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氧化医学与细胞寿命
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氧化医学与细胞寿命/2014/文章
特殊的问题

代谢综合征和癌症中的氧化剂和抗氧化剂

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研究文章|开放访问

体积 2014 |文章ID. 190945 | https://doi.org/10.1155/2014/190945

建赵，玲玲翟，郑柳，双武，萍诗徐那 “瘦素水平与氧化应激导致肥胖诱发的低睾酮在小鼠睾丸组织”氧化医学与细胞寿命那 卷。2014那 文章ID.190945那 14. 页面那 2014． https://doi.org/10.1155/2014/190945

瘦素水平与氧化应激导致肥胖诱发的低睾酮在小鼠睾丸组织

赵赵那1 lingling zhai.那2 郑刘那1 吴霜那1 和 力平徐1

1沉阳制药大学药理学系，沉阳市沉阳市神华路103号，辽宁110016

2儿童和青少年健康，公共卫生，中国医药学院，辽宁沉阳110001，中国的部

学术编辑器:史威德
收到了 2014年1月7日
公认 2014年3月3日
发表 2014年4月14日

摘要

客观的．本研究探讨了肥胖对雄性小鼠生殖器官功能的影响，以及肥胖引起雄性继发性性腺功能减退(SH)的可能机制。方法．96只小鼠随机分为3组:对照组、饮食诱导肥胖组和饮食诱导肥胖抵抗组，分别持续8周和19周。通过测定精子计数和运动、睾丸相对重量、睾丸激素水平、间质细胞的病理变化和凋亡，研究短期和长期高脂饮食对生殖器官的影响。氧化应激通过测定丙二醛、H2O.2，NO水平和GSH在睾丸组织。CAT，SOD，GSH-Px活性及NRF2real-time PCR检测mRNA。结果．短期和长期的高脂肪的饮食降低精子计数和活力，相对睾丸重量，睾酮水平;降低CAT，SOD，GSH-Px活性及NRF2信使rna表达;增加了MDA, H2O.2NO和瘦素水平;抑制CAT和GSH-Px酶活性。睾丸组织中有Leydig细胞的病理损伤和凋亡。结论．睾丸间质细胞的病理损伤、睾丸组织的氧化应激和高水平的瘦素水平可能为阐明男性SH在肥胖中的作用机制提供了一些证据。

1.介绍

无论是在发达国家还是在发展中国家，儿童肥胖的患病率都有所上升[1]．在美国，儿童肥胖的发病率估计为17%，即1200万2至19岁的儿童[1]．此外，超重和肥胖在中国的流行率正在上升[2那3.]．肥胖是具有综合组和非合成瘤变异的多因素条件[4.-6.]并具有即时和长期的健康后果。将肥胖从童年转化为成年的肥胖在肥胖儿童中更强大[5.]．遗憾的是，很少有有效的治疗超重和肥胖儿童[7.-9.]．

已证实肥胖对男性生殖有影响[10.]．雄性肥胖与增加的低精子浓度的发病率和逐渐低活动精子数[相关联11.那12.]．甚至在不存在下丘脑 - 垂体单元的器质性病变，肥胖男性次级（性腺）性腺机能减退（SH）的流行已被证明在一些研究[10.那13.那14.]．基于目前的文献，肥胖相关SH的发病机制和临床病理相关性尚不完全清楚[15.]．男性SH和肥胖之间的关联中涉及的机制是复杂的。然而，雄性肥胖症本身与较低的血浆睾酮水平相关[14.]．雄激素促进了生殖器官和男性继发性特征的发展。精子发生与雄激素分泌密切相关。减少的睾丸激素可能有助于肥胖症的雄性[16.]．

我们假设睾酮减少的原因如下。(1)睾丸激素主要由睾丸间质细胞分泌，睾丸间质细胞的损伤可能导致睾丸激素的降低。(2)肥胖中脂肪细胞增多。脂肪细胞中分泌瘦素等脂肪细胞因子。脂肪细胞因子水平高，可能会抑制睾酮的分泌。(3)氧化应激与SH密切相关。大约15%试图怀孕的夫妇在临床上不孕，其中50%的病例涉及男性因素[17.]．睾丸氧化应激似乎是男性不孕症中的常见特征，并且可能在男性不孕症中发挥重要作用[18.]．然而，肥胖患者氧化应激和雄性SH之间没有证据表明。

在这项研究中，断奶小鼠分别饲喂高脂肪饮食8周和19周。我们的目的是评估青春期肥胖是否影响成年小鼠生殖器官的功能和发育，以确定短期和长期高脂肪饮食对雄性小鼠生殖器官功能和发育的影响。此外，还探讨了男性SH在肥胖中的可能机制。

