文摘
增加nitroxidative压力会导致线粒体功能障碍的影响通过线粒体DNA的氧化修饰,脂质和蛋白质。持续的线粒体功能障碍糖分会让目标细胞/器官病理的其他危险因素,从而最终导致更严重的疾病的发展在酒精和非酒精性脂肪肝病。非酒精性脂肪肝疾病的发生率不断增加,由于高代谢综合征患病率包括高血脂、高胆固醇血症、肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病。许多线粒体蛋白质包括酶参与可以氧化脂肪氧化,提高能源供应(包括修改年代亚硝基化/硝化)nitroxidative增加下压力,从而灭活,从而增加了脂肪堆积,ATP耗竭。演示的底层机制(s)线粒体功能障碍,我们雇了一个使用生物素-氧化还原蛋白质组学方法N马来酰亚胺(biotin-NM)作为敏感biotin-switch探针识别线粒体蛋白质的氧化半胱氨酸残基在酒精和急性肝病的实验模型。这篇文章的目的是简要描述机制,功能的后果,和线粒体功能障碍的检测方法。我们还描述Cys-targeted氧化还原蛋白质组学方法的优势和局限性与替代方法。最后,我们讨论该方法的各种应用程序在研究氧化改性线粒体蛋白在肝外组织或不同的亚细胞的细胞器和转化研究。
1。介绍
线粒体是负责生产的能源形式的ATP所使用的每一个细胞的生存和功能。此外,线粒体脂肪酸氧化中发挥关键作用,抗氧化防御,细胞凋亡,中间代谢(包括氨、尿素、血红素、类固醇、嘧啶、一个碳转移,和谷氨酰胺代谢),等等,1- - - - - -3]。线粒体的脂肪氧化途径是非常重要的在提供替代能源(如酮体)当葡萄糖供应数量有限或不用于最大能源生产通过线粒体三羧酸循环在各种疾病(1]。众所周知,沉重和慢性酒精(乙醇)摄入引起酒精性脂肪肝,肝病(炎症),肝纤维化、肝硬化,和致癌作用在人类和实验动物模型(4,5]。因为酒精的高溶解度,这是大多数组织分布;因此,过度饮酒(例如,狂欢或慢性酗酒)可以破坏几乎所有组织包括肝脏、心脏、大脑、肺、胰腺和睾丸(6- - - - - -8]。连续食用calorie-enriched choline-deficient饮食的高脂肪饮食或管理实验动物也能造成严重的脂肪肝(即。非酒精性脂肪肝病)(9,10),类似于前面提到的酒精性脂肪肝的临床疾病。此外,急性和慢性感染肝炎病毒可以增加氧化应激,导致各种肝脏疾病包括肝纤维化、肝硬化的程度取决于host-viral相互作用[11]。某些药物如antibreast癌症代理他莫昔芬和抗逆转录病毒药物包括AZT(齐多夫定)能促进脂肪肝([12),这里和引用)。同样,滥用物质,如大麻(大麻类),尼古丁(烟草烟雾的主要组成部分),和3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA、摇头丸)会导致肝脂肪变性和炎症(肝病)[13- - - - - -15)以及肝外器官组织损伤包括大脑和心脏(16- - - - - -19]。
不管病因学因素,包括酒精和非酒精性脂肪肝疾病可以从线粒体功能受损(即结果。,线粒体功能障碍)和抑制β氧化脂肪酸(2,12,20.]。此外,一些外生代理(例如,酒精或高脂肪饮食)单独或结合其他相关基因疾病的风险因素会损害肝脏协同/添加剂的方式迅速促进或恶化先前存在的条件下,观察大鼠(21]。还知道其他肝外组织可以负面影响或受到环境因素的组合(例如,过量的饮酒,吸烟,药物,和滥用物质)和遗传因素(例如,疾病易感基因的变化如显性负线粒体醛脱氢酶(ALDH2)基因的突变,经常发现在许多东亚人(22- - - - - -25),糖尿病,肥胖,和神经退行性疾病)(图1)。事实上,线粒体功能障碍可以作为许多疾病的主要因素如酒精或drug-mediated组织损伤、衰老、癌症、糖尿病和各种神经退行性疾病(20.,26- - - - - -31日),尽管每个疾病的病因状态是不同的。尽管在许多疾病的线粒体功能障碍的作用,鲜为人知的是线粒体功能障碍发生在这些病理条件。在本文中,我们简要描述nitroxidative压力的作用在促进线粒体功能障碍及其病理生理后果。我们还描述氧化改性线粒体蛋白质的检测实验模型的酒精和非酒精性脂肪肝病redox-based蛋白质组学方法。最后,我们讨论潜在的局限性和应用氧化还原蛋白质组学方法研究氧化改性蛋白质在不同亚细胞分数在各组织以及未来的转化研究。
2。氧化应激的作用在促进线粒体功能障碍
在正常情况下,大约有1% - -2%的氧气泄漏是活性氧(ROS)的线粒体电子传递链(等)32]。这些大量的活性氧,充分处理的细胞防御系统在正常情况下,可以调节各种细胞信号通路,正如最近讨论(33]。然而,在病理条件下或在接触某些有毒制剂包括大量的酒精,滥用物质,或其他治疗药物(17- - - - - -20.,30.),从线粒体活性氧的大量泄露等,可能在复杂的网站我(NADH泛醌氧化还原酶)和复杂的三世(辅酶q细胞色素c氧化还原酶),如alcohol-exposed所示肝细胞(34]。具有讽刺意味的是,线粒体,细胞活性氧的主要来源,成为氧化损伤的主要目标,因为相对低水平的抗氧化剂,如减少谷胱甘肽(GSH),线粒体细胞溶质(相比35]。一致的概念ROS-mediated损伤,线粒体在动物疾病模型和/或组织人类疾病显示异常和不规则的形状和功能下降36,37]。
