绿茶多酚提取物对六价铬诱导的CD-1小鼠外周血DNA损伤的抗遗传毒性和凋亡活性:差示吖啶橙/溴化乙啶染色分析

抽象的

本研究旨在探讨绿茶多酚对六价铬[Cr (VI)]诱导的CD-1小鼠基因毒性损伤和凋亡活性的调节作用。将动物分为以下几组:(i)注射载体;(ii)经灌胃处理的绿茶多酚(30毫克/公斤);(iii)注射CrO_3.(20毫克/公斤)腹腔内;(iv)除CrO外，还用绿茶多酚处理_3.．通过检测治疗后0、24、48和72小时外周血的微核多色红细胞(MN-PCEs)来评估基因毒性损伤。采用差示吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色检测细胞凋亡诱导和细胞活力。绿茶多酚处理后MN-PCEs无明显变化。然而,阴极射线示波器_3.注射后24和48小时，MN-PCEs显著增加。CrO前的绿茶多酚处理_3.与CrO治疗组相比，注射MN-PCEs减少_3.只有。研究结果表明，绿茶多酚对Cr (VI)诱导的基因毒性损伤具有一定的保护作用。

1.介绍

绿茶 （茶树)是最古老的饮料之一，世界上超过三分之二的人口消费它。主要成分是咖啡因、单宁酸和精油。单宁包含多种多酚化合物，包括重要的类黄酮，如儿茶素:(−)表儿茶素(EC)，(−)表没食子儿茶素(EGC)及其没食子酸酯形式(+)没食子儿茶素(GC)，(−)表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(ECG)和(−)表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG) [1那2］．这些化合物在化学上可分为二苯吡喃、吡喃及其衍生物。核心结构包含二苯基丙烷骨架(图)1（a））.新鲜绿茶中发现的主要类黄酮是儿茶素(黄烷-3-醇或黄烷醇)和黄酮醇(图)1（b）和1（c）职责。)1］．此外，绿茶还含有其他多酚类物质，如茶黄素(如图)1（d）)，但浓度低于儿茶素。多酚也自然存在于水果和蔬菜中，以及红酒和啤酒等饮料中[1那2］．

最近绿茶吸引了重要的关注，在科学和消费者社区中，为其健康益处，对与癌症，心血管和神经变性疾病如癌症，心血管和神经变性疾病相关的各种疾病进行了健康益处[3.那4.］．绿茶的有益效果归因于多酚化合物的抗氧化性能。除了癌症化学预防性，绿茶多酚还显示出抗炎，抗血糖，抗菌和抗病毒性质[4.-6.]，以及抗诱变活性[7.］．

多酚化合物表现出作为自由基清除剂和金属螯合剂的直接作用和通过调节转录因子和酶的间接作用[8.那9.］．事实上，这些抗氧化剂可以抑制8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG, 7,8-二氢-8-氧脱氧鸟苷)的形成。在活的有机体内[10那11］．因此，具有抗氧化特性的物质已被认为是治疗与氧化应激和DNA损伤相关的慢性退行性疾病的预防和辅助剂。