2.材料和方法

2.1。动物，饮食和实验程序

4/5周龄C57BL/6J雄性小鼠96只，来自中国医科大学沈阳实验动物中心。小鼠在第一周被喂食标准的实验室饲料，以使它们适应新的环境。然后，老鼠被随机分配到标准的实验室饮食(10%的热量来自脂肪，20%的热量来自蛋白质，70%的热量来自碳水化合物，3.85千卡/克)或预制的高脂肪饮食，其中45%的热量来自脂肪(高脂肪饮食组)[19.， 8或19周。高脂日粮由73%标准鼠粮加20%猪油、7%酪蛋白(北京奥博生物科技有限公司)和微量多种维生素组成。

将动物置于温度和湿度控制的房间（ °C和 ％，RESP）上，自由获取食物和水12小时光照/黑暗周期。所有实验程序符合了中国医科大学，沉阳，中国的实验动物的护理和使用的机构准则，并以健康指南实验动物的护理和使用（出版号85-23全国学院，于1985年修订）.所有作出了努力，以尽量减少使用动物及其痛苦的数量。

8周或19周后，分别喂食高脂肪饮食的小鼠按体重增加情况分为DIO- r(饮食诱导肥胖抵抗)小鼠和DIO(饮食诱导肥胖)小鼠，根据Levin和Keesey使用的方法[20.]如图所示1．十二只小鼠在体重增加（  g, g)，分别在第8周和19周时将DIO标记为DIO，体重增重(BWG)下三分位12只小鼠(  g, g)分别为8周和19周时的DIO-R。中次肢体重增加的小鼠( ）被排除在这项研究。各组中的所有小鼠8和19周喂养后处死。


图1
动物实验的流程图。
2.2。组织和分析的处理

记录体重和食物消耗。在接收到最后一次饲料后24小时，用乙醚麻醉动物，并从腔静脉获得血液样品。分离血清以测量性激素，睾酮。收集血液样品后，迅速切断，并测定精子计数和活力。获得逆床脂肪，附睾脂肪，附睾组织和睾丸和溶酶囊泡。

从每组六个睾丸，以便确定MDA，T-AOC，H制备为5％或10％的匀浆2O.2，SOD，GSH，GSH-PX，CAT和没有水平。每组的六个睾丸在-80℃下立即冷冻，以进行基因表达研究。

每组取6个睾丸进行透射电镜观察。将睾丸切成1 mm × 1 mm × 1 mm的碎片，用2.5%戊二醛和0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)固定，后用1.0%四氧化锇(OsO)固定4.），在嵌入EPON 812中的渐进乙醇和丙酮溶液中脱水，使用LKB UltramicOrotome切片，并用乙酸铀酰染色，然后通过H-600显微镜观察并拍摄。

各组其余6个睾丸准备病理分析。

所有的含量和酶活性都归一化为用Lowry法测定的蛋白质[21.]，使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准。每次测试每个样品。

２.３.附睾尾部精子计数和运动的测量

雄性C57BL/6J小鼠于第8周和第19周称重并麻醉。立即切除左侧附睾。将附睾和输精管与脂肪分离。在6孔板中，将每个动物的附睾和输精管放入含有1.0 mL M2缓冲液的孔中。然后在附睾体与附睾尾交界处切割附睾，将附睾尾放入含有1.0 mL M2缓冲液的孔中。用剪刀在附睾尾部剪几刀，轻轻按压精子。精子也从一个单独的井中从输精管中获得，然后从培养皿中取出。挤压后的精子从附睾尾被收集到Eppendorf管中。使用血球计(每面15毫升)，精子计数被确定为每微升的精子数量。

精子计数和活力根据世卫组织指南进行评估[22.] （ 200精子计数每个样品）。使用血细胞计数器测定精子计数。精子活力由每只动物200个精子分类为逐行能动，能动非进展，或immotile在光学显微镜下盲目地评估。然后运动表示为总能动（逐行能动和非进行性活动精子）的百分比。

２.４.病理分析

睾丸组织除去并且将组织用4％的多聚甲醛。将来自每只小鼠的睾丸组织的一部分切成4  m厚的碎片。使用AX-70显微镜（日本Olympus）进行血杂志和曙红（He）染色的形态学观察。