除了从线粒体ROS生成等,其他细胞酶也被认为是产生活性氧和活性氮物种(RNS)包括一氧化氮(NO)。这些酶包括NADPH氧化酶和髓过氧物酶免疫细胞吞噬,ethanol-inducible细胞色素P450 2 e1 (CYP2E1)和CYP4A在内质网(ER)同功酶,胞质黄嘌呤氧化酶,一氧化氮合酶同功酶包括激活枯否细胞中诱导形成(间接宾语)和/或招募中性粒细胞(38- - - - - -45]。许多这些prooxidant酶是诱导或激活后暴露于潜在的有毒制剂如酒类、摇头丸和高脂肪饮食。从线粒体ROS升高泄露等,由这些酶导致增加生产的强有力地有毒的过氧亚硝基(ONOO−)的存在。过氧亚硝基可以共价修改各种蛋白质通过硝化酪氨酸残基的46,47),年代亚硝基化作用的半胱氨酸残基48]。事实上,ROS升高/ RNS病理条件下压制各种抗氧化酶的活动包括线粒体超氧化物歧化酶(SOD2)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶,谷胱甘肽还原酶,而他们也可以减少细胞水平的抗氧化剂谷胱甘肽和维生素等,从而导致nitroxidative压力上升。
条件下nitroxidative压力升高,线粒体DNA,蛋白质,油脂被氧化共价修饰,亚硝化和/或硝化。增加nitrosative压力可以导致各种反应,包括N- - - - - -,O- - - - - -,年代-nitrosations修改各种蛋白质的结构,综述了(49- - - - - -52]。Nitrative压力是一个条件,过量的活性氧反应没有产生强有力地有毒的过氧硝酸盐,硝酸盐酪氨酸残基的各种蛋白质产生3-nitroTyr,经常用作Nitrative压力稳定的标志(48- - - - - -52]。这些类型的修改细胞大分子可能有助于改变他们的正常功能(53- - - - - -55]。删除和/或通过氧化修饰的线粒体DNA突变尤为重要,因为它们编码13多肽,所有的子单元4线粒体等蛋白质(即。配合物我,III, IV, V) [30.,31日]。线粒体DNA和蛋白质更容易氧化/ nitrative损害由于缺乏保护性的抗氧化剂过氧化氢酶蛋白,组蛋白或多胺和相对较低的活动相比,线粒体DNA修复酶核([56),这里和引用)。一份报告表明,线粒体DNA的突变是高10倍的速率比核DNA (29日]。此外,线粒体谷胱甘肽的水平相比相对较低,在胞质,因为它必须导入线粒体通过特定的谷胱甘肽转运蛋白由于缺乏线粒体的合成。此外,慢性酒精暴露削弱了谷胱甘肽转运蛋白,导致线粒体(选择性缺乏谷胱甘肽(35),这里和引用)。因此合理假设线粒体DNA的氧化损伤和/或删除(57,58)可能会导致降低线粒体等蛋白质的表达和功能,导致更大的活性氧产量,见alcohol-exposed老鼠(59]。
氧化脂质也会产生有效的细胞毒性4-hydroxynonenal等脂质过氧化物(4-HNE)和丙二醛(MDA)。这些脂质过氧化物可以抑制许多线粒体蛋白质如ALDH2的活动(60),参与代谢活性乙醛和4-HNE Sirt3河畔+端依赖脱乙酰酶(61年),通过共价修改(主要是通过与许多氨基酸残基加合物的形成包括半胱氨酸,他和赖氨酸)(54,55]。这些脂质过氧化物可以改变细胞膜的功能,促进纤维化通过星状细胞的活化与提高生产的胶原蛋白和促炎细胞因子/趋化因子,导致招募中性粒细胞和巨噬细胞的活化枯氏细胞。所有这些事件与增加脂肪堆积引起的线粒体功能障碍和肝脏组织损伤和各种肝外器官(4,5,28,29日]。
许多调查人员报告的机制和后果增加水平的线粒体DNA氧化和脂质过氧化物在各种人类疾病状态以及对人类疾病实验模型(12,53,57,62年,63年]。与众多报道(线粒体)DNA和脂质氧化的修改,数量小得多的报告系统地处理下的氧化改性(线粒体)蛋白质增加nitroxidative压力与许多疾病有关。我们相信原因的报道相对较少的一部分蛋白质氧化、亚硝化,和硝化反应可能是由于要求特定的试剂,缺乏适当的方法来系统地识别和去除氧化改性蛋白质,和高度敏感的相对较晚发展质量光谱仪器。因为延迟发展的特定的方法系统地研究氧化改性蛋白质,以下问题不好回答:(1)我们有一个合适的方法来系统地确定氧化改性蛋白质和研究线粒体功能障碍的原因相比,全球分析线粒体蛋白质的变化?(2)什么是活性氧的来源/ RNS增强氧化蛋白质的修改(包括氧化和硝化)?(3)(线粒体)蛋白质氧化改性?(4)是他们的活动/函数改变氧化后修改吗?(5)氧化蛋白质的功能意义是什么在线粒体功能障碍和某些疾病如各种型号的脂肪肝?(6)可以氧化蛋白修改和后续的线粒体功能障碍与一个潜在的治疗预防代理商吗?和(7)目前脂肪肝的治疗方法如何影响线粒体蛋白质的功能和氧化?
