高剂量聚合血红蛋白未能缓解心肌缺血/再灌注损伤诱导的氧化损伤冠状动脉

文摘

客观的。缺血/再灌注(I / R)损伤是不可避免的事件对患者在心脏手术体外循环(CPB)。本研究旨在探讨是否glutaraldehyde-polymerized紫河车血红蛋白(PolyPHb) hemoglobin-based氧载体(HBOC),可以保护心脏免受CPB-induced I / R损伤与否和阐明底层机制。方法和结果。一个标准的狗CPB模型与心脏骤停两个小时和两个小时再灌注。结果表明,低剂量PolyPHb (0.1%, w / v)提供了一个重要的保护心脏I / R,而高剂量PolyPHb (3%, w / v)不具有保护作用,可以在受损的心脏功能,降低心肌氧利用率,提高酶释放和病理变化。进一步的研究表明,接触孤立的冠状动脉或人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)高剂量PolyPHb endothelium-dependent放松受损引起的,这是有增加活性氧(ROS)生产、超氧化物歧化酶(SOD)活性降低,升高malonaldehyde (MDA)的形成。与氧化应激增加,一致NAD (P) H氧化酶活动和亚基表达,包括,,和Nox1极大地调节。结论。高剂量PolyPHb未能保护心脏免受CPB-induced I / R损伤,是由于生产过剩的NAD (P) H oxidase-induced ROS和合成内皮功能障碍。

1。介绍

缺血/再灌注(I / R)损伤对心血管系统有害和负责心脏梗塞,这被认为是参与缺血性心脏病的严重程度和结果(1]。对于这些患者,经皮介入或外科手术体外循环(CPB)通常是用来实现冠状动脉血管再生,但血管再生和心脏骤停在体外循环可能导致心肌I / R损伤(2]。因此,I / R损伤的死亡和预后不良的主要原因是病人在心脏手术和移植。

Hemoglobin-based氧载体体)红细胞代用品开发超过三十年(3]。我们之前的工作和其他的研究表明,是很有前途的候选人,以防止许多器官处在于I / R损伤(4- - - - - -7]。功能上,他们允许交付更多的氧气(O₂)缺氧组织由于其高O₂亲和力、低粘度和平均直径小于人类红细胞。机械的研究表明,这种效应与衰减的心肌细胞凋亡,氧化应激,nitroso-redox不平衡(8,9]。然而,这种保护没有被观察到在临床的设置。等一个荟萃分析纳塔松写。10]表明,这些患者接受HBOC有统计上增加死亡和心肌梗死的风险。为了解决这个差异,本研究采用一个更临床相关动物心脏,以调查model-dog glutaraldehyde-polymerized人类胎盘的影响血红蛋白(PolyPHb)不同剂量对心脏I / R损伤。

2。材料和方法

所有动物实验程序依法进行的政策四川大学动物保健和使用委员会和符合指导实验室动物保健和使用的由美国国立卫生研究院(NIH出版物编号为85 - 23,1996年修订)。

2.1。制备Hemoglobin-Based氧载体

PolyPHb HBOC在中国开发,准备与一些修改(先前报道11]。简单,净化和病毒灭活的新鲜人的胎盘血红蛋白与bis (3 5-dibromosalicyl)延胡索酸酯改性来实现最优O₂亲和力。与戊二醛交联后,混合物受到超滤和分子筛层析法。在被使用之前,PolyPHb是圣托马斯的溶液混合(STS)的最终浓度0.1迷奸/ dL或3迷奸/ dL然后平衡O为95%₂和5%的公司₂在37°C,持续15分钟。

2.2。狗心肺旁路模式

一只小猎犬狗心肺分流术(CPB)模型建立了如前所述[12]。总之,8 - 10公斤,成年雄性小猎犬的狗。异丙酚诱导后(4毫克/公斤,0.1毫克/公斤咪达唑仑,和5μ克/公斤芬太尼)和肌肉放松(1毫克/公斤scoline),所有的狗都是插管Fr。7.5气管内管和机械通风使用空气/ O₂混合物(1:4)潮汐卷10毫升/公斤(Datex-Ohmeda Excel 210、Soma技术、柴郡,康涅狄格,美国)。每一组连续输注芬太尼的0.3μ克/公斤/分钟,维库溴铵在0.2毫克/公斤/小时手术。麻醉维持150年μ克/公斤/分钟异丙酚。心脏通过mid-sternal切口暴露和肝素化后(3毫克/公斤),升主动脉和右心房附件是插管。滚动的缅共电路由泵(StOckert II,德国慕尼黑),膜氧合器(1500毫升/分钟,Kewei医疗有限公司,广东,中国),和一个动脉滤器(Kewei医药有限公司)。CPB是影射与乳酸林格氏溶液含有5%碳酸氢钠(10毫升/ L), 20%甘露醇(2.5毫升/ L),呋喃苯胺酸(0.5 - -1.0 mg / L),地塞米松(5 mg / L),肝素(10 mg / L), 10%氯化钾(5毫升/ L)。同时,10%的葡萄糖酸钙每30分钟(2 - 4毫升)添加了4次。

