文摘

的损耗减少谷胱甘肽(GSH)一直在观察病理条件和老化。测定谷胱甘肽在组织使用小鼠模型是一个很好的方法来评估谷胱甘肽耗竭和潜在的治疗功效的药物用于维护和/或恢复细胞的氧化还原电势。高效液相色谱(HPLC)法同时测定谷胱甘肽和半胱氨酸(半胱氨酸)在小鼠器官是根据美国和欧洲标准进行验证。方法是基于分离加上紫外线检测和precolumn衍生化与5、5′-dithiobis——(2-nitrobenzoic酸)(DTNB)。所需的验证参数,选择性、线性、量化的下限,精度、准确性、复苏,和稳定性,研究了脾,淋巴结,胰腺和大脑。结果表明,量化的下限是0.313μM和1.25μ米半胱氨酸、谷胱甘肽。盘中、interday精度小于11%和14%,分别为化合物。平均半胱氨酸、谷胱甘肽的提取回收率从所有的器官分别超过93%和86%,分别。此外,分析物在样品制备和储存稳定性的证明。该方法准确、可靠、一致的和可再生的,有用的决定半胱氨酸、谷胱甘肽在不同品系小鼠的器官。

1。介绍

谷胱甘肽是一种普遍的非蛋白硫醇在动物细胞在有氧细胞和最丰富的抗氧化剂。参与许多细胞功能,如蛋白质和DNA的降解和合成或毒素和致癌物的解毒1]。

谷胱甘肽的耗竭或失衡已经观察到在一些病理条件如神经退行性疾病,囊性纤维化,病毒感染,艾滋病、糖尿病、癌症和老化(2,3]。此外,谷胱甘肽含量起着重要的作用在调节细胞免疫反应(4]。温和的氧化应激条件下,半胱氨酸残基的氧化会导致蛋白质之间的可逆混合二硫的形成硫醇团体和low-molecular-mass硫醇(S-thiolation),特别是在谷胱甘肽(S-glutathionylation)。S-Glutathionylated蛋白质很容易减少自由硫醇组织恢复正常的细胞氧化还原状态时通过减少代理(5]。此外,还原谷胱甘肽水平,细胞可以利用半胱氨酸导致这种氨基酸含量减少(6]。因此,谷胱甘肽和半胱氨酸可能被认为是重要的生物标志物来评估氧化损伤的程度和正确的氧化还原状态补给。开发和验证的简单分析方法测定谷胱甘肽和其他生物样品中的硫醇是一个先决条件获得一个准确的评估氧化损伤的程度以及疾病进展的迹象,因此评价抗氧化剂治疗的有效性(5]。事实上,分子能够增强细胞内谷胱甘肽水平已经被提议作为潜在的治疗一些疾病战斗工具和新的免疫调节方法(7]。因此,确定硫醇状态是重要的理解的基本生化反应细胞在病理条件以及在老化和药物恢复细胞谷胱甘肽体内平衡的能力。

很多方法测量硫醇物种在生物体液和组织样本已经进化(8- - - - - -15]。然而,一些方法已验证根据美国和欧洲标准(9,10]。

我们的目标是验证一个简单而快速的方法,允许同时测定的主要硫醇的物种,如谷胱甘肽和半胱氨酸,老鼠在不同器官利用反相高效液相色谱法(rp)和紫外检测。该方法是基于precolumn与Ellman衍生化试剂(5、5′-dithiobis——(2-nitrobenzoic酸),(DTNB)]这与R-SH反应形成R-TNB导数分离和量化。不同的可用衍生化方法中,硫醇的量化DTNB被选中,因为它被认为是特别简单的和有用的硫醇氧化还原状态的研究和蛋白质glutathionylation [16]。此外,rp方法的优点是可以访问大多数分析实验室,因为他们并不需要昂贵的专用仪器。

的方法证明了良好的质量和性能,并允许确定谷胱甘肽和半胱氨酸在三个品系小鼠的器官(ICR (cd)、BALB / cJ,和C57BL / 6 n小鼠)在临床前研究中常用的。

