文摘

许多团体的革兰氏阴性细菌引起的疾病的有害的羊。toll样受体4 (TLR4)检测是至关重要的革兰氏阴性细菌的先天免疫系统,激活了脂多糖(LPS)启动炎症反应和氧化应激。氧化中间体是必不可少的催化剂的氧化应激,低水平的自由基形成压力的氧化环境,可以清除入侵的病原体。没有氧化中间和一代是由一氧化氮合酶(间接宾语)。三磷酸鸟苷cyclohydrolase (GCHI)的病原反应酶四氢生物蝶呤(BH4)合成,这对诱导伊诺的生产是至关重要的。以前,我们做了向量过度表现羊TLR4基因。,第一代(G1)的转基因羊与LPS刺激在活的有机体内和在体外氧化应激和GCHI表达式进行调查。氧化损伤引起的TLR4过度严格监管的组织。然而,转基因(Tg)集团仍然分泌一氧化氮(NO)在伊诺抑制剂补充道。此外,GCHI表达式保持调节血清和单核细胞/巨噬细胞。因此,超表达转基因羊的TLR4可能加快入侵微生物的间隙通过没有LPS刺激后一代。此外,TLR4过度也增强了GCHI激活。

1。介绍

在宿主防御和炎症,单核细胞/巨噬细胞是免疫细胞激活最突出的脂多糖(LPS)释放各种支持和抗炎介质。toll样受体4 (TLR4)与一些蛋白质相互作用形成了骨髓分化因子2 (MD2) / CD14 / TLR4复杂,结合有限合伙人(1]。TLR4然后新兵下游适配器激活的骨髓分化主要响应基因88 (MyD88)和TIR-domain-containing adaptor-inducing干扰素-β(TRIF)依赖的途径,通过核函数的因素-κB - (NF -κB -)信号事件相关2]。这些蛋白质的行为引发氧化中间体的释放,包括活性氧(ROS),活性氮物种(RNS)和细胞因子(3]。除了炎症反应,氧化中间体也参与许多病理过程,如胰岛素抵抗和2型糖尿病4]。他们为细胞内环境是极其重要的。保持生理稳态,ROS足够维持在一定水平诱导氧化应激消除病原微生物。然而,大量的氧化中间体和衍生品既能破坏细菌的细胞膜,导致宿主组织损伤。

ROS主要是由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶。NADPH氧化酶是multisubunit酶复杂。当电子跨膜运输,膜去极化的。这些变化导致补偿离子通量。NADPH氧化酶有专业领域的歧化作用和H₂O₂生产(5]。NAPDH氧化酶激活是非常受细胞因子产生回应TLR4通路的激活。Interleukin-1 receptor-associated kinase-4 (IRAK-4),监管激酶,下游TLR4信号,通过p47的磷酸化调节NADPH氧化酶^phox(6]。肿瘤坏死因子-α(TNF -α)提高通过NF - NADPH氧化酶的活性κB途径移植mRNA表达水平编码gp91的成绩单^phox(7]。NF -κB激活是由TLR4与Nox4 Nox2的直接交互,两单元NAPDH氧化酶(8,9]。

没有是RNS的主要组成部分。在单核巨噬细胞,诱导一氧化氮合酶(间接宾语)病原反应酶的合成。随着NAPDH, O₂和四氢生物蝶呤(BH4),没有从精氨酸合成的酶伊诺。伊诺的炎症反应,转录调控的NF -κB和MAPK通路。增加下游水平的因素,如interleukin-1 (il - 1)、肿瘤坏死因子-α和移行细胞(IFN -γ),导致增加伊诺表达式(10]。

伊诺的另一个重要的酶新创生物合成是BH4。BH4缺乏症导致减少伊诺解偶联。BH4的病原反应酶是三磷酸鸟苷cyclohydrolase,由GCHI编码(11]。伊诺GCHI是重要的激活和各种病理过程密切相关,如vasofunctional干扰和运动障碍12]。

