文摘

基本切除修复(BER)通路,包含OGG1, MTH1和MUTYH,是一个主要的氧化DNA损伤的保护人类,而8-oxoguanine (8-OHdG),索引的DNA氧化,增加维护血液透析(HD)患者。四方方面面基因的多态性,OGG1 c。977 c > G (rs1052133),MTH1c。247G > A (rs4866),MUTYHc。972G > C (rs3219489), andAluYb8MUTYH(rs10527342),在337年调查了HD患者和404名健康对照组。和8-OHdG水平在116 HD患者白细胞DNA检测。的分布MUTYHc。972GG或AluYb8MUTYH两组之间的不同,并与适度的风险增加相关终末期肾病(ESRD) (和0.034,分别地)。平均8-OHdG / 10⁶dG值明显高于患者OGG1c.977G,MUTYHc。972G orAluYb8MUTYH等位基因(通过方差分析)。进一步的分析表明,组合MUTYHc。972GGwithOGG1c。977GG或AluYb8MUTYHESRD的风险和增加白细胞DNA 8-OHdG HD患者的水平。我们的研究表明,MUTYHc.972GG,AluYb8MUTYH,并结合OGG1c。977GGincreased the risk for ESRD development in China and suggested that DNA oxidative damage might be involved in such process.

1。介绍

氧化应激的特点是过量的活性氧(ROS)通过反应导致细胞损伤和蛋白质,核酸,脂质(1,2]。DNA碱基,尤其是鸟嘌呤(G),尤其容易受到氧化,ROS经常导致大量的氧化鸟嘌呤产品(3]。8-hydroxy-2′脱氧鸟苷(也称为8-oxoguanine;8-OHdG)是最常见的一种诱变产品和对腺嘌呤在DNA双链DNA复制(3,4]。如果错配修复,这将导致一个G: C T:颠换的突变细胞(5]。

一些修复途径参与DNA的侮辱,由于内源性或外源性来源来源,包括直接通路,逆转的错配修复(MMR)通路,核苷酸切除修复(尼珥)通路,和基本切除修复(BER)途径6]。基本切除修复(BER)是主要的DNA修复途径纠正基础病变,由于氧化、烷基化、脱氨基作用,和depurinatiation / depyrimidination损伤,如8-OHdG [7]。实际上,误码率通路专门阻止那些G: C-to-T:突变8-OHdG的修复。它包含了MTH1,OGG1,和MUTYH基因预防、识别和移除misincorporated氧化核苷酸,8-OHdG,腺嘌呤与8-OHdG配对,分别时发起的BER通路。

越来越多的证据表明,DNA修复基因的遗传多态性可能调节DNA修复能力,导致DNA损伤积累,然后导致一些复杂疾病(8,9]。笠原等人报道MUTYHGln324His (c。972G > C) is associated with increased risk of colorectal cancers [10]。玛珊德等人所描述的效果OGG1Ser326Cys (c。977C > G) on the risk of lung cancer [11]。我们还表明,AluYb8插入的MUTYH(AluYb8MUTYH)可能是一个与年龄有关的疾病的风险因素,2型糖尿病(12,13]。

肾脏是非常容易受到任何结果由活性氧引起的,和白细胞8-OHdG内容是代理oxidation-induced DNA损伤的生物标志物终末期肾病(ESRD)患者,特别是在维护血液透析(HD)。氧化损伤被认为改变肾小球和建议的结构和功能与肾疾病风险和最终ESRD以及动脉粥样硬化,dialysis-related淀粉样变和事件透析患者的贫血14,15]。ESRD DNA修复的主要作用可能是复杂的。福岛等。16证明的多态性hOGG1(Ser326Cys)与IgA肾病的进展。最近,Trabulus et al。17)表明,XRCC1 Arg399GlnESRD多态性可能带来的风险增加的发展在土耳其,这是第一个报告显示一个ESRD DNA修复基因多态性和发展之间的联系。然而,基因变异参与抗氧化防御仍需澄清在这个疾病,尤其是在中国。