睾丸组织标本在一系列分级的乙醇溶液中脱水，石蜡包埋，并用切片机(美国徕卡)进行冠状切片，厚度为4μ.m。睾丸切片处理以用于细胞凋亡的TUNEL染色和用于随后的微观安装（每组制备， ，每只动物3个部分）如下。（1）脱蜡链烷部分。（2）加入1％Triton-100 15分钟，用PBS冲洗所有载玻片3次。（3）酶用3％H灭活2O.2-甲醇处理15分钟;所有玻片用PBS冲洗3次。(4) 100μ.l TUNEL反应混合物（或100 μ.每片加L对照液(阴性对照)，37℃湿室孵育60 min, PBS冲洗3次。(5)在组织周围擦拭玻片μ.大号的链霉亲和素-HRP加入到各样品中。The slides were incubated in a humid chamber for 30 min at 37°C. The slides were washed once with PBS and then washed 3 times with 100 mM tris buffer and pH 8.2 for 5 min at room temperature. (6) DAB chromogenic was added. (7) dH2加入O终止显色反应。凋亡细胞为褐色，正常细胞为蓝紫色。凋亡率=(凋亡细胞数/总细胞数)× 100%。对睾丸组织进行病理分析。提取睾丸组织总mRNA，实时荧光定量PCR检测SOD、GSH-Px、CAT和Nrf2正在进行中。

2.5。MDA测定

将睾丸匀浆加入到含0.1mol / L磷酸盐缓冲液和0.1mol / L FeCl的反应混合物中3.总体积1.0 mL (pH = 7.4)。加入1.0 mL 10%三氯乙酸(TCA)和1.0 mL 0.67% TBA终止反应，试管置于沸水浴中20 min。然后将试管移到冰浴中，以2500 g离心10分钟。以四乙氧基丙烷(TEP)为标准，在535 nm处测量上清液的光密度，以评估每个样品中MDA的形成量。MDA含量以nmol表示·毫克-1蛋白质。

2.6。谷胱甘肽测定

通过与5,5'-二硫双石（2-硝基苯甲酸）（DTNB）的反应来确定睾丸匀浆的GSH。简而言之，将0.9ml 10％睾丸均匀素加入到0.1ml 50％TCA中，并将样品以3000rpm离心15分钟。然后将0.1ml上清液中加入4.4ml 0.1M PBS和0.5ml 0.04％DTNB至总体积为5.0ml（pH7.4）。将溶液的吸光度分光光度计在412nm处。GSH的含量表示为mg gsh g-1蛋白质。

2.7。GSH-Px活性，CAT，SOD，H2O.2，NO和T-AOC测定

GSH-Px, CAT, SOD, H2O.2，NO，和T-AOC被建成生物工程研究所（南京，中国）提供。该GSH-Px活性，CAT，SOD，H2O.2、NO和T-AOC含量按照制造商的说明使用这些试剂盒进行测量。GSH-Px、CAT、SOD和T-AOC以U·mg表达-1蛋白质。H2O.2content was expressed as mmol g-1蛋白质。NO含量表示为μ.mol g-1蛋白质。

2.8。RNA分离和实时PCR分析

总mRNA从每个组中小鼠的睾丸组织中提取。实时PCR用SYBR绿色PCR试剂盒采用实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems 7500实时PCR系统）（宝生物工程有限公司，大连，中国）执行。总RNA，用Trizol（宝生物工程有限公司大连，中国）睾丸提取。使用UV分光光度计中的量和完整性进行了表征。OD260总RNA / OD280为1.6和1.8之间。

采用带DNA橡皮擦的PrimeScript RT试剂试剂盒进行半定量反转录。逆转录使用Applied Biosystems 2720热循环仪(Applied Biosystems，新加坡)进行。去除DNA反应1μ.g总RNA，最终体积为10μ.l，使用2.0 μ.l 5x gdna橡皮擦缓冲液，1.0 μ.大号的gDNA橡皮擦和无RNA卫生署2O.将反应物在42下温育℃下进行2分钟。反转录在20的终体积进行 μ.l，使用10 μ.去除DNA反应L的结果，1.0 μ.大号Primescript RT酶混合物I，4.0 μ.微升5x Primescript缓冲器2和1.0 μ.大号RT素混合和不含RNA酶的DDH2O.。The reaction was incubated at 37°C for 15 min, then at 85°C for 5 s.

基因特异性引物由TaKaRa公司设计，所有引物列于表中1．50μ.大号PCR反应混合物含有25 μ.2倍PCR缓冲液μ.PCR正向引物(10μ.m），2 μ.L PCR反向引物（10μ.M），1 μ.L rox参考染料II（50x），4 μ.l模板DNA和16 μ.L dH2O.使用7500 Real-Time PCR系统(BD Co.， USA)在95°C条件下进行初始变性30 s，然后扩增40个循环，95°C条件下扩增3 s, 60°C条件下扩增34 s。采用2−ΔΔCT方法进行相对表达式分析。其中ΔCT (test) = CT (target, test)−CT (reference, test)， ΔCT (calibrator) = CT (target, calibrator)−CT (reference, calibrator)， ΔΔCT = ΔCT (test)−ΔCT (calibrator)。相对表达式为2−ΔΔCT。原始数据被归一化为管家基因的数据，β肌动蛋白。所有反应均为3个重复。放大后，进行熔化曲线分析，根据其特定熔化温度(Tm)验证正确的产品[23.]．
基因 格纳银行 向前 逆转
猫 NM_009804 ACATGGTCTGGGGACTGG. CAAGTTTTTGATGCCCTGGT
GSH-Px的 NM_008160 gtccaccgtgtatgccttct. TCTGCAGATCGTTCATCTCG
草皮 NM_0136713 TCAAGCGTGATTTGGGTCT AGCGGAATAAGGCCTGTTGT
Nrf2 NM_172086 ctcgctggaaaaaaagaagtgg. CCGTCCAGGAGTTCAGAGAG
表格1
实时RT-PCR分析的引物序列。
2.9。统计分析