相比之下，六价铬[Cr (VI)]化合物通过引起几种类型的DNA损伤和基因突变，在诱发遗传毒性方面特别有效。Cr (VI)化合物已被广泛研究，因为它们有各种工业应用，包括镀铬、冶金、颜料制造、皮革鞣制和木材保存，并因为它们与癌症的诱导有关[12］．Cr通常以不同的氧化态存在，主要是Cr (III)和Cr (VI)，但Cr (III)是一种必需的微量营养素，在蛋白质、糖和脂肪的代谢中起重要作用[13］．Cr（VI）通过引起几种类型的DNA病变和基因突变来诱导遗传毒性特别有效。Cr（VI） - 诱导的DNA-DNA Interstrand交联，氧化DNA损伤和肿瘤抑制基因中的突变p53是一些可能在决定细胞遗传毒性中起重要作用的主要因素[14那15］．根据以往的研究，cr诱导的基因组DNA损伤包括8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG, 7,8-二氢-8- oxdeoxyguanosine)，这是一种氧化DNA损伤形式[16］．Maeng等[17]观察到大鼠暴露于Cr (VI)时DNA中8-OH-dG水平的变化，提示Cr (VI)化合物引起的DNA损伤可能与氧化应激有关。Cr (VI)通过芬顿和Haber-Weiss反应在细胞内还原为Cr (III)，产生活性氧(ROS)和自由基(FRs) [15那18那19］．虽然DNA-ROS和铬诱导的DNA损伤之间的直接关系存在很大的争议和不清楚，但已有一些研究支持ROS在Cr (VI)诱导的基因毒性和细胞毒性中的作用[20.］．此外，已经观察到对小鼠的口服给予的Cr（vi）可以诱导对肝氧化应激和肝细胞凋亡的剂量和时间依赖性影响[21］．细胞凋亡是一种通过激活和/或合成细胞破坏所必需的基因产物以有序方式启动和完成细胞死亡的过程[22］．细胞凋亡在许多生理和病理过程中起着至关重要的作用，并伴有特征性的形态变化，包括细胞质收缩、质膜起泡、细胞核缩合或碎裂以及染色体DNA的广泛降解。事实上，许多化学预防剂通过诱导细胞凋亡来抑制癌变[23］．Roy等人[24]观察到EGCG不仅能保护正常细胞抵抗MNNG诱导的基因毒性改变，还能通过诱导细胞凋亡来消灭癌细胞在体外．我们之前观察到在活的有机体内绿茶(随意(10 d)降低了CrO处理对MN-PCEs的诱导_3.．这一结果支持了绿茶对Cr (VI)等金属化合物诱导的基因毒性损伤的保护作用_3.在第1天和第2天，添加绿茶(约42%)只部分阻止了它们的生长[25］．这一发现可能与茶叶的来源等因素有关，因为已经观察到茶树中多酚的含量受环境因素(如天气、光照、营养、制备过程、贮藏、园艺叶龄等)的影响。此外，有报道称茶多酚占茶叶干重的30%以上;其中90%是儿茶素，10%是黄酮醇[26-28］．因此，作为我们研究计划的一部分，我们评估饮食中的化学预防和化学保护成分，以获得对Cr (VI)诱导的基因毒性损伤更有效的调节。在活的有机体内，我们直接研究了含有多酚化合物混合物的绿茶多酚提取物(至少60%总儿茶素具有更高的抗氧化活性[多酚60])，并使用吖啶橙/溴化乙啶染色分析其在CD-1小鼠外周血中的凋亡活性。

2.材料和方法

2.1。化学品

从Sigma Chemicals Co.（圣路易斯，Mo，USA）获得以下测试化学品和试剂：CRO_3.[Cas号。1333-82-0]，吖啶橙（AO）[CAS NO。溴化乙锭（EB）[CAS NO。1239-45-8]和绿茶多酚萃取物（聚酚60）[CAS NO。138988-88-2]。

2.2。动物

实验用的是2到3个月大的CD-1雄性小鼠(28-35 g)。实验动物在控制温度(22℃)下饲养，光照时间为12-12 h(光照07:00-19:00 h)。老鼠可以自由获得食物(Purina-México小型啮齿动物的食物)和水。所有小鼠均来自哈兰大学“faculty de Química, Universidad Nacional Autónoma de México”(UNAM)，并适应了两周时间。萨拉戈萨大学“高等学校生物伦理学委员会”批准了这项研究中使用的实验方案。

2．3.实验设计

绿茶多酚提取物(Polyphenon 60)的用量是基于以往研究的结果，这些研究利用了其他市售的多酚60(体重0.625-1.25%)[29和我们的初步研究，以确定最大耐受剂量(MTD)，不诱发锰- pces。的阴极射线示波器_3.剂量选择根据以往的研究，腹腔(i.p.)给药20 mg/kg。这种阴极射线示波器_3.剂量诱导小鼠外周血的MN-PCE [30.］．

绿茶多酚提取物和CrO_3.用无菌蒸馏水将干化合物溶解在溶液中制备。化合物制备后，立即给予0.25 mL溶液。对照组采用相同的方法，只使用vehicle。评估标准和工作条件是根据经合组织(OECD)指南(474)、食品和药物管理局(FDA)指南、环境保护局(EPA)指南、及测试由日本环境学会微核试验合作研究小组(CSGMT)及哺乳动物突变研究小组(JEMS.MMS)指定的用于短期小鼠外周血微核试验的化学品的指引[31-35］．

确定处理剂量后，研究绿茶多酚提取物对CrO基因毒性损伤的影响_3.对处理过的小鼠进行了评价。采用MN-PCEs动力学分析进行评估[31］．小鼠随机分配给以下组之一（老鼠每组)。（1）用载体注射的动物（对照组）。（2）通过饲养用绿茶多酚提取物（30mg / kg）处理的动物。（3）动物注射CrO_3.(20毫克/公斤)。(4）用绿茶多酚提取物(30 mg/kg)灌胃，4 h后注射CrO_3.(20毫克/公斤)。

