对Steen溶液特性的新见解:通过NOX2下调实现抗氧化效果的突破

摘要

体外肺灌注(EVLP)可使回收的肺进行器官移植的灌注和修复。Steen溶液是专门为这一过程设计的，但其激发活性的机制仍有待完全澄清。我们推测Steen溶液可能包含抗氧化特性，允许重建肺组织稳态。研究人员招募了10名健康志愿者的血液样本。血小板和白细胞用Steen溶液或缓冲溶液作为对照，用合适的激动剂刺激。活性氧(ROS)、可溶性NOX2 (snox2衍生肽)、NADPH氧化酶激活标记物、在细胞刺激后，测量了细胞向细胞膜的转移和异前列腺素的产生，作为氧化应激的标记物，以及一氧化氮(NO)，一种强大的血管扩张剂和抗氧化分子。Steen溶液明显抑制血小板和白细胞的转运和NOX2的激活。与这一发现相一致的是，通过血小板和白细胞显著降低ROS和异前列腺素的形成，氧化应激的降低。最后，在Steen溶液中培养细胞，可以增强NO的生成。因此，我们提供了Steen溶液通过下调NADPH氧化酶活性和增加NO的产生而具有抗氧化性能的第一个证据。

1.介绍

器官移植可改善终末期器官衰竭患者的质量和预期寿命。由于预期寿命的延长，要求移植的人数预计会增加。然而，尽管在90年代呈指数级增长，捐献者的绝对数量和每百万人的比率(pmp)并没有进一步改善[1，2]．为了克服这些障碍，提高器官的池，直接参与这一领域的卫生专业人员按照国家卫生系统促进了生产针对脑死亡后优化器官捐献和移植的过程中的各个阶段的政策。然而，这一策略，尽管其已探明的疗效，部分未能器官提供平衡其不断增长的需求[3.]．

在这种情况下，肺移植(LT)被认为是一种可行的治疗方案，为选定的一组终末期肺病患者。然而，越来越多的病人在等待名单上显然超过了可用的供体数量;这是因为目前大约平均只有20%的潜在多器官捐赠者用于肝移植[4]。这导致轮候时间和轮候名单上的死亡率增加，通常超过20%[5]．大多数供体肺被认为不适合移植的原因与外伤或脑死亡后发生的肺损伤以及延长重症监护病房(ICU)住院时间相关的并发症有关。因此，提出了若干战略:利用边缘捐助者[6]，生活相关的LT [7，8，或非心脏跳动捐赠[9]．尽管有这些改进，移植的数量迄今没有显著增加。在这些断言的背后，从边缘和扩展供体获取肺的概念和“器官修复”的可能性已经成功地用于移植，这一新概念正在获得广泛的接受。

无论采用的方案是Lund模型还是Toronto模型，正常体外肺灌注(EVLP)均可使回收的肺在体外循环中进行灌注，并在移植前进行功能重新评估和修复[9- - - - - -11]．这种新技术使用了一种专门为这一过程设计的原始启动/灌注溶液，如Steen溶液。在Lund模型中，EVLP程序是在Steen溶液和洗过的红细胞的混合物中进行的，以达到15%的血细胞比容;此外，左心房保持开放，使EVLP时心输出量正常(5-6 L/min)。在多伦多方案中，EVLP程序是在“脱细胞”Steen溶液和封闭的左心房的情况下进行的，因此只有正常心输出量的40%。不管采用的是什么方案，这种技术看起来如此有效的原因主要与不同的变量有关:类固醇和高剂量抗生素的使用，溶液的高渗透力，以及白细胞耗尽过滤器对电路的影响。EVLP过程是一个典型的缺血再灌注模型，与活性氧(ROS)的形成有关;这种现象在理论上可能会妨碍最佳的肺灌注，从而导致最有利的临床结果，因为ROS通过抑制一氧化氮(NO)活性对内皮功能产生负面影响。我们推测Steen溶液可能具有抗氧化特性，可以钝化ROS的形成，从而改善肺灌注。为了解决这个问题，我们探索了一个体外实验模型，在Steen溶液中，血细胞被激活，产生由NADPH氧化酶的催化亚基NOX2产生的ROS。

2.材料和方法

2．1.主题

我们研究了10名健康志愿者（5名男性，5名女性，年龄：)(表1)．所有受试者均获得书面知情同意。该研究得到了当地伦理委员会的批准(2013年12月12日，第3010号议定书)，并按照《赫尔辛基宣言》所体现的原则进行。