先天免疫防御的主要类型是革兰氏阴性细菌感染。TLR4参与先天免疫在各个方面,不仅是在抵抗革兰氏阴性细菌感染,而且在许多自身免疫和炎性疾病的设置,包括动脉粥样硬化、糖尿病、癌症和风湿性关节炎。之前的研究表明,有限合伙人的易感性或TLR4-mutant细胞的敏感性是低于野生型细胞(13,14]。此外,TLR4-deficient老鼠与LPS刺激不能分泌il - 1和il - 12 (15和也显示il - 6的表达16]。然而,TLR4在老鼠身上过度导致增加抗病性(17]。我们之前报道的生成TLR4-transgenic羊(18]。细菌的影响灵敏度的抗病转基因动物是依赖转基因拷贝数(19]。值得注意的是,过度的炎症和氧化应激可引起组织损伤(20.]。为了更好地理解角色的生物学基础的过表达TLR4免疫反应和氧化应激,我们孤立的外周血单核细胞/巨噬细胞从第一代(G1)转基因羊和两个转基因拷贝与LPS刺激他们。Immunoactivity和氧化损伤进行调查。此外,我们添加了伊诺和NADPH氧化酶抑制剂LPS-stimulated单核细胞/巨噬细胞TLR4和氧化应激之间的关系研究。在此,我们首先表明TLR4促进没有合成的超表达上调GCHI表达式在羊单核细胞/巨噬细胞在氧化应激条件下。先天免疫反应和氧化应激在TLR4-transgenic羊被严格监管。

2。材料和方法

2.1。道德声明

人工授精、intradermic注入和采血进行在中国农业大学试验站,整个过程是严格按照协议批准中国农业大学动物福利委员会(许可证号码:XK662)。

2.2。筛选转基因羊Overexpressing TLR4

从TLR4-transgenic绵羊基因组DNA提取精子和623 - bp片段放大了一对引物如下:向前,TAC GGT AAA CTG CCC TG行动;相反,ACC TGG AGA AGT答GGC TG。在交配季节,自然发情母羊的受精和精子从积极的羊。的转基因后代的存在被南方印迹分析。我们使用聚合酶链反应(PCR)来生成特定digoxigenin-labeled探针(罗氏诊断,曼海姆,德国)使用上面的引物序列表示。从耳朵组织基因组DNA分离和消化VspI和SmaI(美国内,贝弗利,MA)。

外周血单核细胞被孤立的G1转基因羊羊用淋巴细胞分离介质(TBD,天津,中国)。总RNA提取。信使rna的丰度TLR4实时PCR、基因用SYBR绿色装备(Tiangen,中国)以下引物:TLR4-forward, CTG AAT CTCTAC AAA ATC CC;甘氨胆酸TLR4-reverse, CTT AAT TTC TCT GGA助教;β甘氨胆酸-actin-forward, AGA TGT GGA柠檬酸AGC AG);β-actin-reverse, CCA ATC柠檬酸TCT CGT TTT公司。TLR4蛋白质含量测定的酶联免疫吸附试验(ELISA);中国上海,上海鑫勒)。

外周血收集血常规和血清生化参数测试的120天。测试包括分析红细胞、白细胞、血红蛋白、白蛋白、球蛋白、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、血糖、血尿素氮和血清总蛋白浓度。

2.3。检测急性炎症反应的G1转基因羊在活的有机体内

五个三的耳朵transgene-positive羊注射100μL 3毫克/毫升有限合伙人(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国);然后组织收集1 8和48 h。样本与4%多聚甲醛固定石蜡和嵌入。苏木精和伊红染色法被用来研究炎性反应和免疫组织化学是用来检测MD2蛋白表达(Abcam,剑桥,英国)。外周血也收集在1、4、8和48 h。RNA分离单核细胞和实时PCR用于检测的表达TLR4,CD14,NF -κB。引物序列如下:TLR4:如上;CD14-forward, ATA TCT AGC ACG创新艺人经纪公司公司治理文化;CD14-reverse, CTT GGT CGG CAG TTT移行细胞癌;NF -κ太极拳AAA B-forward, TTC TGG CTG亚美大陆煤层气有限公司侠盗猎车手;NF -κB-reverse, TTG TTT GAG GGC猫亚美大陆煤层气有限公司手枪。ELISA试剂盒用于检测TLR4、GCHI,和各种细胞因子,包括干扰素-γ肿瘤坏死因子-α、il - 6、引发、血清中il - 12、il - 10(上海鑫勒)。

2.4。氧化应激在LPS-Stimulated羊单核细胞

羊在RM1640分离、培养外周血单核细胞(美国纽约Gibco,大岛)中含10%胎牛血清(Gibco) 48 h。与LPS刺激后(1μg / mL),收集细胞悬浊液0,1,8,48 h。伊诺和NADPH氧化酶的活动,以及ROS, RNS,和malonaldehyde (MDA)内容的细胞,用分光光度计检测(南京建成生物工程研究所、南京、中国)。GCHI的活动是由一个酶的方法检查(南京建成生物工程研究所)。1 h与LPS刺激后,4%多聚甲醛被用来修复细胞;然后利用免疫荧光检测蛋白质氧化产品。硫氧还蛋白-(硫氧还蛋白-)TRITC (Abcam)和TLR4-FITC (Abcam)是用于检测蛋白表达的变化,和DAPI用于复染色细胞核。共焦显微镜是用来检测染色结果。

