合物。均值±7 SEM观察。不同于单独苄胺 和 。

另一方面,酚类化合物进行了测试在1毫米苄胺刺激脱氧葡萄糖摄取和胰岛素的结果表示为百分数最大刺激(在100 nM引起了三倍到4倍激活基线子集的7个人,人物9)。在100μ米,白藜芦醇,紫檀芪和槲皮素中和1毫米苄胺的影响。没有发现明确的抑制与咖啡酸。酚类化合物虽然没有抑制SSAO活性在帽子,他们可能改变命运的过氧化氢过程中产生SSAO苄胺的活化。我们建议这是防止过氧化氢与细胞内的组件之间的交互,例如磷酸酶,已经报告给调解的行为SSAO基质对葡萄糖载体易位(38]。

因此,当直接应用于人体脂肪细胞,酚类化合物似乎像抗氧化剂防止过氧化氢的行动。不过他们对AO的反应基质受损,尤其是那些依赖于过氧化氢,比如SSAO-mediated激活葡萄糖运输。

4所示。讨论

目前的研究多酚的性质进行样本的人体腹部皮下脂肪仓库。我们证明这个组织选择在接下来的行。大脑包含神经元毛,但其SSAO表达仅限于船舶和脑膜39),而肝脏富含毛也表达了SSAO / VAP-1 [40]。然而,这些组织并非现成的健康志愿者。另一侧,帽子提供宝贵的优点:这被认为是一个手术浪费在获得健康的接受整形手术的患者,可以氧化胺比血液更有效(41]。然而,毛帽子已被证明表达的线粒体,用一个近似的比例是缺氧的80/20 (33,是最富有的组织SSAO / VAP-1 [34]。事实上,SSAO存在细胞表面的脂肪细胞,甚至视为脂肪形成的标志(35,42]。

我们的第一组观察清楚地表明,白藜芦醇和其他酚类化合物阻碍在苄胺氧化生成过氧化氢的检测帽子准备,自然丰富的SSAO / VAP-1 [34]。这些结果通过使用一个方法允许测量毛或SSAO / VAP-1活动,基于荧光检测,Amplex红色氧化resorufin(真正的fluoroprobe)过氧化物酶、过氧化氢的方式取决于期间生成胺氧化(31日]。尽管这样的方法已经被用来与人类脂肪组织准备工作(30.),我们的测试能力的多酚抑制人类毛和SSAO / VAP-1伴随着一个完整的检查针对验证他们是否影响与Amplex Red-based荧光测定。这种验证避免误解的观察到荧光读数,因为大量的天然功能性成分导致了错误的信号,由于未修正的淬火和autofluorescent或抗氧化性能43]。

因此,“老”放射化学测定AO活动(23)解决了矛盾发现荧光方法。用放射性标记底物和测量提取neosynthesized贴上醛后,我们比较的方法能够肯定国家之间的直接交互测试多酚和人类毛或SSAO / VAP-1。利用这种分析方法,酚类化合物无法抑制放射性标记的氧化脱氨基作用[14C)苄胺,这表明他们作为抗氧化剂,而不是真正的SSAO抑制剂(如图7)。白藜芦醇,紫檀芪、槲皮素和咖啡酸不能清晰块AO活动,而他们可以修改的命运的一个产物胺氧化、过氧化氢。这导致的损害之间的交互过氧化氢和荧光分析的显色混合,这可能会被误解为AO抑制。然而,白藜芦醇和其他酚类化合物改变胺氧化酶活动依赖的后果过氧化氢生产帽子,因为他们被削弱的胰岛素样作用苄胺在脂肪细胞葡萄糖摄取。封锁这些SSAO基质的代谢行为已经报道SSAO药理抑制剂和抗氧化剂(过氧化氢酶、防治作用和抗坏血酸)34),但从未对天然酚类化合物。

因此,我们应该抑制SSAO活性的酚类化合物没有实验支持,尽管SSAO / VAP-1明显的剂量依赖性抑制酚类化合物与滥用Amplex Red-based方法。然而,一些陷阱和补充实验呈现无关紧要的快捷方式解释荧光化验。