在上午8点至9点禁食12小时后，对进行常规生化分析(包括总胆固醇和葡萄糖)的受试者采集血液样本。健康受试者仰卧休息至少10分钟后，将样本放入装有104 3.8%柠檬酸钠或EDTA的试管中。

2.2。实验室分析

除非另有规定，所有材料均来自Sigma Aldrich（意大利米兰）。Steen溶液从Vitrolife（瑞典哥德堡）购买。它是一种生理盐水溶液，含有人血清白蛋白（提供正常的胀亡压力以防止水肿形成）、右旋糖酐（一种温和的清除剂，包裹内皮细胞，防止随后白细胞过度相互作用和血栓形成），其特征是普遍存在的细胞外电解质成分（低钾，减少自由基生成，在常温条件下防止血管痉挛）。

2.3。血小板制备和活化

为了获得富含血小板的血浆（PRP），样品在180℃下离心15分钟 g、 为了避免白细胞污染，根据Pignatelli等人的研究，仅收集了PRP的前75%[12]．PRP双离心5分钟，300 g，获得血小板颗粒(PLT)。添加酸/柠檬酸/葡萄糖(ACD) (1:7 v/v)以避免加工过程中血小板活化。样品在含有0.1%白蛋白的HEPES缓冲液(缓冲液，BS)中悬浮，pH为7.354 (PLT/mL，除非另有说明)，或存在1ml Steen溶液(PLT/mL，除非另有说明)，在存在或不存在NADPH氧化酶抑制剂(罗波宁，50μ.M） 在室温下15分钟。通过离心（5分钟，300分钟）从上清液中分离细胞 g） 细胞和上清液这两种组分储存在−80°C，直到分析。

２.４.人多形核白细胞的制备与活化

采用右旋糖酐增强红细胞沉降法、Ficoll-Histopaque密度离心法、蒸馏水裂解剩余红细胞、汉克平衡盐溶液(HBSS)(缓冲溶液、BS)不含任何二价阳离子的。最后，细胞颗粒悬浮在1ml HBSS或1ml Steen溶液中，最终浓度为phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (10μ.M)存在或不存在NADPH氧化酶抑制剂(罗布宁，50μ.M)室温下15分钟。通过离心(5分钟，300 g)从上清中分离细胞，在−80°C保存，直到分析。

2．5．淋巴细胞和单核细胞的准备

取血于肝素化管中(10iu /mL)。淋巴细胞和单核细胞(LYM / MON) (细胞/mL)，从健康志愿者(浓度为1.077 g/mL的多糖-泛影酸钠溶液，渗透压为280 mol / l(淋巴准备;Nycomed，奥斯陆，挪威)在800克在20°C。收集LYM/MON细胞层，细胞在添加1%胎牛血清和2 mmol/L EDTA (Sigma-Aldrich)的冷磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2) (PBS)中洗涤两次。最后，将细胞颗粒悬浮在1ml的PBS(缓冲溶液，BS)或1ml的Steen溶液中，最终浓度为细胞/毫升。用或不用脂多糖(50 pg/mL) (LPS)刺激细胞悬液，有或没有NADPH氧化酶抑制剂(罗布宁，50μ.M)室温下15分钟。通过离心(5分钟，300 g)从上清中分离细胞，在−80°C保存，直到分析。

2.6。用流式细胞术评价活性氧(ROS)的产生

细胞悬浮液用2 '，7 ' -二氯荧光素二醋酸酯(5μ.M)(37°C下15分钟)。10μ.用1稀释每个活化和未活化样品的L mL缓冲液或Steen溶液，并通过流式细胞术进行分析。ROS产生以平均荧光（MF）表示。

2.7。sNOX2-dp和8-iso-PGF2分析α.-III

如Pignatelli等人所述，采用ELISA法检测细胞外可溶性nox2衍生肽(sNOX2-dp)水平，这是NADPH氧化酶激活的标记物。[12]．该肽被特异性单克隆抗体识别，该单克隆抗体针对NOX2 (NADPH氧化酶的催化核心)额外膜部分的氨基酸序列(224-268)，该序列在血小板激活时被释放在培养基中。值表达为pg/mL;试验内和试验间变异系数分别为5.2%和6%。细胞8-iso-PGF2α.-III产量用EIA测定法(意大利Tema Ricerca)测定，表示为pmol/L。试验内和试验间的变异系数分别为5.8%和5.0%。

2.8。细胞氧化氮测量

采用比色法试剂盒(意大利Tema Ricerca)测定有无Steen溶液(1ml)时血小板和白细胞上清中一氧化氮代谢物亚硝酸盐和硝酸盐(NOx)。试验内变异系数为2.9%，试验间变异系数为1.7%。