NADPH氧化酶和伊诺抑制剂添加了单核细胞/巨噬细胞在刺激1μg / mL有限合伙人研究TLR4和氧化损伤之间的关系。Apocynin (Sigma-Aldrich) NADPH氧化酶的抑制剂,抑制生产。Nitro-L-arginine (L-NNA) (Sigma-Aldrich)是伊诺的抑制剂,抑制生产的。使用抑制剂浓度的10和20更易/ L。TLR4抑制剂,anti-TLR4抗体,被添加到Tg集团文化传媒的稀释1:500。1小时后,收集细胞悬浊液。没有,分光光度法测定,MDA浓度是根据制造商的指示(南京建成生物工程研究所)。

2.5。统计分析

所有的实验都重复3次。受到所有数据方差分析统计分析系统的使用的漠视,过程(SAS研究所卡里、数控、美国)。所有数据都表示为±SEM。差异被认为是重要的时候。

3所示。结果

3.1。超表达TLR4的G1转基因羊

我们以前生成的转基因羊使用显微镜下注射技术。转基因绵羊有两个集成到生殖细胞TLR4副本,由PCR(图1(一))。人工授精当时用于传播的羊。印迹检测表明,G1羊外生TLR4(图)阳性1 (b))。实时PCR和ELISA进行确定TLR4的表达水平。在Tg羊TLR4的表达明显高于在WT羊(数字1 (c)和1 (d))。没有统计上显著的差异分析的常规血液计数或血清生化参数之间的转基因和WT羊120天(数字1 (e)和1 (f))。

3.2。TLR4超表达在G1 Tg羊引发快速中性粒细胞浸润

有限合伙人的耳朵注入转基因绵羊和由此产生的炎性浸润后光学显微镜下观察到的苏木精和伊红染色(图2(一个))。Tg集团很多分段中性粒细胞渗透真皮1 h, 8 h后更多的炎症细胞,包括许多中性粒细胞,已渗透真皮与许多红细胞渗透到结缔组织。减少炎症细胞观察在刺激后48 h Tg的动物。这一发现表明,Tg动物的炎症反应是负面反馈循环的监管,以避免炎症损伤。然而,没有明显的病变观察后48 h。WT组,真皮出血发生炎性细胞浸润在1 h。8 h后,许多红细胞在表面的分布情况之间的皮肤和结缔组织,和许多neutrophils-had渗透到血管周围炎症细胞。48 h后一些炎性细胞浸润明显。利用免疫组织化学观察MD2蛋白表达。MD2-positive组织显示棕黄色,这主要是由皮脂腺细胞表达和浸润炎症细胞(图2 (b))。

实时PCR表明CD14和TLR4转录在8 h达到了顶峰。相比之下,TLR4转录WT组(数字继续上升2 (c)和2 (e))。以上研究结果表明,在8 h, Tg集团的炎症反应是比的WT组。48小时后,Tg集团已经完成的炎症反应,而炎症反应的WT组仍在进步,表明Tg羊可以启动炎症反应更快。TLR4下游的转录因子NF -κB在Tg组也显著高于WT组1和8 h(图2 (d))。这些结果表明超表达的TLR4基因可能引发快速中性粒细胞浸润。

3.3。超表达TLR4增强氧化应激的羊单核细胞/巨噬细胞

与LPS刺激后,ROS Tg集团表达增加与WT组相比有显著差异明显1和8 h ()。相比之下,ROS是最大的表达在WT组(图48 h3(一个))。与WT组相比,RNS的表达也显著高于在1 h Tg集团();然而,在48 h组之间没有显著差异(图3 (b))。Tg集团,ROS / RNS的释放增加,表明超表达TLR4可能上调ROS / RNS的表达,诱导单核细胞/巨噬细胞更强的氧化应激反应。MDA的表达也表现出显著差异在1和8 h (Tg和WT组之间),这表明超表达TLR4的单核细胞/巨噬细胞增强氧化损伤。然而,在48 h, MDA Tg的表情恢复正常水平组(图3 (c))。硫氧还蛋白的表达蛋白在单核细胞/巨噬细胞1 h与LPS刺激后被免疫荧光评估。与WT组相比,表达TLR4和硫氧还蛋白的蛋白质组Tg和氧化损伤的程度更强(图3 (d))。