3所示。线粒体功能障碍的后果
尽管遗传和环境因素协同促进线粒体功能异常在不同病理生理条件下,增加nitroxidative压力(图代表一个重要的共同因素1)。尽管nitroxidative压力升高的行之有效的病理作用,它一直知之甚少的线粒体蛋白质氧化改性以及其功能变化是否引起线粒体功能障碍之前,全面组织损伤由组织学和生化评估。因此,我们推测,线粒体功能障碍是由共价修改(如氧化、亚硝化、硝化、磷酸化、乙酰化、等)各种线粒体蛋白质,导致其失活或损失的生物功能。在线粒体功能障碍的情况下,我们希望观察水平的能源消耗增加,脂质过氧化反应,和脂肪积累可能由于ATP酶的合成,抑制活动ALDH2-mediated代谢和脂肪酸β分别氧化。在本文中,我们简要描述氧化改性ATP合酶的功能变化,ALDH2, 3-ketoacyl-CoA硫解酶(硫解酶)作为例子。
Cederbaum et al。64年和陈等。65年,66年)报道,酒精政府直接或间接抑制线粒体的活动复杂酶通过增加氧化应激。也可能减少大量的复杂我(NADH泛醌氧化还原酶),和复杂的IV(细胞色素c氧化酶)观察到alcohol-exposed老鼠(59)可能有助于抑制他们的催化活动。抑制这些复杂的活动可能导致更多的线粒体ROS泄漏等,作为alcohol-exposed观察肝细胞(34]。此外,可以产生活性氧的线粒体复合体II(琥珀酸脱氢酶)33]。
通过执行氧化还原蛋白质组学分析,我们试图确定在大鼠肝脏线粒体氧化修改复杂的蛋白质暴露于慢性或暴酒精相比,控制大鼠(67年]。许多线粒体蛋白质包括氧化复合物,III和V蛋白质亚基被检测到。复杂活动测量表明,ATP合酶(V)在alcohol-exposed显著抑制大鼠可能通过氧化修改(包括硝化)的酶67年]。免疫印迹分析anti-3-nitroTyr抗体证实存在3-nitroTyr-reactive乐队的免疫沉淀反应仅从alcohol-exposed肝脏ATP合酶蛋白,表明其硝化。质谱分析证实了硝化酪氨酸残基的催化β亚基,没有半胱氨酸残基,但一定是copurified Cys-containingα亚基的ATP合酶(67年]。硝化的ATP合酶催化亚基可能导致其失活。明显抑制ATP合酶可能导致显著降低ATP水平,观察到在许多病理条件(68年,69年]。
系统的氧化还原蛋白质组学分析线粒体蛋白质氧化改性的实验模型的急性肝病引起的酒精,MDMA,或肝脏I / R损伤显示所有4酶的检测(碳链脂肪酸酰coa脱氢酶,enoyl-CoA水合酶,3-hydroxyacyl-CoA脱氢酶,和硫解酶),参与线粒体β氧化脂肪酸(15,67年,70年]。活动测量硫解酶,最后在线粒体酶β脂肪酸的氧化途径,抑制这种酶在酒精性脂肪肝疾病的动物模型,可能通过氧化改性的活性部位半胱氨酸残基(半胱氨酸92年和半胱氨酸382年)的硫解酶(67年]。很可能的活性位点半胱氨酸残基可以发生氧化包括年代亚硝基化作用以及形成加合物4-HNE或MDA,因为他们的水平可以通过脂质过氧化增加氧化应激。因为3其他酶的氧化修饰β氧化途径,正如上面提到的,我们希望他们的活动可以改变alcohol-exposed老鼠。此外,很可能NAD的活动+端依赖3-hydroxyacyl-CoA脱氢酶可以破坏由于NAD发生相当大的变化+饮酒后/ NADH水平(4,39]。无论如何,氧化的修改和后续抑制线粒体的至少一个脂肪氧化途径酶与肝脏炎症和脂肪积累,生化测量评估的甘油三酯以及组织学评估(67年]。
从氧化还原蛋白质组学分析,我们还发现了一些氧化改性线粒体ALDH同功酶线粒体从alcohol-exposed老鼠(67年]。ALDH基因家族(71年,72年)代表大量的NAD (P)+防守端依赖脱氢酶(酶)73年- - - - - -75年)参与细胞代谢活性和细胞毒性醛羰基化合物如乙醛、MDA、4-HNE和其他脂肪醛产生脂质过氧化过程中(54,76年]。ALDH2 ALDH同功酶包括线粒体是由遗传和环境因素(灭活22- - - - - -25,71年,72年,77年- - - - - -79年和许多疾病80年- - - - - -83年]。许多的同功酶ALDH基因家族成员包括视网膜醛脱氢酶(ALDH1A1/2/3)和10-formyltetrahydrofolate脱氢酶(ALDH1L1)包含高度保守的半胱氨酸残基活性区(84年]。