通过单向分析（ANOVA）的单向分析，随后是最小的显着差异（LSD）多比较测试来确定所获得的值（平均值±SD）的显着差异。一种 的<0.05值被认为是显著。

3.结果

3.1。体重和体脂

在喂养高脂肪食物的雄性C57BL/6J小鼠与喂养正常食物的同龄同窝鼠在8周和19周时，观察到体重有显著差异( ）.

饲喂高脂饲料的小鼠在8周时体重平均增加了28 g，而饲喂DIO- r饲料的小鼠体重平均增加了24 g，饲喂正常饲料的同窝鼠在同年龄时体重平均增加了24 g(图)2(一个)）.饲喂高脂饲料的小鼠在19周时体重平均增加了33 g，而饲喂DIO- r饲料的小鼠平均体重增加了28 g，饲喂正常饲料的同卵鼠平均体重增加了27 g(图)2 (b)）.

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图2.
高脂肪喂养的对体重的影响和精子数，运动8周和19周。所有数据表示为平均值±SD;那，相对于对照组。（a）中在第8周的对照小鼠的端Bodyweights（)喂食10%脂肪饮食和饮食诱导肥胖(DIO)小鼠(）和饮食诱导的肥胖抗性（DIO-R）小鼠（（b）对照组小鼠19周结束时的体重()喂食10%脂肪饮食和饮食诱导肥胖(DIO)小鼠(）和饮食诱导的肥胖抗性（DIO-R）小鼠（)， (c)控制精子数量和活力(），DIO-R（）和dio小鼠（（d）对照组的精子数和精子活力(），DIO-R（）和dio小鼠（)在19周结束时。

绝对和相对腹膜后（RET）和附睾（EPI）的脂肪垫8周和19周者的DIO组和DIO-R组相对于对照组的小鼠在显著较高（表2）（ ）.
团体 Ret.脂肪(g) 相对惩戒。脂肪（g / 100 g） Epi。脂肪(克) 相对EPI。脂肪（g / 100 g） TES。重量（g） 相对tes。重量(克/ 100克) 附睾重量（g） Relative epididymis weight (g/100 g) SEM。重量（g） 相对Sem。重量(克/ 100克)
8周 DIO 12. 0.09±0.03 * * 0.34±0.13 ** 0.32±0.09 * * 1.23±0.29 * * 0.19±0.02 0.77±0.06*＃ 0.07±0.01 0.29±0.06 0.22±0.02 * 0.87±0.11.##
DIO-R 12. 0.08±0.03 ** 0.37±0.13 ** 0.32±0.07 ** 1.49±0.25 ** 0.18±0.01 0.86±00.07 0.07±0.01 0.31±0.02 0.24±0.03 * * 1.12±0.15
控制 12. 0.03±0.01 0.12±0.04 0.19±0.04 0.91±0.18 0.18±0.03 0.85±0.10 0.06±0.01 0.31±0.05 0.19±0.03 0.91±0.16##
19周 DIO 12. 0.49±0.19 * * 1.49±0.55 ** 1.15±0.34 ** 3.52±0.99 * * 0.20±0.02 0.62±0.08** ## 0.08±0.01 0.25±0.05 ** 0.31±0.07 0.96±0.21
DIO-R 12. 0.20±0.06 * * 0.73±0.22 ** 0.62±0.19 ** 2.27±0.67 ** 0.20±0.01 0.72±0.05 0.07±0.01 0.27±0.05 0.28±0.060 1.02±0.23
控制 12. 0.077±0.037 0.28±0.12 0.33±0.06 1.19±0.19 0.20±0.02 0.75±0.07 0.08±0.01 0.30±0.02 0.27±0.06 1.01±0.21
笔记。数据是平均值±SD; 和 表示与对照组相比统计学显着性; 和 与DIO-R组相比表示统计学意义。RET：逆床;epi：epiatidymal;tes：testis;SEM：精髓囊泡。
相对退役。重量=腹膜后脂肪重量/体重×100相对的Epi。脂肪重量=附睾脂肪重量/体重×100相对维护设备。重量=睾丸重量/体重×100相对附睾重量=附睾重量/体重×100相对SEM表示。重量=精囊重量/体重×100。
表2
8周和19周，腹膜后，附睾脂肪重量和生殖器官重量（ ±SD)。
3.2。饮食对生殖器官的影响