3.4。TLR4-Mediated氧化应激引发的单核细胞/巨噬细胞分泌

在活的有机体内,没有,主要是单核巨噬细胞释放的。TLR4调节NADPH氧化酶的表达,进气阀打开,apocynin, NADPH氧化酶的抑制剂,可以抑制的释放。此外,L-NNA,伊诺的抑制剂,可以抑制没有生产。单核细胞/巨噬细胞刺激了1μ10 g / mL有限合伙人,更易与L apocynin和/或添加了L-NNA抑制NADPH氧化酶的表达和进气阀打开,分别。的细胞含量那时,不,和MDA(数据决定4(一),4 (b),4 (c))。我们的研究结果显示,没有增加的表达LPS-stimulated Tg集团10 L L-NNA更易处理,而的表达是减少了。NADPH氧化酶的表达被抑制LPS-stimulated Tg集团10 L apocynin更易浓度也降低。表达的不,Tg集团与抑制剂的差异更重要比Tg集团没有抑制剂()。然后,20更易与L L-NNA添加(数字4 (d),4 (e),4 (f)),这抑制了伊诺的表达式。Tg组中,表达的也是抑制,的内容减少,没有强烈的氧化损伤。尽管20更易与L apocynin抑制NADPH氧化酶的表达的内容并没有减少,还分泌的Tg集团。与控制相比,MDA Tg组的表达明显不同()。这些数据表明TLR4诱导氧化应激通过促进释放单核细胞/巨噬细胞。

3.5。TLR4 Upregulation羊GCHI活化的单核细胞/巨噬细胞和血清

在Tg集团与LPS刺激的巨噬细胞,NADPH氧化酶的表达和伊诺明显大于1和8 h (WT组的),但在48小时回到正常水平(数字5(一个)和5 (b))。这一发现表明TLR4可能调节NADPH氧化酶的表达和进气阀打开。GCHI扮演着一个重要的角色在伊诺的规定表达。GCHI Tg组的表达也显著高于1和8 h ()并返回到正常水平在48 h,类似于伊诺(图5 (c))。这些发现表明TLR4增强了活动的伊诺上调GCHI促进合成和分泌。血清中,在急性炎症反应,TLR4的表达蛋白质组1和8 h之间明显不同()。此外,在48 h Tg集团减毒TLR4的表达,而TLR4表达WT组继续增加(图5 (d))。我们发现促炎细胞因子的下游TLR4在不同时间点,干扰素-γ(1 h)、肿瘤坏死因子-α(1 h) il - 6(8小时),il - 12(8小时),并引发(8小时),和抗炎细胞因子il - 10(48小时),Tg和WT组之间的所有显示显著差异(;图5 (e))。这一发现表明,过度的TLR4基因绵羊能促进下游炎性细胞因子的表达,诱导炎症反应迅速。GCHI蛋白质的表达水平的血清Tg集团在WT组显著高于4,8,48 h (;图5 (f))。这一发现表明TLR4调节下游GCHI通过炎性细胞因子的表达。

4所示。讨论

动物病原微生物入侵时,TLR4信号通路被激活并触发一连串的反应,促进生产和释放炎性细胞因子,诱导粒细胞和巨噬细胞的趋化现象的聚合,毛细血管通透性增加,淋巴细胞浸润。TLR4信号转导通路参与许多不同的疾病(21- - - - - -23]。当前研究TLR4信号集中在传染性疾病、肺感染、癌症、2型糖尿病和脓毒症(24,25]。激活TLR4有利于消除外源性病原体。TLR4活化剂,BCG(杆菌Calmette、吉林),被用于膀胱癌治疗触发细胞因子的生产能力,提高免疫反应(26]。TLR4诱发大量的细胞因子释放,也观察到胰岛素抵抗。通过这些preinflammatory激酶和ROS, TLR4直接压制胰岛素作用[27]。当前的研究报告的生成TLR4-transgenic与稳定的转基因羊的传播。我们已经表明TLR4是过表达在RNA水平和蛋白水平。超表达TLR4的没有任何有害影响动物健康。有限合伙人所引发的急性炎症反应的结果表明,过度的TLR4基因诱导中性粒细胞的快速渗透。因此,TLR4可以移植的细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子-α干扰素-γ、il - 6、引发、il - 12、il - 10,从而增加抵抗病原体入侵和感染。