2.3。试验协议

实验协议是示意图见图1。20只成年雄性小猎犬的狗被分为4组():虚假的集团,I / R组,0.1% PolyPHb组,3% PolyPHb组。除了虚假的集团,心在其他3组主动脉内注入被捕的40毫升/公斤STS (I / R组),STS 0.1迷奸/ dL PolyPHb PolyPHb组(0.1%),或与3迷奸/ dL PolyPHb STS (3% PolyPHb集团)。2小时的心脏骤停后,心被主动脉declamping reperfused 2小时。心中没有心脏骤停和再灌注被分配到虚假的组。实验结束后,所有的狗都牺牲了静脉丸注射戊巴比妥钠(120毫克/公斤)。

2.4。血流动力学参数的测量

水乳胶气球连接到压力传感器(模型SP844;MEMSCAP Inc .、杜伦、数控)插入到左心室(LV)通过二尖瓣。然后,心脏功能参数包括心率(HR)、LV收缩压(LVSP),收集和LV舒张末期压(LVEDP)由PowerLab数据采集系统(ADInstruments企业,Bella Vista,新南威尔士、澳大利亚)。Swan-Ganz漂浮导管(7号,爱德华兹实验室、欧文、钙、美国)通过股静脉插入和先进的肺动脉测量心输出量(CO)、肺动脉楔压(PAWP),肺动脉压(PAP)、中心静脉压(CVP)。平均动脉压(MAP)是由聚乙烯监测导管放置在左股动脉。

2.5。计算心脏啊₂利用

动脉和冠状静脉窦的血液样本被收集。评估水平的心脏啊₂利用率,心脏啊₂消费(签证官₂)和阿₂提取指数(O₂EI)计算值的有限公司,血红蛋白浓度(Hb)、动脉O₂分压(PaO₂),静脉阿₂分压(PvO₂),动脉O₂饱和度(圣₂),静脉O₂饱和度(动宾₂)(ABL800 FLEX血气分析仪、辐射计医疗/ S,哥本哈根,丹麦)通过使用以下公式:

2.6。测定心肌酶的释放

心肌坏死估计的版本的肌酸kinase-MB(水平)、乳酸脱氢酶(LDH)和心脏后简单(cTnI)等离子体测量如前所述[8]。

2.7。测量血管反应性的分离容器环

动脉环(3 - 4毫米的长度)小猎犬狗冠状动脉,自由的脂肪和结缔组织,安装两个不锈钢鱼钩在器官浴室(西班牙巴塞罗那PanLab系统、哈佛装置)。每个室包含10毫升Krebs-Henseleit (KH)解决方案(4.7毫米118毫米氯化钠,氯化钾,1.2毫米KH₂阿宝₄,1.2毫米MgSO₄,1.77毫米CaCl₂25毫米NaHCO₃,11.4毫米葡萄糖;pH值7.4,37°C)和充气连续95% O₂和5%的公司₂。是特别注意在准备以避免损坏内皮。60分钟的平衡期间,静息张力3.5 g的定期调整和KH的解决方案是改变每30分钟。动脉可行性检查通过稳定的和可再生的收缩的氯化钾(氯化钾,60毫米)。简约的动脉被清洗和30分钟的平衡。之后,这些动脉孵化与KH缓冲区(对照组),KH缓冲区PolyPHb 0.1%或3% PolyPHb 10分钟和等长张力的每个容器被记录。测量HBOC对内皮细胞的影响,孤立的冠状动脉环孵化与PolyPHb 37°C 2小时。清洗和平衡后60分钟3.5 g的静息张力下,这些动脉是诱发使用去甲肾上腺素(10⁻⁷米)引起的收缩反应。乙酰胆碱(空调采暖;来米)或硝普酸钠(SNP;来米)然后逐步添加诱导endothelium-dependent或独立的放松,分别。