如表所示2，DIO，DIO-R，和对照小鼠没有表现出在第8周和19周的绝对平均重量睾丸或附睾的显著差异。然而，有在第8周中的相对睾丸重量显著降低的DIO组相比于对照组（ ）.与对照组在19周内比对照组相比，在DIO组中相对睾丸重量和附睾重量显着降低（ ）.DIO组8周和19周时睾丸相对重量均低于DIO- r组。DIO组和DIO- r组在8周时精囊绝对重量明显高于正常组( ）.在DIO和正常组精囊的相对重量是DIO-R基团中低于在第8周（ ）.

３．３．饮食对精子数量和活力的影响

DIO，DIO-R，并控制雄性小鼠表现出在形态学上或在8周从附睾尾收集精子总数没有差异。然而，DIO和DIO-R基团在8周表现出精子活力的显着降低28％（ )(图2 (c)）.19周，与对照组相比，DIO-R组的总精子数量显着增加（ ）.此外，DIO组的精子活力显著下降37% ( )(图2 (d)）.

3.4。饮食对血清睾酮和瘦素的影响

如表所示3.，DIO和DIO-R小鼠在8周内表现出睾酮的禁食水平降低。在8周和19周的DIO和DIO-R组比较时，在对照组中观察到显着更高的血清睾酮水平（ ）.与DIO和DIO- r组相比，8周和19周时，对照组的血清瘦素水平显著降低( 那 ）.
团体 睾酮(ng / mL) / 8 W 瘦素（Ng / ml）/ 8 w 睾酮(ng / mL) / 19 W 瘦素（ng / ml）/ 19 w
DIO 12. 7.52±0.25 * 34.87±4.37 ** 6.33±0.56 ** 13.92±1.96 * *
DIO-R 12. 6.80±0.23 * * 15.35±2.69 ** 8.68±1.68 * 10.07±1.37 *
控制 12. 10.81±1.69 1.92±0.34 12.68±0.99 1.86±0.24
笔记。数据是平均值±SE。 和 与对照组相比，表示统计显着。
表3
睾酮和瘦素在DIO，DIO-R，和对照组（水平   ± SE).
3.5。饮食对病理变化的影响

为了确认暴露于高脂饮食对睾丸组织的形态变化的影响，进行染色和电子显微镜。在高脂饮食的高脂饮食8和19周后，光显微镜谱表现出睾丸细胞的形态变化（图3.）.这些组之间没有观察到显着差异。在高脂饮食后8周和19周进行的电子显微镜检查。在对照组中，精子形成是正常的，并且在所有组中发现了精子和正常基质细胞和血管的正常形态。然而，在DIO和DIO-R基团在8周和19周内发现了大量的脂质液滴，不规则的核型和异铬酰侧侧面（图4.）.

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图3.
光显微照片显示高脂饮食8周和19周后睾丸细胞形态的变化。图中为对照组8周(a)、DIO组8周(b)、DIO- r组8周(c)、对照组19周(d)、DIO组19周(e)、DIO- r组19周(f)。切片HE染色。放大×40。
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图4.
以下8周和19周可见大量脂滴，不规则核型，和间质细胞的异侧设定（箭头）（（E），（F），（H）的饮食诱导的肥胖小鼠睾丸的电子显微镜，和（i））与对照组相比（（d）和（g））。（A）在对照组中正常精子形成，（b）中的基底膜，精原细胞，和DIO组中的初级精母细胞的正常形态，（c）中精子细胞的正常形态，（d）正常基质细胞和血管，（E）在睾丸间质细胞：在DIO组发现了大量的脂滴，不规则核型，和异侧设定的8周，（F）在间质细胞：大量脂滴，不规则核型，和异侧设定的发现在8周DIO-R基团，（G）正常睾丸间质细胞，脂肪液泡少量在对照组19周时发现，（H）在间质细胞：大量脂滴，不规则核型的，和异侧设定在DIO组中的睾丸间质细胞中发现的19周时，和（i）：不规则核型和异侧设定在DIO-R基团中发现19周。

来确定由高脂饮食睾丸组织的细胞凋亡，该细胞凋亡TUNEL测定用于定量细胞凋亡的速率。该测定表明，少数细胞是存活的（褐色染色）在对照中（图5(一个)和5（d））.在DIO-8w、DIO-R-8w、DIO-R-19w和DIO-R-19w组中可见大量凋亡细胞(棕色染色)(图)5（b）那5（c）那5（e）,5（f））.与正常对照组相比，高脂饮食使细胞凋亡率分别增加了1.24-、1.36-、1.48-和1.29倍5.）.