首先,白藜芦醇和咖啡酸完全抑制benzylamine-induced过氧化氢形成有点令人费解的自引用抑制剂氨基脲本身未能完全废除信号。事实上,当过氧化氢形成以苄胺的存在,选择性药物抑制SSAO叶的改变大约15 - 20%的信号。这个组件可能是独立于SSAO或毛活动,导致基底ROS生产帽子准备,观察到在没有添加胺。类似的自发生成的过氧化氢被报道在小鼠脂肪组织和视为一个基线ROS生产,在NADPH-oxidase部分涉及到44]。这生产代表一个小组件相比,发现在1毫米苄胺治疗。其检测受损,酚类化合物仅是过氧化氢的检测,增加5点μ在化验没有生物材料,甚至检测H2O2由AO激活。

其次,没有观察到抑制SSAO / VAP-1与任何剂量的四个酚类化合物测试,甚至到1毫米,当使用放射化学的方法。后一种确定无疑是更具体的比H2O2SSAO-dependent比例(即以来的化验。,sensitive to semicarbazide by definition) represented 100% of the [14C] -benzylamine-induced响应。显然,没有可能自发释放放射性标记苯甲醛的帽子准备不孵化(14C)苄胺。

过程中检测到重要的是,文物的决心SSAO活动也为毛活动发生,自从明确的酚类化合物抑制过氧化氢信号响应毛时没有完全复制酪胺活动是通过量化评估的放射性标记的最终产品14C]酪胺氧化。只有毛部分抑制被发现白藜芦醇和槲皮素在帽子短期孵化项目,同意他们的码头能力的计算模型是催化部位的缺氧。

因此,我们的观察与先前的报道表明,白藜芦醇是一个宝贵的人类毛抑制剂(2]。事实上,在他们的开创性的观察,Yanez和同事报道,clorgyline和司立吉林1000倍10000倍更有效比白藜芦醇在昆虫细胞组成的人造模型overexpressing重组形式的人类是或缺氧。只与一个相当“历史”MAO-inhibitor, iproniazid,表现出非常贫穷的酶的亲和力与小说相比毛泽东的一代阻滞剂允许考虑抑制由10 - 100μ有关利益[M白藜芦醇2]。因为Amplex红色是受雇于这些研究,可以认为有一个高估的白藜芦醇抑制毛活动的能力。在同一剂量,槲皮素已经报道了抑制是在一个完整的方式,虽然通过peroxidase-based检测过氧化氢的生产,因此可能大幅高估的抑制性能(45]。因此,我们建议,白藜芦醇和槲皮素被认为是缺乏强有力的毛抑制剂,因为它们阻碍(14C]酪胺氧化(主要是催化,主要在人类脂肪细胞)在剂量接近毫克分子比的微摩尔的范围,即水平无法达到的营养摄入。的确,最大血浆白藜芦醇水平估计达到3 - 4μ米1毫克/公斤,摄入后根据免费数据库http://www.phenol-explorer.eu/(28]。然而,重要的是要考虑到一个完整的天然酚类化合物的混合物的可能性可能会有效地降低剂量,由于潜在的协同效应。

很多,如果不是全部,因此白藜芦醇摄入应考虑作为主要的影响独立于毛泽东抑制。这不是不兼容的神经活动的对称二苯代乙烯,因为它提出了神经保护不是毛与抑制,甚至对毛各种抑制剂(9,11]。必须注意,白藜芦醇在这个视图中,也就是说,相对于高度选择性,可逆抑制剂的最新一代毛高度的亲和力,是迄今为止,食品和饮料中的一种天然产品,而不是规定的药物。

我们与放射化学测量方法使用[14C)苄胺明显表明,白藜芦醇不强烈抑制人类SSAO / VAP-1而氨基脲。值得注意的是,氨基脲借鉴封锁我们的化验不再是最好的SSAO抑制剂可用日期;SSAO甚至被更名为伯胺氧化酶,以表明它是更好地定义为其基质(内源性或外源性)而不是由其抑制剂(s) (46]。尽管毫克分子剂量参考抑制剂氨基脲的需要完全减缓SSAO活性,其阻塞作用仍然有选择性,远非复制与酚类化合物进行了测试,至少在放射化学的方法。

我们大部分的计算分析白藜芦醇对接在人类SSAO / VAP-1语无伦次的催化部位药理绑定的高亲和力和显示SSAO几乎可以视为目标酚类化合物。关于毛,因此获得的计算结果与相应的实验值和在协议延长了越来越多的天然分子能够与网站互动功能的人物形象。