根据协会的误码率多态性,氧化DNA损害,(ESRD),我们假设数量基因的遗传变异可能会导致修复损伤或残疾,氧化DNA损伤积累,ESRD的发病机理。考虑到潜在的角色OGG1c。977C > G,MTH1c。247G > A,MUTYHc。972G > C, andAluYb8MUTYH在氧化DNA修复途径;我们对这四个系统通路中的多态性之间的关系和ESRD中国队列。我们也评估了HD患者的白细胞DNA 8-OHdG水平揭示氧化损伤之间的相关性和终末期肾病。

2。材料和方法

2.1。主题

的等位基因频率OGG1(NG_012106.1) c。977 c > G,MTH1(NC_000007.13) c。247 g > A,MUTYH(NG_008189.1) c。972 g > CAluYb8MUTYH(AluYb8插入的基因内区15MUTYH(12)于337年调查了HD患者,无论原因,在南京,江苏,中国,2009年10月至2010年2月。所有在血液透析患者一直维护协议> 3个月,综述了年龄、性别、临床和实验室数据和表示。高血压被定义为收缩压(SBP)≥140毫米汞柱和/或舒张压(菲律宾)≥90毫米汞柱和/或使用抗高血压药物(18];贫血被定义为一个血红蛋白< 11 g / dL或使用重组人红细胞生成素(19]。

健康个体与正常肾功能是从志愿者招募接受健康检查在同一地区。详细的采访和各种实验室的分析是由每个个体,包括白蛋白排泄率(AER)和血清肌酐。受试者排除如果白蛋白排泄率(AER)≥30毫克/ 24 h,血清肌酐≥1.2 mg / dL和超声波的肾脏和输尿管异常的大小和外观。他们排除如果他们患有某些疾病,如急性炎症和糖尿病,高血压,根据过去历史和自身免疫性疾病或癌症的临床或实验室特征。共有404名性别与年龄匹配的受试者选择包含在控制队列。南京大学医学院的机构伦理委员会批准了这项研究,并从所有参与者得到了书面知情同意。

2.2。高分辨率分析融化

在这项研究中,OGG1c。977C > G,MTH1c。247G > A, andMUTYHc。972G > C were genotyped using the dsDNA dye LCGreen in combination with HRM analysis. DNA was extracted from peripheral blood samples, and PCR was performed to amplify the target sequences. The PCR primers were designed by LightScanner primer design software (Idaho Technology) (Table1)。每个PCR反应最初表现在最后一个反应体积的10μ使用25 ng的基因组DNA, 0.2 L,每个引物的pmol, 0.8μL 2.5毫米核苷酸,1μL 25毫米MgCl₂,1μL×10 (NH Taq缓冲区₄)₂SO4、0.4 U Taq DNA聚合酶(Fermentas)和0.4μL二甲亚砜(DMSO)。反应混合物在95°C孵化五分钟,然后接受40 95°C的周期为30秒,55-58°C(表130秒,30秒72°C,紧随其后的是72°C 7分钟使用一个ptc - 200热循环(Bio-Rad)。

9μL反应是补充了1μL 1×LCGreen +(爱达荷州技术),和96孔板(Bio-Rad)转移到光扫描仪(爱达荷州技术)。荧光数据收集在一个温度范围为70°C - 97°C,样本被融化了。融化曲线分析根据制造商的软件。人力资源管理可以直接歧视异质结合体(CG)和(CC或GG)基因型的OGG1c。977C > G through melt scanning (Figure1(一))。后混合纯合子的DNA与等量的已知PCR产品(例如,CC),进一步区分了CC和GG基因型(图1 (b))。为进一步确认,每组有10%的样本被人力资源管理被随机选择并进行DNA测序(图1 (c))。类似地,MTH1c。247G > A andMUTYHc。972G > C polymorphisms were genotyped by HRM.