2．4．微核测定

载玻片覆盖AO，并按照Hayashi等人描述的技术制备[36］．简单地说，AO以1 mg/mL的浓度溶于蒸馏水，10μL的溶液放置在预热(约70°C)干净的玻片上。通过在载玻片上前后移动玻璃棒，AO均匀地分布在载玻片上，然后风干。在实验使用之前，将涂有ao涂层的玻片储存在黑暗、干燥的室温下。

对MN处理后的性能进行评价，5μL通过在四天的时间（0至72小时）期间每24小时刺穿小鼠的尾血管，收集L外周血样品。根据Hayashi等人将样品直接置于先前用AO处理的载玻片上。[36］．将样品放在载玻片上后，在载玻片(mm)立即放置在载玻片上，其边缘用橡胶水泥密封。所有玻片制剂均保存在4°C黑暗的塑料盒中。这些载玻片制剂不能永久保存，但如果盖子已密封，它们可以在冰箱中保存几天。每只小鼠准备2张载玻片，12 h后对载玻片进行分析。

使用蓝色激发过滤器和黄色屏障过滤器在荧光显微镜（尼康Optiphot-2）下鉴定PCE，NCE和MN-PCE。由于存在核糖体RNA的存在，来自NCE的差分AO染色表格来自NCE的荧光红橙色。AO染色也鉴定了MN-PCE，其由于其DNA含量而染色荧光绿色（图2（a））.MN-PCEs分析是基于每只小鼠2000个细胞的结果，而MN-PCEs的存在被用作基因毒性损伤的标记[36］．

2．5．细胞凋亡和细胞活力分析

为了评估细胞凋亡和细胞活力，我们使用含有差分吖啶橙/乙锭（AO / EB）染色。血样（100 μL)在治疗前和治疗48 h后穿刺小鼠尾血管采集。肝素(10μl）加入血液样品和20 μL的AO/EB混合染料(100μl / ml ao和100 μL/mL EB，均在PBS中制备)，然后加入。离心浓缩(5000 rpm)， 10分钟后重悬细胞颗粒μL和镀在干净的幻灯片上;盖玻片（mm)立即放置在载玻片上。每只小鼠准备两张玻片，并立即进行分析。

在尼康OPTIPHOT-2荧光显微镜下，蓝色激发(480 nm)和屏障滤光片(515-530 nm)，通过识别凋亡、活细胞和不活细胞来评估细胞凋亡。差异AO/EB染色能够根据膜的完整性区分活细胞和非活细胞。当细胞存活时，AO插入到DNA中，使细胞呈现绿色。相反，当细胞无法存活时，EB也插入到DNA中，使细胞呈现橙色。因此，当EB压倒AO染色时，一个无法存活的细胞将包含一个亮橙色的细胞核。活细胞中的健康细胞核和凋亡细胞核都发出亮绿色荧光。相反，非活细胞中的健康细胞核或凋亡细胞核发出亮橙色荧光[33］．凋亡和细胞活力评估以每只小鼠200个细胞为基础。

2．6．统计分析

MN-PCEs诱导结果及活细胞(凋亡和非凋亡)和活细胞(凋亡和非凋亡)数据用均数±标准差(sd)表示，各处理组结果比较采用方差分析(ANOVA)，然后采用Tukey检验。MN-PCEs的净诱导频率(NIF)采用卡方检验进行分析[30.那37］．采用SPSS/PC V18TM和Statistica/PC V 6.0TM软件进行统计学分析。在所有的分析中，被认为是重要的。

3.结果

在本研究中获得的结果显示在表中1．对照品和绿茶多酚提取物并没有改变实验组小鼠中锰-多酚诱导的平均数量。阴极射线示波器_3.治疗增加了所有样品中的平均Mn-PCE的数量，但与0h样品和对照组相比，仅在48小时的时间点观察到统计显着性。此外，CRO._3.与对照组相比，实验组小鼠锰- pce的平均数量增加了(约13个锰- pce)。当处理同时包括绿茶多酚提取物和CrO时_3.，我们观察到MN-PCEs在处理后24、48和72小时的平均数量比MN-PCEs在CrO中的诱导数量减少_3.但在48时观察到的MN-PCEs诱导与对照组相比仍有统计学意义(表1)1）.为了比较不同处理组MN-PCE诱导的动力学，通过计算NIF值对数据进行分析，计算方法如下[30.]： 在哪里在24、48或72小时评估。时间0 h(治疗前)评估。