氧化修饰的活性部位和其他关键的半胱氨酸残基的胞质high-Km ALDH1A1和线粒体low-Km ALDH2(乙醛µM≤0.2公里)(75年),一个重要的酶乙醇氧化过程中产生有毒乙醛的代谢,有助于抑制他们的活动(67年,84年]。在我们的实验条件下,我们没有观察到任何重大ALDH2 ALDH1A1或蛋白质含量的变化,强烈建议这些ALDH的酶的抑制作用可能是由于共价修改重要的半胱氨酸残基年代亚硝基化和其他氧化修改,讨论(85年,86年]。我们的结果是一致的与万卡特拉曼·莱马克里斯等人报告抑制ALDH2活动在不改变其内容alcohol-exposed老鼠,尽管ALDH2镇压活动与0.3毫米孵化后没有恢复βALDH2巯基乙醇,暗示不可逆失活在他们的模型中(87年]。虽然我们没有测量的具体活动等其他线粒体ALDH同功酶ALDH5A1 (NAD+端依赖琥珀semialdehyde脱氢酶参与神经递质γ-氨基丁酸)的分解代谢,ALDH6A1 (methylmalonate semialdehyde脱氢酶),和ALDH7A1 (α-aminoadipic semialdehyde脱氢酶)71年,88年),他们的活动有可能抑制由于高度保守的活性部位半胱氨酸残基通过一个类似的机制,与线粒体ALDH2[最近发布了67年,70年,85年和胞质ALDH1A184年]。因为ALDH1A1的失活,ALDH2和其他ALDH同功酶通过共价修改等年代亚硝基化作用[67年,85年],磷酸化[89年),和其他的修改(86年包括加合物的形成与MDA或4-HNE [60,90年)或活性药物代谢物(78年,79年),我们预计水平的提高高活性和细胞毒性羰基化合物包括乙醛,4-HNE和MDA。
除了ALDH同功酶,许多其他线粒体蛋白质氧化改性和alcohol-exposed鼠肝脏灭活(67年)(图2)。我们也观察到类似的氧化模式修改线粒体蛋白在急性肝脏疾病的动物模型肝脏I / R损伤(70年)或MDMA暴露(14,91年),或在fasting-related氧化应激(92年]。我们希望类似的许多线粒体蛋白质的氧化模式修改将在实验模型识别高脂肪饮食造成的非酒精性脂肪肝病(76年)或蛋氨酸/ choline-deficient饮食(10,45),基于增加氧化应激和类似课程酒精和非酒精性脂肪肝疾病之间的疾病进展(9]。
4所示。线粒体功能障碍和脂肪肝研究氧化还原蛋白质组学方法
如果可以的话,最好每个氧化改性的活性改变线粒体蛋白质可以测量准确评估和功能影响线粒体功能障碍的程度在不同病理条件或之前和之后暴露于潜在的毒性药物包括酒精或其他滥用摇头丸和尼古丁等物质。然而,这项任务可能是不切实际的由于一个相对较小的收益率从整个组织的线粒体蛋白质提取并要求大量的线粒体蛋白质直接测量活动。作为替代方法,其他方法包括全球DNA微阵列基因表达和蛋白质组学分析被用来间接评估的相对程度的线粒体功能障碍(68年,93年]。虽然DNA微阵列允许全局分析的基因表达变化的疾病可能与正常的控制条件,结果并不总是准确反映最终蛋白质数量或活动的变化(线粒体)蛋白质68年,94年,95年]。因此,一些蛋白质组学方法有或没有凝胶工具最近发展到定量评估许多蛋白质的表达水平的变化在两个不同的标本(如疾病显然状态和正常对照组)。最近的方法包括荧光2 d差异凝胶电泳(2 d消化)96年),可分裂的isotope-coded亲和标签(cICAT) [97年),等压标签进行相对和绝对定量(iTRAQ) [98年),多维蛋白质识别技术(MudPIT) [99年),等等。这些全球蛋白质组学方法也可以用来研究线粒体蛋白质的定量变化。此外,传统的蛋白质组学方法组成的比较二维凝胶分析成功地用于分析蛋白质的变化在整个组织中提取(83年,One hundred.]或丰富的线粒体分数从alcohol-exposed老鼠相比,相应的控制59]。然而,尽管优势和优点,所有这些全球蛋白质组学方法不一定提供有价值的信息功能变化的目标蛋白质,因为许多(线粒体)蛋白质的活动可以抑制不显著的定量变化的内容,与ALDH2证明(67年,70年,87年]。这些结果,而表明许多(线粒体)蛋白质的功能/活动可以通过转译后的修改,如修改许多氨基酸包括半胱氨酸残基、氧化硝化酪氨酸残基,Ser的磷酸化,刺和酪氨酸残基,赖氨酸残基的乙酰化,糖基化的Asn残留物,并与4-HNE加合物的形成,或活性药物代谢物(65年- - - - - -67年,77年- - - - - -79年,86年,101年- - - - - -103年]。