2.9。膜和胞质蛋白提取

为了分析斯蒂恩解决特异性阻断细胞NADPH氧化酶激活，分析上的易位该解决方案的效果根据Fortuño等[13]．

简单地说，使用ProteoJET膜蛋白提取试剂盒(Fermentas International Inc.， Maryland, USA)提取膜蛋白和细胞质蛋白[13]．

2.10。P47 Western blot分析^phox

将活化和未活化样品悬浮在2X裂解缓冲液中（5 毫米乙二胺四乙酸，0.15 摩尔氯化钠，0.1 摩尔Tris，pH值8.0，和1%triton和蛋白酶抑制剂混合物）。等量的蛋白质（30 μ.g/lane)，在含2-巯基乙醇的2X Laemmli缓冲液中溶解，并装入变性SDS/10%聚丙烯酰胺凝胶中。Western blot检测单克隆抗体(1μ.g/mL)在4°C孵育过夜。增强化学发光法检测免疫复合物。在NIH图像1.62f分析仪上通过密度分析计算显影点，并以任意单位(AU)表示。

2.11。统计分析

连续变量用均数±标准差表示，分类变量用连续变量与学生的比较-test和ANOVA，根据。统计显着性设定在0.05 2尾水平，值未调整的多样性，未报告。使用SPSS 20 (IBM, Armonk, NY, USA)进行计算。

2.12。样本大小

我们计算了双尾单样本配对学生的最小样本量-测试，考虑以下情况:(i)pg/mL将是未使用Steen溶液或使用Steen溶液处理的受刺激细胞之间NOX2水平的临床相关差异，(ii)配对差异的5 pg/mL标准偏差(SD);(iii) i型错误概率和权力．这些假设导致．

3.结果

３．１．Steen溶液在ROS产生和8-iso-PGF2中的作用α.第三生产

在PLT，中性粒细胞ROS的产生，和LYM / MON使用荧光探针2'通过流式细胞分析评估，7'- diclorofloresceinaacetate（DCFH-DA）。由于ROS抑制的阳性对照，我们重复夹竹桃麻素，NADPH氧化酶的特异性抑制剂的实验。

如图所示1(一)，1 (b)，1 (c),1 (d)，我们观察到悬浮在缓冲溶液中的细胞产生了增加的ROS，用AA (0.5 mM)刺激PLT, LPS (50 pg/mL)刺激LYM/MON和PMA (10μ.M）为中性粒细胞相比未刺激的细胞。In presence of Steen solution (1 mL), we observed a reduction of ROS production in PLT (曼氏金融和曼氏金融;), LYM / MON (曼氏金融和曼氏金融;)，及中性粒细胞(曼氏金融和曼氏金融;)比较在缓冲溶液中受刺激的细胞。阳性对照，夹竹桃麻素，显著抑制ROS的产生（图1(一)，1 (b),1 (c)） ()．

巧合的是，随着ROS的形成，8-iso-PGF2α.-III的产生增加了悬浮在缓冲溶液中的细胞，用AA (0.5 mM)刺激PLT, LPS (50 pg/mL)刺激LYM/MON和PMA (10μ.M)与非刺激细胞相比(图2(一个)，2 (b),2 (c))．即使在这种情况下，Steen溶液(1ml)也能够减少8-iso-PGF2α.-III在PLT生产(pmol / L和pmol / L;), LYM / MON (pmol / L和pmol / L;)，及中性粒细胞(pmol / L和pmol / L;)（数字2(一个)，2 (b),2 (c))比较在缓冲溶液中受刺激的细胞。阳性对照罗普宁显著抑制8-iso-PGF2的产生α.三世(图2(一个)，2 (b),2 (c)） ()．

3.2.Steen溶液对NADPH氧化酶的影响

为了分析Steen溶液抑制氧化应激的途径，我们通过测量NADPH氧化酶在细胞激活时在培养基中释放的额外膜部分NOX2 (NADPH氧化酶的催化核心)来研究NADPH氧化酶的激活NADPH氧化酶活化的关键亚基在细胞膜上的表达[14]．

如图所示3（a），3（b）,3（c），Steen溶液显著降低每种细胞中NADPH氧化酶的活性(pg / mL和在PLT pg / mL,；pg / mL和pg / mL LYM / MON,；和pg / mL和pg / mL的中性粒细胞,)与缓冲溶液中的受刺激细胞相比，sNOX2-dp水平降低。阳性对照组apocynin通过降低sNOX2-dp水平显著抑制NADPH氧化酶的激活（图3（a），3（b）,3（c）） ()．