当计算NIF时，可以更容易地观察到净MN-PCE诱导。该计算从处理后处理之前减去Mn-PCE的频率，从而消除了在时间0的治疗组之间发生的基线MN-PCE变异性（参见S.D.表1）.数字3.为处理后24、48、72 h各处理的NIF值。绿茶多酚类黄酮提取物处理组的MN-PCEs在处理后24和72 h主要降低(分别约为121%和100%)。

直接检测治疗前(0 h)和治疗后(48 h)小鼠外周血中细胞凋亡和细胞活力。通过AO/EB染色检测治疗小鼠外周血中细胞凋亡的诱导和细胞活力。该技术显示了荧光dna结合染料AO和EB的差异摄取，以确定活细胞和非活细胞。这些染料用于识别已经发生凋亡的细胞，并根据细胞膜完整性区分凋亡早期和晚期的细胞(图)2 (b)）.AO嵌入DNA，使其成为绿色的外观。该染料也与RNA结合，但由于它不能插入，RNA污渍红橙色。因此，活细胞将具有鲜绿色的外观。EB仅由非可变细胞占用。该染料还嵌入DNA中，使其出现橙色;然而，EB只与RNA弱结合，这可能看起来略微红色。因此，不可行的细胞将具有亮橙色核，作为EB压倒性AO染色，其细胞质将出现深红色（如果有任何内容仍然存在）。活细胞中正常和凋亡核均为荧光亮绿色（图2 (b)》)。相反，正常或凋亡细胞核在非活细胞中会发出明亮的橙色荧光(图)2 (b)因此，使用该系统可以区分早期和晚期凋亡细胞。具有完整细胞膜的活细胞细胞核呈均匀染色的绿色(图)2 (b)早期凋亡细胞的细胞膜完整，但DNA已经开始片段，细胞核仍然是绿色的，因为EB不能进入细胞，但染色质凝聚可以在细胞核中看到明亮的绿色斑块(图)2 (b)， II).当细胞进入凋亡通路并开始出现膜泡时，EB可进入细胞，使细胞被染成绿橙色(图)2晚期凋亡细胞细胞核内染色质凝聚成亮橙色斑块，与坏死细胞区分开来，细胞核呈均匀的橙色染色(图3)2(四)。

所有治疗增加了凋亡可变细胞的平均数，但仅在CRO中实现了统计学意义_3.治疗组和联合绿茶多酚提取物 - CRO_3.与对照组相比。复合绿茶多酚提取物- cro的凋亡增加更大_3.小组比在CRO中_3.组(分别为12.8和10.2个细胞)。与对照组相比，仅绿茶多酚提取物处理组的凋亡活细胞约增加了4个。在所有治疗组中，凋亡的非活细胞和非凋亡细胞的平均数量没有变化2）.

4.讨论

多酚中存在的抗氧化特性使得它们可能用于抵消通过氧化应激剂如Cr（VI）化合物诱导的DNA损伤。在这项研究中，我们评估了绿茶中多酚提取物的能力，以抑制Cr（VI）诱导的遗传毒性损伤在活的有机体内CD-1小鼠外周血的细胞凋亡分析。

Cr (VI)的遗传毒性是通过观察MN-PCEs在处理后24和48小时显著增加的CrO_3.治疗组(表1）.与阴性对照相比，在所有样本中都明显观察到这种增加，这一发现证实了之前报道的Cr (VI)特别是CrO的遗传毒性_3.[15那30.那38］．Cr（VI）化合物的遗传毒性机制与Cr（VI）的细胞内还原为Cr（III）。Cr（VI）化合物可以通过非特异性阴离子转运蛋白穿过细胞膜，并且通过它们与细胞内细胞质分子的相互作用而降低。在此过程中，产生FRS，其能够诱导基因毒性改变[15那18那19］．因此，我们建议这些效应可能导致MN-PCE的形成。

然而，绿茶多酚提取物处理组MN-PCEs的平均数量在处理后24 h增加了不到1个MN-PCEs(表1)1)，计算出的NIF值证实了这些提取物的非遗传毒性作用(图3.）.据报道，从绿茶中提取的多酚或类黄酮不会引起遗传毒性;此外，在实验动物中长时间高剂量地使用这些化合物对基因毒性没有影响[4.那39那40］．