2.3。琼脂糖凝胶的检验AluYb8MUTYH多态性

PCR引物被列在表中1和PCR条件进行了初步变性在94°C 5分钟,35周期为30秒94°C的变性,退火30秒60°C,扩展在72°C 50秒,然后最后一个在72°C扩展了10分钟。PCR产品运行在1%琼脂糖凝胶(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。的AluYb8MUTYH基因型被归类为纯合子缺失的变异(只有500 bp的产品,没有/没有,一个/一个),纯合子的这种变化(只有826个基点的产品,存在/存在,P/P)和杂合子(500个基点和826个基点产品,缺乏/存在,一个/P),根据不同片段缺失或出现(图1 (d))。

2.4。8-OHdG水平测量血液细胞的基因组DNA

测量8-OHdG水平,116名患者被随机rerecruited HD组和调查方法报道之前(12]。短暂,从空腹静脉全血中提取的DNA与EDTA(10毫升,加入防止凝固)进行1 h内收集,采用盐析法(20.]。DNA样本的纯度检查,OD260 / OD280 nm, OD260 nm / OD230 nm使用埃普多夫光度适应计+(埃普多夫,北美)。可接受的DNA保存冻结在−80°C,直到所有的样品可以同时化验。

DNA (200μ每个样本的g)于135年解散μL的水。醋酸钠(15μL, 200毫米)和核酸酶P1 (15μ美国L, 6台,σ)被添加到DNA溶液和孵化在37°C为30分钟。Tris-HCl缓冲区(15μL, 1 M, pH值7.4)和碱性磷酸酶(7μL 2单位,豆类、志贺、日本)被添加和孵化37°C 30分钟。水解是微孔过滤Microcon列在14000 rpm 10分钟,和50μL消化的DNA是应用于一个良好的酶联免疫试剂盒(高度敏感的8-OHdG检查,JaICA Fukuroi,静冈市,日本)。结果以毫微克每毫升,然后1 4.8 ng / mL转换为8-OHdG / 10⁶dG基于哈利维尔(21]。

2.5。统计分析

所有统计分析使用统计软件SPSS进行15.0版。描述性统计值包括平均数±标准差值连续数据和分类数据的百分比。卡方测试是用来比较基因型和等位基因频率的患者和健康对照组。优势比(或)显示有95%置信区间(CIs)。单独的比较对象之间的变量与不同基因型进行了方差分析,其次是事后分析。因为白细胞DNA 8-OHdG水平积极倾斜,自然对数变换用于规范化的分布分析。在所有情况下,小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

337 HD患者中,212(62.9%)是男性,125(37.1%)是女性。平均年龄为年(从22岁到85岁),和持续时间的血液透析年。原发性肾小球肾炎(GN)是最常见的肾脏疾病在HD组:207(61.4%)开发ESRD的GN, 51例(15.1%)因高血压肾病(HN), 36(10.7%)由于糖尿病肾病(DN), 16(4.7%)由于先天性或遗传性原因,6(1.8%)由于系统性红斑狼疮(SLE)和21例(6.2%)因其他原因。另外,267名(79.2%)患者有贫血,高血压和250年(74.2%)。404年的年龄和性别匹配的健康个体,平均年龄的年,254(62.9%)是男性。

3.1。的基因多态性在HD患者的误码率

的频率OGG1c。977C > G,MTH1c。247G > A,MUTYHc。972G > C, andAluYb8MUTYH基因型与HD见表2。健康对照组这些多态性分布符合哈迪温伯格平衡(对于所有)。

与健康对照组相比,基因型的分布OGG1c。977C > G (namely, CC, CG, and GG) and the allele frequencies were not significantly different in the patients (,χ²测试)。c。247G > A inMTH1,杂合的的频率MTH1c。247G > A was only 6.2% and 7.7% in the patients and controls (结合体),而没有发现。因此,MTH1多态性(c。247G > A) was not included in further analysis.

有趣的是,这两个多态性MUTYH基因显示ESRD个体风险的影响(表2)。为MUTYHc。972G > C, the distribution of the three genotypes, namely CC, CG, and GG, and the allele frequencies were significantly different in HD patients (和0.026)与健康对照组相比。此外,的频率MUTYHc。972GGgenotype was statistically higher in the HD cases (40.9%) than in the controls (32.2%), and the OR of GG adjusted by age and gender was 1.46 (95% CI: 1.08–1.98;)。为AluYb8MUTYH,三个基因型和等位基因的分布在HD患者几乎是相同的,在控制。相比一个/一个基因型,AluYb8MUTYH插入载体(一个/P或P/P)明显高于HD患者,或为1.40 (95% CI, 1.03 - -1.90;)。