关于转移在细胞膜上，我们观察到Steen溶液抑制了所有细胞类型NADPH氧化酶亚基的转运(非盟和非盟在PLT,；非盟和非盟在LYM / MON,；和非盟和非盟在中性粒细胞,)比较在缓冲溶液中受激细胞(图4（a），4 (b)，4 (c),4 (d))．阳性对照罗布宁明显抑制了表达（数字4（a），4 (b)，4 (c),4 (d)） ()．

与未激活的细胞相比，悬浮在缓冲溶液中并与特定激动剂孵育的细胞显著减少NO生成(对μ.米PLT,,图5(一个)；对μ.M LYM / MON,,图5 (b)；和对μ.在中性粒细胞,,图5 (c))．细胞与Steen溶液孵育增强NO生成(+44%的PLT，；+ 47% LYM / MON,；pmn为+35%，)比较在缓冲溶液中受刺激的细胞。罗布宁对氧化应激的抑制导致被激活的细胞产生过量的NO(图)5(一个)，5 (b),5 (c))．

4。讨论

我们首次报道，Steen溶液通过下调ROS衍生的NOX2活化来显示抗氧化特性。

ROS是化学上不稳定的分子，它能与其他分子迅速反应，产生氧化产物，如氧化的低密度脂蛋白、过氧亚硝酸盐或蛋白质加合物[15]．在生理浓度下，ROS作为第二信使，因此，它们作为细胞激活的细胞内信号。在ROS作为第二信使的细胞类型中，血小板是ROS参与激活过程的典型例子。因此，当血小板被常见的激动剂激活时，会产生几种类型的ROS，如超氧阴离子或过氧化氢，这些ROS反过来有助于血小板聚集的传播[16]．有几种酶在激活时产生ROS，包括髓过氧化物酶、NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶或未偶联的eNOS。其中，NADPH氧化酶是最重要的ROS产生源。血小板拥有NADPH氧化酶的所有亚基，包括它的催化亚基gp91phox (NOX2) [17- - - - - -19].血小板NADPH氧化酶的激活对细胞凋亡至关重要在NADPH氧化酶遗传缺陷的情况下，它被完全抑制。对此，我们发现慢性肉芽肿病(X-CGD)患者的血小板几乎完全抑制血小板NOX2遗传缺陷的产物[18]．利用血细胞作为工具来探索Steen溶液是否具有抗氧化特性，我们发现，在细胞与溶液孵育时，氧化应激的两个标志物，即ROS和异前列腺素的形成，降低了。进一步支持Steen溶液的抗氧化性能，证明了与Steen溶液孵育的刺激细胞上清中NO的增加。因此，NO是一种强大的血管扩张剂和抗聚集分子，并能被ROS迅速灭活，最终决定NO生成受损。

活化后，血细胞释放f2 -异前列腺素，特别是8-iso-PGF2α.，一种由花生四烯酸(AA)非酶氧化而成的化学稳定化合物[19]．我们最近证实，血小板异前列腺素的形成依赖于NADPH氧化酶的激活，并通过GpIIb/IIIa的激活促进血小板募集过程[17]．因此，Steen溶液中异前列腺素的减少使我们推测这种作用可能与NADPH氧化酶的下调有关。因此，我们发现Steen溶液抑制了NOX2的激活，表现为与Steen溶液孵育的受刺激细胞上清中sNOX2-dp的显著降低。这一发现被实验证实，通过实验，我们可以证明Steen溶液破坏了胞质亚基在血小板膜上的易位，在NADPH亚单位的组装过程中起着至关重要的作用，因此对NOX2的激活至关重要。综上所述，这些发现表明，在血细胞中，Steen溶液可以通过下调NOX2发挥抗氧化剂的作用。尽管我们没有数据，但我们可以推测Steen溶液也会作用于erythr细胞。我们不能排除其他酶途径可能与Steen溶液引起的受损ROS产生有关。此外，Steen溶液下调NOX2的确切机制是一个有待进一步研究的开放问题。最后，Steen溶液可能起到抗氧化剂的作用同样在内皮水平，但这一假设必须进一步探讨。

总之，我们的数据表明Steen溶液通过破坏ros衍生的NOX2在几种细胞中激活的形成，发挥了重要的抗氧化作用。这一发现为Steen溶液在EVLP中允许肺修复的机制提供了新的见解。

进一步的体内研究目前正在进行中，并将进一步阐明本文提出的方法的翻译价值。

利益冲突

作者确认本文的发表不存在利益冲突。

承认

这项工作得到了罗马大学“SAPIIZANA”2011版C26A11J528的资助，Giacomo Frati对此表示感谢。

参考

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