而不是研究共价修改各种氨基酸残基(如半胱氨酸,Trp,他满足,Pro,酪氨酸,和赖氨酸),可以以不同的方式修改55),我们和其他科学家专注于目标蛋白质组学方法的目标氧化改性的半胱氨酸残基的蛋白质可以通过亲和纯化矩阵,在2 d显示页面凝胶,与银染色,通过mass-spectral识别分析。氧化改性蛋白的识别检测与Cys-targeted氧化还原蛋白质组学方法和文献搜索活性部位的半胱氨酸残基氧化蛋白质允许我们预测功能变化(例如,潜在抑制)的氧化蛋白质/酶即使没有任何蛋白质含量的变化。
为了研究氧化失活的线粒体蛋白质负责导致线粒体功能障碍,几个氧化还原蛋白质组学的方法被用来确定氧化半胱氨酸残基(s)的许多蛋白质利用ICAT [97年),biotin-labeled碘乙酰胺(BIAM) [104年],4-iodobutyltriphenyl-phosphonium [87年),或生物素-N马来酰亚胺(biotin-NM) [105年),作为主要sulfhydryl-detecting代理在每个方法。虽然每个检测方法都有自己的优点,我们的方法使用biotin-NM作为氧化半胱氨酸残基的具体调查显示之间存在一种正相关的氧化应激水平病理条件和氧化蛋白质的数量(105年]。因此,我们认为,氧化还原蛋白质组学方法使用biotin-NM作为敏感探头检测氧化半胱氨酸残基可能显著优于其他氧化还原蛋白质组学方法,在氧化蛋白质的数量可能是负相关的增加氧化应激和氧化半胱氨酸残基不有效地反应iodoacetamide-based巯基试剂BIAM和ICAT87年,97年,104年]。的具体过程、优点、局限性和替代方法的方法及其与其他氧化还原蛋白质组学方法最近详细描述(106年]。优秀的评论文章在理论、福利和各种氧化还原蛋白质组学方法的局限性从其他实验室也可以(107年- - - - - -112年]。
为了避免冗余的先前的评论(106年- - - - - -112年],我们简要描述的过程简单的氧化还原蛋白质组学方法,概述了图3。许多含巯基的组织各种蛋白质可以氧化修改(例如,次磺酸,二硫化亚磺酸、磺酸、和混合二硫化等年代亚硝基化)增加nitroxidative状态。剩下的半胱氨酸自由硫醇各种蛋白质是最初的反应N-ethylmaleimide (NEM)不可逆转地阻碍了自由硫醇。后去除多余NEM通过凝胶过滤的第一步,包括混合氧化半胱氨酸残基二硫减少自由半胱氨酸与德勤硫醇。新降低半胱氨酸自由硫醇与biotin-NM切换。后去除多余biotin-NM第二凝胶过滤步骤,biotin-labeled氧化蛋白质检测到免疫印迹分析或affinity-purified streptavidin-agarose珠子进行进一步的特征。洗后是非绑定蛋白,agarose-bound biotin-NM-labeled氧化蛋白质溶解和分析通过检测一维页面anti-biotin单克隆抗体或蛋白质2 d页面显示质量光谱分析鉴定紧随其后。通过使用一个温和的还原剂抗坏血酸盐或谷胱甘肽(113年,114年)而不是减少步骤的德勤NEM-modified蛋白,我们可以专门检测蛋白质混合二硫化(例如,年代-cysteinylation,年代亚硝基化,年代-glutathionylation,年代-succinylation),尽管ascorbate-mediated biotin-switch方法可以产生假阳性构件(115年,116年]。
事实上,我们使用这种氧化还原蛋白质组学的方法来识别许多氧化线粒体蛋白质在人类肝癌ethanol-exposed E47-HepG2细胞稳定转染人类CYP2E1在乙醇代谢可以产生活性氧(38,39]。氧化蛋白质的数量与乙醇和乙醇浓度呈正相关曝光时间以及CYP2E1的存在。相比之下,我们观察到一个非常有限的氧化E47-HepG2细胞的线粒体蛋白质控制样本没有处理乙醇或HepG2细胞没有转染CYP2E1 [105年]。这种biotin-switch氧化还原蛋白质组学的方法被应用于分析氧化改性线粒体蛋白质在酒精性脂肪肝的实验动物模型67年)和其他模型的急性肝脏疾病(15,70年]。从这些研究结果显示,许多线粒体蛋白质氧化改性和他们的一些活动我们测量被抑制。时序分析氧化改性蛋白质和肝脏组织学表明,线粒体功能障碍发生很久以前外表成熟的肝损伤包括坏死性炎症(70年]。基于这些结果,氧化改性和许多线粒体蛋白质的失活导致线粒体功能障碍,从而导致组织损伤在之后的时间点观察。此外,我们预计,这种氧化还原蛋白质组学方法可以成功地用于识别和研究氧化改性蛋白质的功能改变在线粒体功能障碍和各器官组织损伤人类疾病的标本。