对的影响MUTYHc。972GGgenotype and theAluYb8MUTYH P等位基因(ESRD)上进行综合风险分析,见表3。个人携带MUTYHc。972GGgenotype might have a higher risk for ESRD, and the OR ofMUTYHc。972GGadjusted by age and gender was 2.23 (95% CI: 1.37–3.64;)的人之一OGG1c。977GGgenotype. Meanwhile, the presence ofMUTYHc。972GGalso added to the risk ofAluYb8MUTYH A / P或P / PESRD发展基因型(OR, 1.46;95%置信区间,1.07 - -1.99;)。

3.2。BER多态性在患者不同的临床特点

HD患者分层分为六子组的主要诊断的基础上(即。GN, HN, DN,先天性或遗传性原因,系统性红斑狼疮,或其他原因)。(ESRD)类似的影响误码率多态性高清风险被证实的207例原发性肾小球肾炎的诊断相比,整个队列(表4)。的频率MUTYHc。972G > C GG genotype was significantly higher in cases than in controls, and the OR was 1.75 (95% CI: 1.24–2.47;)。的频率MUTYH AluYb8MUTYH A / P或P / P基因型明显高于比控制的情况下,或者是1.73(95%置信区间:1.20—-2.52;)。

此外,协会的误码率多态性与HD并发症的风险状况进一步分析(表4)。267名患者贫血的频率MUTYHc。972G > C GG was markedly higher in patients than controls (42.7% versus 32.2%; OR (95% CI) = 1.57 (1.14–2.16);),而AluYb8MUTYH插入(一个/P或P/P)显著增加患者贫血的风险(分别为73.4%和62.6%;或(95% CI) = 1.78 (1.22 - -2.60);)。250名高血压患者中查出了一个类似的关系。的频率MUTYHc。972GGcarriers was higher in cases than controls (41.2% versus 32.2%; OR (95% CI) = 1.48 (1.07–2.05);)。的频率AluYb8MUTYH插入载体(一个/P或P/P)的情况下高于控件(分别为70.4%和62.6%;或(95% CI) = 1.42 (1.01 - -1.99);)。

3.3。预测的影响误码率8-OHdG多态性

8-OHdG水平在116 HD患者白细胞DNA进行评估分为不同的子组根据多态性基因型和比较(图2(a))。三个多态性的基因型频率之间的类似116例检测白细胞DNA 8-OHdG水平和本研究中所有的337名患者进行调查。健康对照组的平行调查在我们的实验室,HD患者表现出增加8-OHdG水平比健康的人(12]。

为OGG1c。977C > G polymorphism, the genotypic frequencies (CC/CG/GG ratios of 15.5%/43.1%/41.4%) for the 116 patients whose leukocyte DNA 8-OHdG levels had been analyzed did not vary significantly from the whole study population of 337 patients (16.6%/47.5%/35.9%). The leukocyte 8-OHdG levels for patients carrying GG (/ 10⁶dG)或CG (/ 10⁶dG)明显高于患者携带CC (/ 10⁶dG) (通过方差分析)。为MUTYHc。972G > C polymorphism, the genotypic frequencies (CC/CG/GG ratios of 13.8%/49.1%/37.1%) for the 116 patients did not vary significantly from the whole study population. The leukocyte 8-OHdG levels for patients carrying GG (/ 10⁶dG)或CG (/ 10⁶dG)明显高于患者携带CC (/ 10⁶dG) (通过方差分析)。为AluYb8MUTYH多态性,116名患者,37岁,52岁,27了一个/一个,一个/P和P/P基因型没有不同于整个人口。患者携带P/P(/ 10⁶dG)或一个/P(/ 10⁶dG) 8-OHdG水平要明显高于病人携带一个/一个(/ 10⁶dG) (通过方差分析)。