2.8。氧化应激和NAD (P) H氧化酶活性测定

孤立的狗冠状动脉治疗后嵌入到铝杯是10月1毫升的树脂(美国樱花组织Tek),在液态氮冷冻。评估活性氧(ROS)生产、cryosections (8μ米)沾了superoxide-sensitive染料dihydroethidine(她10μ米在PBS)和孵化30分钟37°C。红色的她与奥林巴斯BX51显微镜和荧光检测DP70数码相机奥林巴斯(Olympus corp .)在室温下。同时,人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)治疗后与她(10孵化μ米)30分钟;然后ROS生产量化由荧光测量Em /交货= 480/580 nm (LS55荧光光谱仪,优秀的公司,波士顿,MA,美国)。作为氧化应激的标记,超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)形成HUVECs也是衡量使用商用设备(南京建成corp .)、南京、中国)。NAD (P) H氧化酶活性HUVECs测量如前所述[13]。简单地说,20μ与她孵化(10克的蛋白质μ(1.25米)和DNAμg / mL)在PBS的NAD (P) H (50μ120米),在最后一卷μL, 30分钟37°C在黑暗中。荧光强度被记录在一个微型板块读者在Em /交货= 480/580 nm (LS55荧光光谱仪)。

2.9。免疫组织化学

石蜡切片(5μ米)或cryosections (8μ米)的狗冠状动脉是准备和染色,,,Nox4 Nox1和血管性血友病因子(vWF)使用标准的和被广泛接受的免疫染色技术。vWF是用来指示内皮。此外,狗LV组织石蜡标本,被苏木精和伊红染色())和评估在盲评的病理学家以下组织学检查:玻璃样改变,混浊肿胀、脂肪变性、炎症浸润,细胞核周围的光环,间质水肿,急性心肌坏死。组织病理学变化的半定量的分析是使用一个任意执行分级系统从得分0到5(得分0:< 10%的阳性细胞;得分1:10% -20%阳性细胞;分数2:21 - 30%阳性细胞;分数3:31 - 40%阳性细胞;得分4:41 - 50%阳性细胞;分数5:阳性细胞> 50%)。

2.10。统计分析

所有值都是平均数±标准差。一个未配对的学生的以及用于检测显著差异,两组进行比较。单向或双向方差分析被用于三个或更多的组间比较差异Bonferroni紧随其后的多重比较测试适用(SPSS 16.0软件)。P值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。高剂量PolyPHb未能CPB-Induced I / R损伤后改善心脏功能

所有的血流动力学参数基线,以及人力资源、CVP,再灌注期间和地图,没有不同的组间(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。与低剂量治疗PolyPHb表现出保护作用。增加剂量的PolyPHb没有增强这种效果,增加PAWP如图所示,人民行动党,LVEDP和减少LVSP和CO(所有与虚假的集团;数据2 (d)- - - - - -2 (h))。LVEDP的恢复和前60分钟再灌注是更糟比I / R组(和分别;数据2 (g)和2 (h))。此外,0.1% PolyPHb缓解减少心脏签证官₂和高啊₂EI相比I / R组,而3% PolyPHb未能改善这些参数,进一步降低心脏签证官₂在再灌注(60分钟与I / R组;图3)。

3.2。高剂量PolyPHb没有反向I / R损伤后心肌坏死

作为心肌坏死的标记,水平的水平,LDH和肌钙蛋白I在等离子体被大大增加I /的实验组中R组。减少心肌酶释放0.1% PolyPHb集团中可观察到,而在PolyPHb组3%,酶释放仍处于高水平,而不是不同的I / R组(数字4(一)- - - - - -4 (c))。此外,他走时染色的结果表明,3% PolyPHb不限制心肌I / R损伤后组织病理变化,并进一步增加心肌坏死(与I / R组;数据4 (d)和4 (e))。

3.3。高剂量PolyPHb Endothelium-Dependent受损血管舒张

孵化与0.1% PolyPHb没有改变冠状动脉的净张力,而PolyPHb大大升高了3% (g;图5(一个))。进一步研究发现,endothelium-independent SNP没有组间差异引起的血管舒张(图5 (b))。然而,治疗3% PolyPHb诱导显著损伤血管扩张性反应乙酰胆碱(而虚假的组和与PolyPHb组0.1%;图5 (c))。

3.4。高剂量PolyPHb诱导氧化应激在冠状动脉

增加阳性染色后观察她的冠状动脉PolyPHb暴露于3%,表明生产过剩的活性氧在冠状动脉(图6(一))。此外,细胞研究证实,3% PolyPHb治疗导致增加活性氧的生产(与PolyPHb组0.1%;图6 (b))、抑制SOD活性和MDA升高形成HUVECs (和与PolyPHb组0.1%;数据6 (c)和6 (d))。