虽然这些氧化还原蛋白质组学方法可以作为替代方法来估计线粒体功能障碍的程度,他们确实有一些局限性。例如,我们相信氧化蛋白质的实际数字可能更大于我们在研究观察到由于相对贫穷的敏感性凝胶redox-proteomics方法检测蛋白的表达量低。事实上,我们的系统分析使用Cys-targeted biotin-switch方法无法检测氧化修饰的DNA修复酶如O6-methylguanine-DNA-methyltransferase,尽管这种酶含有半胱氨酸在其活性部位,可以灭活年代亚硝基化作用[117年]。同样,我们也希望一些关键酶参与细胞代谢/信号通路如线粒体,Sirt3 [118年- - - - - -120年]或含有至关重要的转录因子,无法检测到的半胱氨酸残基氧化还原蛋白质组学方法虽然可以通过增加氧化氧化改性,从而灭活/ nitrative病理条件下压力。此外,一些氧化或硝化蛋白质可以通过ubiquitin-dependent迅速退化和独立的蛋白水解作用[55,121年- - - - - -124年),因此无法检测到当前氧化还原蛋白质组学方法。
我们相信,这些限制与各种氧化还原蛋白质组学方法可以克服功能分析(包括酶活性测定)补充免疫沉淀反应的靶蛋白,尽管低水平的表达,免疫印迹分析anti-Cys——紧随其后年代-不,anti-glutathione anti-3-nitroTyr抗体检测年代亚硝基化,年代分别-glutathionylation,硝化。几个例子的其他关键蛋白质,少量表达,而不是系统检测到的氧化还原蛋白质组学分析,但据报道,通过氧化抑制修改,(最近被讨论106年]。感兴趣的其他重要的线粒体蛋白质是否表达了少量的(例如,sirtuin 3)可以通过氧化灭活修改,从而直接导致线粒体功能障碍与能源供应不平衡(118年),不耐寒冷暴露与减少脂肪氧化禁食期间(119年],减少线粒体复杂的活动(120年),观察小鼠线粒体缺陷sirtuin蛋白3基因。最近的一份报告显示,半胱氨酸280年关键绑定锌渣,Sirt3 4-HNE修改,导致其变构失活(61年]。这也将是研究感兴趣的氧化失活或退化的潜在机制中观察到的一些转录因子如NFkB alcohol-exposed肥胖老鼠基因(125年)和PPARα主要监管机构参与脂肪代谢的酶(126年并显示减少alcohol-fed老鼠(127年),在鼠非酒精性脂肪肝炎128年),或者在中和急性肝损伤(129年]。最后,研究ER-associated药物代谢蛋白质如细胞色素P450,催化部位的半胱氨酸残基,可能提供重要的见解在催化循环的解偶联药品不良反应(130年]。
氧化还原蛋白质组学的另一个限制可以推断,许多蛋白质的半胱氨酸残基可以接受各种类型的共价修饰如共轭羰基化合物如4-HNE和MDA升高在脂质过氧化作用下氧化应激(54,90年,131年]或对乙酰氨基酚的活性代谢产物,代谢过程中产生的潜在的有毒化合物(77年- - - - - -79年,124年,129年]。事实上,氧化改性蛋白质的数量acetaminophen-exposed肝组织出现相对较小([132年],Abdelmegeed et al .,未发表的观察)尽管nitroxidative压力增加124年]。这些数据可能反映了一个事实,许多蛋白质中半胱氨酸残基氧化acetaminophen-exposed组织可以抑制由于事先与活性代谢物的交互N乙酰-p苯醌亚胺,因此不能被氧化还原蛋白质组学方法。然而,这些类型的不可逆转的关键目标蛋白质的半胱氨酸残基的加合物的形成可以评估功能的恢复活动后孵化与德勤等强还原剂。如果活动由德勤恢复,通过形成可逆的半胱氨酸残基的蛋白质可以修改sulfenic酸或二硫化包括混合二硫化。如果没有恢复活动,半胱氨酸残基有可能修改通过不可逆加合物的形成54,90年,133年半胱氨酸残基的]或hyperoxidation sulfinic (−SOOH)和磺酸(−SOOOH)酸([17),这里和引用)。这些类型的不可逆转的可能性修改可以进一步证实了免疫沉淀反应的靶蛋白免疫印迹分析紧随其后anti-4-HNE或anti-acetaminophen抗体。