作为一种重要的免疫受体TLR4在氧化应激中起着核心作用。氧化的研究在小鼠肺损伤的目标删除多个炎症,免疫,抗氧化剂表明TLR4基因是一个重要的候选人oxidative-stimulated炎症相关基因(28,29日]。TLR4可能引发伊诺基因的转录和促进生产的。的主要功能没有被生产过氧化物酶和超氧化物自由基清除病原菌(30.]。ROS主要由NADPH氧化酶的活动是由TLR4通过NADPH multisubunit酶的组成复杂。活性氧可以氧化伊诺代数余子式BH4,减少BH4的表达,导致解偶联伊诺形成更多。ROS产生的条件下线粒体NADPH氧化酶的解偶联,当身体受到氧化应激刺激。活性氧可以诱导NF -κB激活和移植细胞因子诱导伊诺基因,导致过度释放没有(31日]。当没有的水平高于ROS,没有可以清除ROS。目前,NOS解偶联被认为发挥重要作用诱导的氧化应激(32,33]。在目前的研究中,没有表达TLR4-overexpressing细胞与LPS刺激,即使NADPH氧化酶是补充道。这一发现表明,在羊单核巨噬细胞,TLR4的分泌促进没有通过调节进气阀打开表达式。同样的,当没有和生产了NOS-transfected细胞,iNOS-specific抑制剂可以大大减少生产(34]。我们的结果符合该L-NNA抑制伊诺的表达,减少的表达。TLR4超表达也可以防止氧化应激(35),不可以清楚(36]。TLR4诱发的表达没有被移植进气阀打开,也没有引起许多基因的表达,可以减少氧化应激并帮助细胞抵抗伤害(37]。目前的研究表明,TLR4-overexpressing羊可以更有效地减少氧化损伤。

GCHI BH4病原反应酶的生物合成。BH4 NOS的重要辅助因子。当BH4的生产是有限的,耦合的O₂和精氨酸减少,导致增加催化NOS和没有增加。最近的研究表明,减少BH4与高血压、动脉硬化、糖尿病、心脏肥大和心肌缺血38,39]。酒井等人发现,磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K)抑制剂可以抑制刺激巨噬细胞的合成没有有限合伙人,而合成的和激活在PI3K-deficient GCHI既可以抑制巨噬细胞(40]。与细胞因子刺激后(IFN -γ或肿瘤坏死因子-α)或有限合伙人,伊诺的表达显著增加,导致合成的增加,直接关系造成的增加合成BH4 GCHI基因激活(41]。GCHI-transgenic老鼠与LPS刺激的一项研究显示,大大提高了肾伊诺和没有内容的表达(42]。GCHI抑制剂可以明显抑制LPS引起的生产没有(43]。有限合伙人与巨噬细胞TLR4结合并激活下游信号通路,包括NF -κB,增殖蛋白激酶(MAPK)和PI3K。这些信号通路可促进巨噬细胞释放细胞因子,包括干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。我们使用LPS刺激转基因羊overexpressing TLR4的急性炎症模型。TLR4过度在活的有机体内可以提高下游炎症因子和GCHI的表情。这一发现表明TLR4通过下游炎症因素调节GCHI表达式。在内皮细胞,GCHI超表达可以提高10倍BH4的生产,同时在不显著增加(44]。超表达转基因小鼠的GCHI内皮细胞可能会减少明显,减少过氧化物的生产,而生物利用度没有很好维护GCHI-transgenic老鼠(45]。我们的研究结果表明TLR4可能上调NADPH氧化酶的表达和伊诺在单核巨噬细胞。Tg细胞分泌刺激有限合伙人+伊诺抑制剂仍不,和GCHI表达的调节。这些发现表明TLR4增强了活动的伊诺上调GCHI,然后促进合成和分泌的。

总之,这些实验文档,TLR4的小说超表达转基因羊增强氧化应激,TLR4-induced氧化应激引起的。TLR4及其下游信号通路激活的扮演重要角色GCHI表达式。这项研究提供了有价值的见解氧化羊革兰氏阴性细菌感染所引起的疾病。

利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

Shoulong邓、坤舆兴丽安、李宁、刘Yixun构思和设计实验。Shoulong邓,Guoshi刘、张金龙和行内张完成了实验。Shoulong邓,坤舆兴丽安分析数据。Zhixian Wang Yuchang姚明,和兴联试剂/材料/分析工具。坤舆Shoulong邓,Baolu张写了论文。Shoulong邓小平和坤舆同样这项工作。

确认

这项工作是支持由国家转基因生物繁殖大项目(2013 zx08008 - 005)和中国高校科学基金(2014 bh032)。