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图5.
图为高脂饮食8周和19周后间质细胞TUNEL凋亡检测结果。图中为对照组8周(a)、DIO组8周(b)、DIO- r组8周(c)、对照组19周(d)、DIO组19周(e)、DIO- r组19周(f)。切片用DAB染色，放大倍数设置为×40。数据为每组6只动物的平均值±SD。图中也显示了8周和19周高脂饮食对间质细胞凋亡率(g)的影响。与对照-8W组相比表示统计学显着性;与对照-19瓦特组相比表示统计学显着性。
3.6。饮食对睾丸组织氧化应激的影响

饮食对氧化应激生物标志物的影响见表4.．8周时，DIO组和DIO- r组睾丸组织中MDA水平分别为对照组的81%和14%。当与对照组，H相比2O.2水平增加至1.53倍和DIO组和DIO-R基团中，分别1.55倍。NO水平增加至DIO组和DIO-R基团分别在1.68倍。在DIO组和DIO-R组中观察到在CAT的活性的显著降低相比于对照组（ )(表4.）.然而，在T-AOC，在睾丸组织GSH，SOD和GSH-Px的水平相比，与对照组无差异。
团体 MDA
（纳摩尔/ mgprot）		 T-AOC
（U / MGPROT）		 草皮
（U / MGPROT）		 谷胱甘肽
（MGGSH / GPROT）		 H2O.2
（mmol / gprot）		 猫
（U / MGPROT）		 GSH-Px的
（U / MGPROT）		 不
（Umol / Gprot）
8周 DIO 12. 0.38±0.20 * * 1.03±0.15 50.98±10.26 12.78±1.80 16.55±3.73 * 1.07±0.31 * 15.98±3.10 0.32±0.15 **
DIO-R 12. 0.24±0.12 * 1.04±0.20 49.71±10.13 12.88±1.66 16.75±4.65 * 0.98±0.41 * 13.71±3.69 0.32±0.10 **
控制 12. 0.21±0.07 0.94±0.13 53.45±14.64 13.09±1.98 10.82±1.16 1.52±0.25 15.93±3.36. 0.19±0.03
19周 DIO 12. 0.89±0.24 * 0.73±0.23 * 71.46±10.63 13.38±1.20 * 16.68±4.35 * 0.28±0.08 * 26.26±6.34 * 0.32±0.13 * *
DIO-R 12. 1.12±0.51 * * 0.77±0.24 76.97±16.74 12.84±2.81 15.58±2.98 0.15±0.07 ** 26.03±6.34 * 0.27±0.06 *
控制 12. 0.47±0.12 0.94±0.16 71.94±7.56 10.92±2.48 12.62±2.69 0.53±0.24 33.52±5.42 0.18±0.05
笔记。数据是平均±SD。 和 与对照组相比，表示统计显着。
表4
MDA, H2O.2，T-AOC，GSH，SOD，谷胱甘肽过氧化物酶，并在8周19周睾丸组织的CAT水平（ ±SD)。

19周后，我们发现，饮食分别增加MDA水平在睾丸组织以89％和DIO和DIO-R组中的控制的138％。当与对照组，H相比2O.2DIO组为1.32倍，DIO- r组为1.23倍。DIO和DIO- r组NO水平显著高于对照组( ）.虽然DIO组和DIO- r组T-AOC水平均降低，但DIO组只有T-AOC水平显著低于对照组( ）.的GSH水平的DIO组中比对照组更高显著（ ）.与对照组相比，DIO和DIO- r组CAT和GSH-Px活性显著降低( )(表4.）.然而，与对照组相比，睾丸组织中的SOD水平没有差异。

3.7。饮食对抗氧化基因表达的影响

饮食对SOD，GSH-Px活性，过氧化氢酶，及NRF的基因表达水平的影响2在睾丸组织通过实时PCR确认。数字6.显示饮食对抗氧化基因SOD，GSH-PX，过氧化氢酶和NRF的mRNA表达的影响2在睾丸组织中定量检测基因表达。8周时，DIO和DIO- r组过氧化氢酶基因表达显著上调。其他基因表达在三组之间相似。然而，在第19周时，DIO组显示出所有研究基因的显著下调。

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图6.
2 CAT的mRNA（A），超氧化物歧化酶的mRNA（b）中，谷胱甘肽过氧化物酶的mRNA（c）中，及NRF的改变的mRNA（d）在8和19周高脂肪饮食后睾丸组织示于该图中。数据是平均值±SD，每组中的6只动物和每种RNA制备物通过实时PCR运行三次;和与对照组相比，表示统计显着。