2。材料和方法

2.1。化学物质

半胱氨酸、谷胱甘肽和DTNB买来Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)。从卡洛Erba乙腈收购(Carlo Erba Reagenti,米兰,意大利)。

2.2。道德声明

住房和治疗老鼠按照指南中建议的实验动物保健和使用由卫生部116年法律,1992年。实验动物实验的伦理委员会批准的乌尔比诺大学的“卡洛博”和Sapienza大学。动物受到二氧化碳的抑制。是尽一切努力来减少动物痛苦和限制使用的动物数量。

2.3。动物

前不久女性ICR (cd)和六个雌性BALB / cJ老鼠从哈伦购买Nossan(意大利米兰),而前不久女性C57BL / 6 n小鼠购自查尔斯河(意大利莱科)。在整个研究中,老鼠被保持在一个温度°C和相对湿度%,12 h光/暗周期和12空气变化/ h。

2.4。高效液相色谱仪器

半胱氨酸、谷胱甘肽在不同器官通过高效液相色谱法进行测定Jasco模型lg - 980 - 02 (S.R.L. Jasco欧洲Cremella (LC)、意大利)。分离进行示踪Teknokroma Excel 120列ODSA 5μ15 m×0.46 (Teknokroma Analitica S.A.,Barcelona, Spain) protected by a Teknokroma Tracer Excel guard column ODS 10 × 3.2 mm (Teknokroma Analitica S.A., Barcelona, Spain). The mobile phase consisted of KH₂阿宝₄解决方案(10毫米,pH值6.0)(缓冲)和缓冲区包含乙腈(60% v / v)(缓冲B)。所有的缓冲准备和pH值调整后解决方案以及标准0.22过滤μm Acrodisc注射器过滤器(笼罩在生命科学,安阿伯市,美国)。洗脱条件如下:10分钟100%缓冲,其次是增加到100%缓冲B在15分钟;这个条件是保持5分钟。梯度在3分钟回到100%的缓冲区,和列与100%再生缓冲区为另一个4分钟前注射下一个样品。流量是1毫升/分钟,注入量是50μL,检测在330海里。分析25°C和定量测量是通过注入已知浓度的标准。

2.5。样品制备

器官(脾、淋巴结、大脑和胰腺)很快被切除的同时(9点。-11点),10 - 20毫克就放入一个包含500年的埃普多夫微型离心管μL沉淀的解决方案(100毫升含有1.67克的冰川偏磷酸,EDTA二钠0.2克,和30克氯化钠)。样品第一次均质通过研磨杵然后用近50瓦10秒钟(b·布劳恩Labsonic U, b·布劳恩生物技术国际);所有这些程序进行了冰。样品被保存在冰10分钟然后在12000×g离心10分钟在4°C。15μL 0.3 Na₂HPO₄被添加到60μ后立即L酸的提取和45μL DTNB被添加。DTNB溶液制备溶解20毫克DTNB柠檬酸钠溶液100毫升的1% (w / v)。混合物在室温下搅拌1分钟(RT),然后在RT另一个5分钟,最后用于,rp -半胱氨酸、谷胱甘肽决心。

2.6。方法验证

验证该方法根据当前接受US-FDA生物分析方法验证指导和欧洲药品局指导生物分析方法验证对选择性、线性、下限的量化(LLOQ)、精密度和准确度,恢复和稳定。器官的方法验证ICR小鼠(cd)。选择性是评估通过比较色谱标准的准备与老鼠的器官。

校准曲线的谷胱甘肽和半胱氨酸通过连续稀释股票的解决方案。标准被稀释在水或沉淀的解决方案用于沉淀器官蛋白质。确切的标准溶液的浓度谷胱甘肽和半胱氨酸通过分光光度计读数(布特勒在412纳米以下描述的过程17]。每个校准曲线的线性决心通过绘制峰面积()与相应的浓度()。LLOQ被定义为最低的校准标准校准曲线上可接受的精度在20%,精度在20%以下。