演示,酚类化合物阻碍了检测过氧化氢直接添加到荧光测定时,虽然不是优降宁或氨基脲,带来了进一步的证据,不生成过氧化氢催化氧化脱氨基作用期间发生的预防的酚类化合物,而是交互MAO-generated或与显色SSAO-generated过氧化氢混合物。对面,毛和SSAO真正的药理抑制剂受损ROS生成而不是与Amplex红/过氧化物酶的相互作用。此外,验证,一旦过氧化氢完全与显色反应混合物的荧光读数被随后的酚类化合物的测定。这表明,酚类化合物不猝灭荧光而改变命运的过氧化氢,防止其与显色混合用于我们的交互和其他荧光分析(2)或阻碍其在脂肪细胞信使的作用(见下文)。

虽然不是防止(14C)苄胺氧化、槲皮素、紫檀芪和白藜芦醇中和苄胺激活葡萄糖运输在人类脂肪细胞,生物效应之前证明是依赖于过氧化氢(34]。换句话说,酚类化合物的影响不仅与荧光显色检测过氧化氢的混合物,也与其他脂肪细胞组件为未来的研究可能会产生意想不到的后果。关于毛和SSAO活动即将到来的决定和他们的交互与各种“小说”代理应该作为抗氧化剂,假定的交互的验证这些代理与过氧化氢或显色混合应该仔细陪未来的测试。相对于非酶的抗氧化剂摄入的有效性,可以先进,他们可能与古典AO抑制剂的能力改变饮食胺剂量升高的影响,说明这里的相反效果的酚类化合物和苄胺在人体脂肪细胞葡萄糖运输。

在这个视图中,认识到,白藜芦醇和几个SSAO抑制剂强烈antiadipogenic行动47- - - - - -49]。尽管如此,啮齿动物模型的对称二苯代乙烯改善葡萄糖耐量肥胖和糖尿病(50,51),而氨基脲及相关代理降低身体体重增加和肥胖,而不表现出明显的有益影响葡萄糖稳态(52,53]。奇怪的是,一些药物与白藜芦醇的性质被毛和抗糖尿病的抑制剂。这是PPAR的情况下γ催化剂称为glitazones,线粒体的抑制毛属于他们的“偏离”操作的列表(54),连同他们的神经副作用55]。在这条线,glitazones最近描述为毛抑制剂没有SSAO抑制属性(30.]。

5。结论

总而言之,白藜芦醇抑制是活动的能力已被证实在人类形态在人类脂肪细胞成熟主要是自然表达。尽管如此,我们认为这可能抑制一直高估了在不同以前的报告。我们也观察到,白藜芦醇和槲皮素可以停靠到活动网站的人类是缺氧与可接受的分数,发现证实在我们工作的完成药物设计策略的最近的一份报告显示,白藜芦醇的衍生品+香豆素成功设计开发目标脚手架可逆地抑制毛(56]。我们有限的比较有四个天然酚类化合物没有说明生物分子可以比白藜芦醇有益限制氧化应激在实验模型或有助于补充人体营养目标大脑或边缘人物形象。然而,我们比较研究清楚地表明,没有一个直接检测酚类化合物抑制伯胺氧化酶,也叫SSAO / VAP-1。该属性不能被添加到他们的抗氧化作用。然而,饮食酚类化合物可以阻碍氢peroxide-dependent SSAO激活的后果,至少在人类脂肪细胞。因此膳食的共存胺(氧化一旦摄入)或其他抗氧化剂分子出现在食品,饮料,或营养补充剂应该仔细检查。最后,在一个上下文,在这个上下不同的选择性抑制剂SSAO / VAP-1已获得专利的抗炎作用[57,58),可以先进,酚类化合物发挥抗炎作用独立于直接SSAO / VAP-1抑制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者表达感谢的所有成员的财团Trans-Pyrenean调查对肥胖和糖尿病有价值的讨论和基思蒂普敦(爱尔兰都柏林)AO-interacting药物知识和生活的灵丹妙药。作者要感谢整形手术Dpt的员工。Rangueil医院(图卢兹,法国),促进手术后的废物。这项工作在一定程度上是由戴米奥& REFBIO / POLYFrEsNOL项目,学院祝您健康卡洛斯三世(CIBERobn),巴斯克地区政府(- 512 - 13),和巴斯克国家大学(UPV / EHU) (ELDUNANOTEK UFI11/32)。