4。讨论

睾酮是男性中最重要的性激素，并在睾丸发育，精子发生和正常男性化的维持中起着关键作用。

在青春期期间，睾丸激素参与了从男子到男子气概过渡的许多过程，包括男性性器官的健康发展。在成年期间，这种激素也在保持性欲和精子生产方面发挥着重要作用。

睾丸失调是由睾丸素分泌过少引起的。肥胖会导致荷尔蒙失调和性腺机能减退[24.]．Saboor Aftab等人发现，男性肥胖本身与较低的血浆睾酮水平有关[15.]．在本研究中，当小鼠饲喂高脂饮食8周或19周时，我们发现:(1)血浆睾酮水平降低;(2)精子活力下降;(3)间质细胞受损，凋亡增加;(4)睾丸与附睾相对系数降低。青春期肥胖可能影响成人生殖器官的功能和发育。男性肥胖可能导致性腺机能减退，这是一种与睾丸激素低有关的睾丸功能障碍。血浆睾酮水平降低在肥胖引起的男性性腺功能减退中起重要作用。

在这项研究中，我们将讨论脂肪摄入量引起的低睾酮水平的机制。

（1）病理改变的睾丸间质细胞和低睾酮诱发脂肪．间质细胞又称间质细胞，在黄体生成素(LH)存在的情况下产生睾酮。间质细胞中存在大量的光滑内质网(smooth endoplasmic reticulum, SER)，其中含有丰富的胆固醇合成酶。SER具有很强的合成胆固醇的能力，并参与雄激素的合成。当合成活跃时，观察到的脂滴少，体积小。当合成不活跃时，脂滴较多，体积较大。脂滴的数量和体积可用于评价间质细胞的功能。目前DIO组的Leydig细胞中脂滴较多，体积较对照组大。这种间质细胞脂滴的变化可能反映了DIO组间质细胞分泌睾酮功能的下降。

间质细胞凋亡增加。细胞凋亡是细胞内程序的激活导致细胞死亡而不引起炎症反应。Leydig细胞凋亡的增加反映了Leydig细胞的退行性改变，睾酮分泌也减少。与细胞凋亡相关的分子途径有很多。氧化应激的主要影响是在线粒体膜上，在线粒体膜上，Bcl-2家族中促凋亡和抗凋亡成员(如Bax和Bcl- x L或Bcl-2和Bcl- W)之间的关联被改变[25.那26.使细胞色素c释放，并最终激活caspase级联反应，最终导致细胞DNA碎裂[27.那28.]．与该途径一致，BAX可以是小鼠睾丸中的主要凋亡分子，其中在肥胖诱导氧化应激后它可能表现出增加的表达。我们将在另一种经验中证明这一点。

（2）高瘦素水平与低睾酮诱发脂肪．瘦素在啮齿动物和人类繁殖中发挥着重要作用[29.那30.]．最近的研究表明，瘦蛋白直接抑制人绒毛膜促性腺激素（hCG-）通过官能瘦素受体同种型，并以肥胖人的范围内的浓度在培养物中刺激睾酮分泌来自大鼠睾丸间质细胞[31.那32.]．其他还表明，瘦素抑制培养的大鼠睾丸样品中的基础和HCG刺激的睾酮分泌[33.]．此外，一些研究表明，瘦素水平呈负睾酮相关[34.-36.]．这种相关性与睾酮及其生物活性代谢物对瘦素生产的抑制作用有关[37.]．此外，最近提出了睾丸激素可调节OB基因表达27.]．通过Isidori这项研究表明，瘦素血症的可能在降低雄激素的男性肥胖发病机制中的作用[38.]．在这项研究中，当小鼠喂食高脂饮食8或19周时，瘦蛋白的血清浓度与睾酮相反。Caprio等人。发现OB-R表达存在于胚胎，预培养物和成人大鼠睾丸中。可以想到，雄性中的高瘦素浓度可能对Leydig细胞功能具有直接抑制作用[32.]．肥胖受试者的瘦素水平是体内hCG试验中与肥胖相关的雄激素反应降低的最佳激素预测指标[38.]．睾丸中的ob→ob- r系统可能负调控间质细胞产生睾丸激素[32.]．因此，过量的循环瘦素可能是雄性肥胖症中减少雌激素的重要作用子[38.]．