5。应用氧化还原蛋白质组学方法检测氧化蛋白质亚细胞的细胞器,许多其他组织,不同的疾病状态
我们到目前为止所描述的线粒体的氧化修饰蛋白质和它们的功能的后果在脂肪肝的实验动物模型。然而,很逻辑来预测蛋白质位于其他亚细胞的细胞器(如细胞质,呃,和核分数)也可以氧化改性,从而导致组织损伤。例如,氧化失活ER-resident伴护蛋白质(如蛋白二硫化物异构酶和其他热休克蛋白质)会导致蛋白质错误折叠或展开自己的客户端,导致的蛋白质反应和ER应激。氧化修饰和潜在的核蛋白质如DNA修复酶的失活包括O6-methylguanine-DNA-methyltransferase [117年]或Ogg1 [56)可以解释水平的提高DNA氧化改性后暴露于潜在的有毒化合物或病理条件下。
理解ER应激的机制及其病理作用,我们也应用了简单biotin-switch氧化还原蛋白质组学方法系统地描述氧化改性实验动物肝蛋白质在细胞质和ER的酒精和非酒精性脂肪肝病134年- - - - - -136年]。我们的氧化还原蛋白质组学数据显示,许多ER-located伴护蛋白质包括蛋白二硫化物异构酶、热休克蛋白、胞质等抗氧化酶SOD (SOD1)和酶类氧化灭活134年,135年]。与这些结果相一致的是,我们观察到增加的蛋白质反应alcohol-exposed E47-HepG2肝癌细胞和实验动物(未发表的观察)。也有可能这些蛋白质可以通过加合物形成抑制MDA或4-HNE,最近报道(133年]。这些结果表明,ER应激增加,可能源于线粒体功能障碍(95年)或非耦合细胞色素P450催化循环(130年),也可能导致组织损伤。
在特定的病理条件下或疾病状态,某些选定的组织是负面影响。例如,大脑组织选择性的不良在神经退行性疾病50)或暴露于神经毒性药物后,心脏和血管在心血管疾病可以妥协。众所周知,nitroxidative这些病理条件的压力是一种常见的因素在不同的组织(图1)。然而,它了解甚少,蛋白质氧化不同疾病状态下修改。通过分析氧化改性蛋白质在不同的组织,我们也可以预测每个靶蛋白的功能改变。此外,它的利益是否相似组线粒体蛋白质氧化改性在不同器官/组织(例如,肝脏和其他肝外组织如脑、心、肺、肾、胰腺和小肠)或不同的物种(例如,啮齿动物和人类)在氧化还原蛋白质组学分析的方法。我们的未发表的初步结果表明氧化蛋白质MDMA-exposed大脑组织的整体模式类似于MDMA-exposed肝脏组织,除了肝脏特异性蛋白质包括酶参与线粒体脂肪氧化途径。通过比较氧化蛋白质在不同组织和修改的模式物种,我们可以估算出特定的蛋白质的作用在线粒体功能障碍和疾病进展的每一个器官或疾病状态。
6。潜在的氧化还原转化应用蛋白质组学方法评价有益剂预防或治疗线粒体功能障碍
一旦我们理解线粒体功能异常和ER应激的机制,导致组织损伤,需要开发一个有效的策略对线粒体功能障碍的预防或治疗和器官损害基于我们的知识。我们相信redox-based蛋白质组学方法可以用于转化研究通过评估的有效性或进步一定有益剂治疗(例如,抗氧化剂或细胞保护剂从天然和合成的起源)。这个任务可以通过监测水平的氧化改性线粒体蛋白质在生物标本之前和之后的治疗有益的代理。举例来说,我们最近演示了有益的饮食含有多不饱和脂肪酸(PUFA)与花生四烯酸和二十二碳六烯酸的生理水平有效地防止蛋白质氧化,线粒体功能障碍,并最终酒精脂肪肝(137年]。这些结果中观察到大鼠符合PUFA的有益效应对酒精性脂肪肝饮食在猴子138年)和非酒精性脂肪肝choline-deficient高脂肪饮食喂养的大鼠(139年]。我们的研究结果也提供了生理上的潜在机制相关级别的PUFA施加有益的影响对酒精性脂肪肝大鼠(137年和猴子138年]。