方法的精密度和准确度进行评估,至少五个复制器官样品分析的掺入了谷胱甘肽和半胱氨酸浓度从低到高的校准曲线。精度是评价在同一分析运行(盘中分析)或至少5天的分析(interday试验),其中一个是在随后的一周。精确定义为相对标准偏差(RSD %),而精度定义为相对误差(%),均不超过15%。

复苏的计算是通过加入已知浓度的谷胱甘肽和半胱氨酸的器官在提交之前的处理步骤的方法,最后每个样本的浓度代表五个度量值的平均值。结果提供测量和理论之间的差异价值观和复苏的百分数表示。

2.7。样品的稳定性

样品的稳定性是由分析器官切除,加工,留给4 h在室温或8 h后在4°C或三个冻融循环。样品稳定性也评估器官切除和冷冻的沉淀的解决方案在−3个月80°C。稳定性样品结果应该在样品中分析物浓度的15%遇到立即处理。

3所示。结果与讨论

选择性、敏感、和验证分析方法定量评价的谷胱甘肽和其他物种硫醇的氧化还原状态的确定是至关重要的实验模型和成功进行临床前和/或临床药理学研究使用分子还原谷胱甘肽水平,可以改变在病理条件下(2,7]。验证分析方法表明一个特定的方法用于定量测定分析物在给定生物矩阵(例如,鼠标器官)是可靠的和可再生的。基本的验证包括以下参数:选择性、灵敏度、准确性、精度、再现性和稳定性。不幸的是,只有少数方法测定谷胱甘肽和半胱氨酸的生物样本的验证(9,10]。在这篇文章中,我们描述一个简单的验证,快速、敏感、产物和具有成本效益的方法同时测定半胱氨酸、谷胱甘肽在不同的老鼠器官根据美国和欧洲的标准,这使它感兴趣的读者可以衡量组织谷胱甘肽。

3.1。选择性

选择性的能力是一种分析方法来区分和量化分析物在样品中的其他组件的存在。半胱氨酸、谷胱甘肽的保留时间和分别为最小值。观察无显著干扰内源性物质的化合物的保留时间进行了研究。图1显示了一个代表性的谷胱甘肽和半胱氨酸标准色谱(a)和小鼠脾脏(b)。其他器官的色谱与脾色谱(数据没有显示)。

3.2。线性和LLOQ

用于校准曲线的标准被稀释在水或沉淀的解决方案用于沉淀器官蛋白质,获得两个可比较的曲线。图2显示了典型的校准曲线,线性范围为半胱氨酸(a)、谷胱甘肽(b)稀释沉淀的解决方案。校正曲线的线性范围为0.313 -50μ-80和1.25μ米半胱氨酸、谷胱甘肽。

半胱氨酸的LLOQ是0.313μM,精密度和准确度都小于8%,在±5%,分别。谷胱甘肽的LLOQ是1.25μ米精度小于11%,精度小于±9%。

3.3。样品的稳定性

硫醇化合物的稳定性在长期存储的组织在脱去蛋白质的蛋白质沉淀缓冲或组织匀浆是一种可靠的分析在实验设置的先决条件。稳定性评价样本存储在不同条件下节中描述2。获得的结果显示,没有显著差异峰地区的半胱氨酸、谷胱甘肽展示这些硫醇物种的高稳定性和样品制备的有效性协议在预防他们的转换(表1)。第一列中的值是指器官离开沉浸在蛋白质沉淀的解决方案。在第二、第三和第四列值被称为脱去蛋白质的器官匀浆(RT:室温)。值均值±5动物的SD /器官。立即稳定已与样本相同的样品处理和分析。