3.5。HBOC-Induced NAD (P) H氧化酶亚基超表达和活动

接下来,我们测量的基本单元的表达NAD (P) H氧化酶使用免疫组织化学染色。除了Nox4,血管的表达,,,以及催化亚基Nox1 PolyPHb显著增长了3%,相比之下,控制和船只PolyPHb 0.1%(数据处理7(一)和7 (b))。一致,NAD (P) H氧化酶活动也大大PolyPHb调节的3% (与对照组和与PolyPHb组0.1%;图7 (c))。

4所示。讨论

正如我们所知,除了心脏I / R损伤,体通常有减少血红蛋白水平由于胶体体解决方案启动电路和意想不到的肝素化后失血。高剂量的polyphb - 3%在这个研究是将补充血红蛋白在流通,从而提供额外的好处。然而,目前的研究提供了明显的证据表明高剂量PolyPHb不能保护心脏免受CPB-induced I / R损伤。关于一些参数,它甚至心脏造成额外伤害。相比之下,一个清晰的观察到心脏保护的低剂量PolyPHb集团暗示在活的有机体内心脏的影响HBOC剂量密切相关。此外,我们目前的研究证实,血管活性的高剂量PolyPHb并诱发冠状动脉内皮功能障碍和损害。这些研究结果在一定程度上可以解释矛盾的结果关于HBOC在动物和临床研究。在临床研究中,一个病人出现低血容量性休克在医院可以接收HBOC 750 - 1000毫升,这意味着循环估计HBOC水平高于2迷奸/ dL [10]。从我们的研究的数据,这个剂量是非常容易引起血管收缩,造成伤害的心。此外,在生理水平的抗氧化剂的存在,低剂量的HBOC可能保护因其过氧化物酶活性和良好的氧气交付能力(14,15]。然而,随着HBOC了身体的抗氧化防御系统,自己的prooxidative函数出现,负面影响成为主导。

到目前为止,负责HBOC-induced血管收缩的机制(s)尚未完全理解。清除endothelium-derived一氧化氮(NO)是最接受理论,提出血管收缩的严重程度取决于非细胞血红蛋白溢出的程度通过血管的内皮细胞(16]。然而,有问题外渗的概念。外渗过程的逻辑不清楚,因为大量的血红蛋白分子之间可以位于间质内皮细胞和平滑肌应该小而血室。此外,血红蛋白的量存在于间质会迅速耗尽,转换成高铁血红蛋白(metHb),从而阻碍血管张力变化(17]。HBOC-induced血管收缩的另一个理论是自动调整,以应对增强O₂交付,但没有找到直接证据支持这一假设(18]。本研究的数据表明一个“内皮损伤理论”HBOC-induced血管收缩可能是由于代ROS增加血管内皮和合成内皮功能障碍。此外,我们表明,高剂量PolyPHb增加NAD (P) H氧化酶亚基的表达,包括,,,表明Nox1 NAD (P) H氧化酶可能是负责HBOC-induced ROS破裂,血管氧化还原不平衡。虽然我们的数据表明,NAD (P) H氧化酶对内皮细胞氧化应激很重要,我们相信这种损伤是多因素疾病,过度啊₂由HBOC和heme-auto-oxidation都能够产生活性氧和加速氧化应激。此外,ferryl血红蛋白可以调解脂质氧化反应和isoprostanes产生强大的血管活性的分子,这可能也有助于HBOC-induced vasoactivity [19]。

虽然拥有内在优势与红细胞存储相比,处在vasoactivity被认为是主要障碍阻碍其临床应用(17]。减少没有亲和力长期以来一直被视为解决方案限制血管收缩后HBOC管理。血红素的策略包括转基因口袋的血红蛋白和衰减HBOC溢出通过内皮连接产生较大的血红蛋白分子(20.,21]。然而,我们的研究表明,使用抗氧化剂对抗氧化损伤可能是一个潜在的选择来解决这个问题。几年前,D 'Agnillo和改变(22]报道HBOC具有抗氧化特性的生化与超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶交联聚合血红蛋白减少氧自由基的形成在鼠肠I / R模型。一致,我们的最新研究表明,卡托普利,血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂和抗氧化作用,也能够限制HBOC-related vasoactivity和对心脏不利的影响23]。因此,制造HBOC产品增强抗氧化性能是一个可能的方法来减少其vasoactivity并限制不良心血管效应。

总之,我们报告的高剂量PolyPHb未能保护心脏免受CPB-induced I / R损伤,这是由于感应NAD (P) H oxidase-induced ROS生产过剩和内皮功能障碍。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持由中国国家自然科学基金(81100180和81100180),2013年四川大学优秀青年学者研究基金,中国国家高技术研究发展计划(863计划、2012 aa021903),四川省科技支撑计划(2013 sz0059),四川省科技创新专项基金项目(2013 zz0006),和研究基金在成都军事医院(2011 yg-b08和2013 yg-b028)。

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