如图4,数量和水平的氧化改性线粒体蛋白质增加alcohol-fed控制老鼠(基乙醇)相比pair-fed控制老鼠(基本控制)。我们的结果(137年]表明,增加生产的过氧化氢和过氧亚硝基alcohol-exposed老鼠(基乙醇)pair-fed相比对照组(基本控制)。这些结果是一致的水平升高CYP2E1和伊诺ethanol-fed老鼠。免疫印迹分析氧化蛋白质从每组显示氧化改性硫解酶的存在αatp合酶只在Base-ethanol组。然而,水平的提高氧化蛋白质Base-ethanol组明显减少相同数量的喂养的大鼠酒精的PUFA (PUFA-ethanol)。添加PUFA ethanol-fed老鼠(PUFA-ethanol)组织学改善数据(即。,disappearance of fat vacuoles) with the absence of the oxidized protein bands of both thiolase andαatp合酶只发现Base-ethanol组。此外,硫解酶的各自活动,ATP合酶,和ALDH2压制Base-ethanol组,都是恢复PUFA-ethanol组。进一步的研究显示,PUFA饮食明显阻止激活/感应CYP2E1和进气阀打开,产生活性氧和RNS,分别观察到alcohol-exposed组织(基乙醇)。因此,强有力地有毒的过氧亚硝基的水平升高,可以年代-nitrosylate半胱氨酸残基硝酸和/或各种蛋白质的酪氨酸残基(48],降低PUFA-ethanol组相比在alcohol-fed控制老鼠(基乙醇)。
(一)
(b)
(c)
(d)
在我们机械的研究I /相关xr线粒体功能障碍,我们也能够评估的有益作用过氧亚硝基清道夫金属卟啉MnTMPyP与线粒体功能障碍和急性肝脏I / R损伤(70年]。MnTMPyP预处理明显抑制血清转氨酶水平的I /相关xr高程,组织学损伤,伊诺表达式,和氧化修改关键线粒体蛋白质的评估比较二维凝胶分析每个样本。这些变化进一步支持的活动测量线粒体ALDH2的硫解酶和ATP合酶以及组织病理学评价。这些研究为转化研究提供证据的应用氧化还原蛋白质组学方法对线粒体功能障碍和器官损伤在众多疾病状态。我们预计,有利影响等许多天然抗氧化剂代理polyenephosphatidylcholine [140年,141年),年代腺苷甲硫氨酸(142年),白藜芦醇(143年),姜黄素(144年,145年],水飞蓟素(144年,145年]或各种合成药物如维生素E类似物和卡维地洛146年)对线粒体功能障碍和氧化组织损伤可以通过演示redox-based蛋白质组学方法。此外,氧化还原蛋白质组学方法也可以用于发现疾病的潜在生物标记物在其他肝外组织包括大脑、心、肺、肾从实验模型以及人体组织标本。
缩写
| ALDH2: | 线粒体low-Km醛脱氢酶2 |
| BIAM: | Biotin-conjugated碘乙酰胺 |
| Biotin-NM: | 生物素-N马来酰亚胺 |
| 复杂的我: | NADH-dependent泛醌氧化还原酶 |
| 复杂的三世: | 细胞色素c还原酶 |
| 复杂的四: | 细胞色素c氧化酶 |
| CYP2E1: | Ethanol-inducible细胞色素P450 2 e1同工酶 |
| 消化: | 差异凝胶电泳 |
| 呃: | 内质网 |
| 等: | 电子传递链 |
| 4-HNE: | 4-Hydroxynonenal |
| 伊诺: | 诱导一氧化氮合酶 |
| 我/ R: | 缺血再灌注 |
| MDA: | 丙二醛 |
| 之: | 3,4-methylenedioxymethamphetamine |
| NEM: | N-ethylmaleimide |
| 没有: | 一氧化氮 |
| PUFA: | 多不饱和脂肪酸 |
| RNS: | 活性氮物种 |
| ROS: | 活性氧 |
| 年代-NO-Cys: | 年代-nitrosylated半胱氨酸 |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| 硫解酶: | 3-Ketoacyl-CoA硫解酶。 |
确认
校内项目基金支持的这项研究是美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所。这部分研究也支持了慢性肝病的赠款项目(b . j .歌曲)中心的生物调节器在大韩民国。作者感谢克劳斯Gawrisch博士的支持。他们也感谢Drs。Timothy d . Veenstra布莱恩·l·胡德托马斯·p·康拉德,李蓉Yu和肖颖你们实验室的蛋白质组学分析技术,先进技术计划,SAIC-Frederick, Inc .,确定氧化改性线粒体蛋白质的蛋白质序列的研究。作者没有任何利益冲突。