（3)脂肪摄入诱导睾丸组织氧化应激和睾丸激素水平降低．与男性不育相关的许多病症或事件是增加睾丸氧化应激导致增加在生殖细胞凋亡及后续hypospermatogenesis [氧化应激和诱导剂18.]．与男性不育相关的几种疾病，无论是治疗性的还是病理性的，都会产生更多的活性氧(ROS)，这些活性氧与细胞内抗氧化活性降低有关，无法对抗ROS介导的有害作用。Turner和Lysiak发现NO的大量增加与氧化应激有关，氧化应激可能会覆盖缺氧诱导因子1 (HIF-1)的影响，并抑制睾酮的产生[18.]．睾丸氧化应激可能与睾丸激素水平下降有关。在本研究中，MDA、NO和H2O.2增加和T-AOC（8W和19W），猫（8W和19W）和GSH-PX（仅限19W）在肥胖小鼠中降低。发现这些抗氧化酶的基因表达在19周内减少（图2(一个)-2 (d)）.NO水平的增加被认为是氧化应激导致睾丸激素产生抑制的迹象[39.]．有证据表明H2O.2NO除了作为独立的信号分子外，还可能相互关联形成氧化死亡循环。H2O.2作为导致NO产生的上游信号[18.那40]．这些结果表明，肥胖诱导的过量氧化应激产生影响了睾丸组织的正常组织结构和功能。

青春期是睾丸组织间质细胞分泌雄激素对hCG反应剧烈的复杂过程。儿童会发展出第二性征和生殖能力。青春期男孩的生育可能受到不健康环境的影响。Taneli等人证实肥胖会根据青春期阶段影响肥胖青少年睾丸间质细胞功能[41.]．此外，有报道称，青春期前严重肥胖儿童和肥胖青少年氧化应激增加[42.那43.]．Vendramini等人还发现，肥胖Zucker大鼠青春期精子产量减少[12.]．在青春期肥胖（由于脂肪积累由于脂肪积累）中睾丸组织中的氧化应激和脂质过氧化是对精子的极大毒性[44.]，睾丸组织间质细胞也可能受到影响，雄激素分泌减少。男性的第二性征和性成熟会因血浆睾酮水平降低而延迟。成年雄性的繁殖也会受到影响。然而，需要进一步的调查来证实这些问题。这些氧化剂可通过多种机制引起组织损伤，包括DNA损伤、脂质过氧化、蛋白质氧化、细胞硫醇消耗和促炎细胞因子释放的激活[40]．转录因子、核因子红系2相关因子2 (Nrf2)，是抗氧化和解毒基因表达对亲电性或氧化应激反应的中枢调节因子[45.]．Nrf2，盖帽“N”项圈基础区域亮氨酸拉链转录因子的成员在防止NRF的上调中发挥了重要作用，在预防氧化胁迫方面发挥着重要作用2有关的抗氧化剂(46.那47.]．此外，的Nrf2敲除小鼠显示在精子发生氧化破坏[48.]．在本研究中，NRF的mRNA表达2减少，以及酶促抗氧化剂的活性和mRNA表达。因此，可以通过减少NRF来改善由睾丸中高脂饮食引起的氧化应激2抗氧化途径。

有趣的是，在肥胖生殖激素失衡可能会影响睾丸的抗氧化状态。睾丸的直接内分泌环境对睾丸的抗氧化状态产生重大影响。生殖激素失衡，无论是高血糖或hypogonadotrophism，可能有助于睾丸抗氧化状态的下降。O.verstimulation of Leydig cells by chronic exposure to hCG (100 IU/day for 30 days in rats) also stimulates high levels of ROS production from these cells, which in turn stimulates lipid peroxidation, a reduction in antioxidant enzyme activities, germ cell apoptosis, and consequently disruption of spermatogenesis [49.]．相比之下，研究表明，治疗包括暴露于内分泌破坏器的暴露，这减少了睾酮的内分泌浓度抑制抗氧化酶如GPX，SOD和过氧化氢酶的睾丸表达[50.那51.]．当外源性促性腺激素施用于人为升高的内部内睾酮水平时，这些抑制对抗氧化剂表达的影响以及精子发生的破坏可以逆转[51.那52.]．在本研究中，睾丸组织中观察到低水平的睾酮和高氧化应激。这些发现进一步证明，激素失衡会加重肥胖状态下睾丸组织的氧化应激。然而，这一课题还需要进一步的研究。

总之，短期 - （8周）和长期（19周）高脂饮食增加了Leydig细胞病理损伤，细胞凋亡率，脂质过氧化和血清瘦素水平;减少精子数，精子运动，相对睾丸重量和睾酮水平;抑制猫和GSH-PX酶的活性;猫，草皮，gsh-px和nrf减少2信使rna表达。青春期肥胖可能影响成人生殖器官的功能和发育。睾丸间质细胞的病理损伤、睾丸组织的氧化应激和高瘦素水平可能为阐明男性SH在肥胖中的作用机制并可能起到预防作用提供了证据。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

承认

国家自然科学基金资助项目(no . 81202227, no . 30800920)。

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