3.4。精度、准确性和复苏

精度分析方法描述了亲密的意思是测试结果的方法到实际的分析物的浓度,而精确描述个人的亲密措施的分析物,当应用程序重复单一样本。

复苏的分析物在分析探测器响应从分析物的量添加到和从生物中提取矩阵(鼠标器官),探测器响应相比获得的真实浓度分析物在溶剂。

我们评估的精度、准确性和恢复整个方法通过分析组织样本中掺入40μ米,20μ米,或2.5μ半胱氨酸或60μ米,20μ米,或5μ谷胱甘肽的M。每个浓度测试五次,测定的数据如表所示2。所有测试样本的结果在15%以内,满足可接受的标准。特别是,在所有组织样本,盘中精度()小于11%,而interday精度(对硫醇)不到14%的物种。

的精度分析样本对硫醇不到9%的物种,除了大脑中掺入5μ米的谷胱甘肽在这种情况下,它是低于14%,表明发达方法是准确和可靠的。

复苏,飙升的浓度预测的样本被表示为一个百分比浓度,计算为添加浓度和内生的和未加料的样品中的分析物的水平。意思是提取复苏()在所有器官样本的93%和90%半胱氨酸、谷胱甘肽,分别,除了大脑中掺入了5μ米的谷胱甘肽回收率为86%以上。这些结果表明,两种分析物的回收率是一致的和可再生的,相比其他HPLC-UV方法用于半胱氨酸、谷胱甘肽测定生物体液(10),对硫醇物种得到更高的复苏。该方法的另一个优点是由使用DTNB derivatizing代理要求更短的衍生化时间。半胱氨酸、谷胱甘肽也量化组织标本由色谱系统配备荧光检测器(9),但高效液相色谱紫外检测器属于标准的仪器分析实验室不需要特别昂贵的维修。

3.5。半胱氨酸、谷胱甘肽测定不同品系小鼠的器官

验证方法已成功应用于确定中半胱氨酸、谷胱甘肽浓度脾、淋巴结,胰腺,和大脑的ICR (cd)、BALB / cJ, C57BL / 6 n小鼠。报告的数据图3显示类似内容的谷胱甘肽(右)在脾(a),胰腺(c),和大脑(d)的压力,而谷胱甘肽的含量低于被发现的淋巴结(b) BALB / cJ。半胱氨酸的浓度(左)在胰腺脾(a)和(c)较低的压力比其他的;此外,大脑是半胱氨酸化验,但它并不是唯一一个淋巴结中发现(d)和样品检测(b)。这可能是由于这两个器官的低浓度的半胱氨酸BALB / Cj老鼠;此外,我们可以观察到,在这株半胱氨酸水平较低的其他菌株相比,即使测量LLOQ之上。该方法的适用性评估通过分析谷胱甘肽和半胱氨酸的其他老鼠的器官如肝、肾、肺和心脏(补充表在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/1746985)以及GSH-replenishing分子的分析确定了其中包含sh组显然区别于谷胱甘肽和半胱氨酸18]。

这些数据提供可靠的参考测量谷胱甘肽和半胱氨酸在脾脏、淋巴结,胰腺,大脑的三个鼠标菌株广泛应用于临床前研究。特别是调查的数据报道是一种宝贵的资源在调制几个细胞内谷胱甘肽的作用过程,从氧化损伤免疫反应,以及药物和有毒化合物对谷胱甘肽代谢的影响。

4所示。结论

结果从产物的验证方法在此描述表明,该方法是准确的,可靠的,一致的和可再生的。此外,开发的样品制备和提取过程允许高半胱氨酸、谷胱甘肽的稳定性样品防止他们的转换。当前方法的主要优点是验证、高恢复,简单起见,短的衍生化时间和分析成本低。因此,此方法特别适合可靠的常规测量硫醇在老鼠的器官,它可以用于所有的动物模型模拟人类疾病的特点是谷胱甘肽研究疾病过程和发展不平衡疗法包括GSH-based抗氧化治疗。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的主要(研究项目的国家利益)2010 - 2011 -普罗特。2010年pht9nf_004授予a . Fraternale普林斯顿(研究项目的国家利益)2010 - 2011 -普罗特。2010 pht9nf_005授予l . Nencioni,彩球01 - 01802授予a . t . Palamara。作者要感谢教授蒂莫西·c·布鲁姆语言学论文的修改。

补充材料