这在活的有机体内在CRO之前施用绿茶多酚提取物_3.与用CRO处理的基团的MN-PCES形成相比，注射剂分别在24,48和72小时下，在24,48和72小时下，在24,48和72小时下，注射率下降121％，69％和100％_3.单(图3.）.结果表明，绿茶多酚提取物对Cr (VI)诱导的遗传损伤的保护作用比绿茶更有效随意[25］．由于绿茶多酚提取物的酚结构(图1)，这些黄酮类化合物可能作为氢供体抑制脂质自由基和FRs的形成，包括Fenton反应产生的超氧自由基和羟基自由基。这些类黄酮还可以通过其邻羟基酚基螯合金属[41那42］．因此，提高细胞内和细胞外抗氧化水平并阻断Cr (VI)介导的ROS和FRs生成的治疗药物可能会预防或减弱Cr (VI)诱导的遗传毒性。

在我们的实验中，在处理48 h后，凋亡活细胞的平均数量增加(表2）.与阴性对照组相比，所有治疗组均观察到这种增加，这一发现支持先前报道的Cr (VI)治疗后的观察结果[43-45］．细胞内氧化状态的改变有可能触发或致敏细胞发生凋亡;因此，Cr (VI)还原过程中产生的ROS在凋亡信号通路中起重要作用[45那46］．单独使用绿茶多酚提取物导致凋亡活细胞的平均数量增加(约4个)，但这一增加没有统计学意义。其他研究表明绿茶多酚如EGCG和ECG可以抑制人类肺癌的生长(细胞系PC-9) [47］．该研究进一步证明生长抑制在G2 / M阶段的细胞循环骤停用[48，这可能与这些多酚的凋亡活性有关。儿茶素在人淋巴白血病细胞、人表皮样癌细胞、人癌角化细胞和人前列腺癌细胞中也证实了凋亡的诱导作用[3.那49那50];因此，细胞凋亡是一种重要的保护机制，通过消除基因损伤细胞来对抗癌变。

当在注射CRO之前施用绿茶多酚提取物时_3.，凋亡活细胞的平均数量增加到高于CrO后观察到的水平_3.但这些相互作用表明，其效果不是相加的或拮抗的(见下表)2）.Gao等人[51]观察到抗坏血酸可以增强EGCG和Theaflavin-3-30- ingallate诱导人肺腺癌SPC-A-1细胞和食道癌ECA-109细胞的细胞凋亡。其他研究表明，通过用化学预防剂（包括舒林克，顺铂和Tamoxifen）的组合治疗，可以协同增强人肺腺癌（PC-9细胞）中EGCG的凋亡诱导活性。3.那52那53］．组合治疗后细胞凋亡的增强诱导表明该方法可能有助于消除Cr（VI）诱导的受损DNA的细胞。

综上所述，目前的研究表明，CrO的管理_3.小鼠腹腔注射能诱导外周血DNA损伤和细胞凋亡，且这种作用具有时间依赖性。ROS和FRs的形成可能在Cr (VI)介导的DNA损伤和凋亡中起重要作用在活的有机体内．此外，绿茶多酚提取物对Cr (VI)诱导的基因毒性损伤有一定的抑制作用，且在注射CrO后24 h达到最大的保护作用_3.>69%， >100%注射后72h。基于这些结果,绿茶多酚提取物能有效防止基因毒性损伤小鼠处理铬(VI)。绿茶多酚提取物的有益效应可能会抑制ROS和FRs链式反应生成的氧化应激引起的铬(VI)和提取凋亡的活动。

有有限的证据表明，经常饮用绿茶可以减少基因毒性损害。因此，本研究有贡献在活的有机体内有证据表明，绿茶多酚提取物可以防止与氧化应激相关的致癌物质(如Cr (VI)化合物)引起的基因毒性损伤。

缩写

AO:	吖啶橙
铬(VI):	六价铬
海尔哥哥:	溴化乙锭
欧共体：	表儿茶素
心电图:	Epicatechin-3-gallate
EGC：	儿茶素
EGCG：	(−)-epigallocatechin-3-gallate
食品药品监督管理局:	美国食品和药物管理局
FRs:	自由基
GC:	(+)儿茶素
i.p。	腹腔内
MNNG：	N-methyl-N”-nitro-N-nitrosoguanidine
MN-PCEs:	微核多色红细胞
道理:	Normochromatic红细胞
nif：	净归纳频率
电脑:	多色的红细胞
ROS:	活性氧物种。

利益冲突

本文作者声明，他们与本文中提到的可能导致利益冲突的商业身份没有直接的经济关系。

致谢

作者要感谢Alejandro Gordillo Martínez，感谢他在本文准备过程中给予的巨大帮助，感谢Lourdes Hernández Sánchez，感谢她出色的技术支持。dgpa - unam IN217712提供了财政支持。

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