的综合影响8-OHdG水平进一步调查这些多态性(数字2(b)和2(c))。基于高清的风险,43例携带MUTYHc。972GGgenotype were analyzed; 6, 21, and 16 showed the CC, CG, and GG genotypes ofOGG1c。977C > G, respectively (Figure2(b))。的OGG1c。977C > G GG or CG genotypes significantly increased the 8-OHdG level when compared with patients with theOGG1c。977C > G CC genotype among patients with theMUTYHc。972GGgenotype (/ 10⁶dG,/ 10⁶dG和/ 10⁶dG;通过方差分析)。这表明MUTYH和OGG1可能在预防DNA氧化损伤的协同作用。类似地,79名患者携带AluYb8MUTYH插入(一个/P或P/P),6、41和32显示MUTYHc。972G > C CC, CG, and GG genotypes, respectively (Figure2(c))。个人携带的8-OHdG水平GG或CG基因型高于个人携带CC基因型患者AluYb8MUTYH插入(/ 10⁶dG,/ 10⁶dG和/ 10⁶dG;通过方差分析)。

4所示。讨论

终末期肾病(ESRD)是一个麻烦的全球卫生问题,和ESRD患者的死亡率是10到20倍同样年龄个体从一般人群22]。维护血液透析(HD) (ESRD)是一种有效的方法来治疗和它的使用增加是由于ESRD的流行。新的流行病学研究显示,中国也期待ESRD的增加负担和HD在不久的将来,尽管它曾被严重低估了。据报道,慢性肾脏疾病患者的数量是1.195亿年在中国(23,高清的年发病率估计高达每百万人口(pmp) [36.124]。

在这项研究中,我们研究了基本切除修复(BER)基因的多态性在中国人口和病例对照表明个人和误码率变化相结合,主要MUTYHESRD多态性,可能增加的风险。潜在的机械联动装置可能会增加8-OHdG水平白细胞DNA,这被证实是由基因决定的。DNA氧化损伤是不可避免的和不断生成的氧化正常细胞新陈代谢的副产品。基因组的误码率通路是一个关键过程维护,也突出了这严重的表型出现在细胞和动物缺乏误码率函数。MUTYH和OGG1双基因敲除细胞更敏感的氧化剂,双基因敲除导致减少S期和G2 / M期的增加比野生型细胞,表明多个角色MUTYH和OGG1在维持基因组稳定25]。

DNA修复的有效性受调制的基因多态性。血液透析的人口,OGG1c。977C > G,MUTYHc。972G > C, andAluYb8MUTYH显示外周白细胞8-OHdG水平显著影响,可以单独使用,也可以组合。我们之前的研究表明白细胞8-OHdG水平变量在中国人群中,不管AluYb8MUTYH变化(12,13]。在这项研究中,我们证实ESRD患者之间的关系。病人带着OGG1c。977GG或CGgenotypes had significantly higher 8-OHdG levels than those with theOGG1c。977CC genotype. Similarly, Kohno et al. previously reported that 326Ser-containing (c.977CC) OGG1 has a seven-fold higher activity for repairing 8-oxoguanine than 326Cys-containing (c.977GG) OGG1 [26]。在一个背景的MUTYHc。972GGgenotype,OGG1c。977C > G still showed a significant increase in 8-OHdG levels in peripheral leukocytes. The same results were detected for theMUTYHc。972 c > G结合AluYb8MUTYH P等位基因。然而,病人携带MUTYHc。972GGhad significantly higher 8-OHdG levels than the patients carryingMUTYHc.972CC。相比之下,阿里等人报道,糖基化酶和dna结合活性部分受损MUTYHc。972CC genotype [27),而Shinmura和横田显示相同的活动水平尽管变化MUTYHc。972G > C polymorphism [28]。因此,方方面面通路中的基因变异可能足以维持8-OHdG水平在核DNA,虽然底层机制并不广泛学习或理解。

有趣的是,基因型的频率MUTYHc。972GG或AluYb8MUTYH航空公司(一个/P或P/P在HD患者明显高于对照组。联合分析表明,高清的风险进一步增加个人携带的MUTYHc。972GG和OGG1c。977GGgenotypes as well as those with both theAluYb8MUTYH(一个/P或P/P),MUTYHc。972GGgenotypes. The findings from Trabulus et al. [17)证实了DNA修复基因多态性之间的关系和ESRD土耳其人口的发展。和DNA修复的综合效应变量添加到这样的协会,同样说明了在目前的研究。

它已经指出,这种疾病的迹象在中国从西方国家是不同的。王左和显示,肾小球肾炎仍是主要原因,占近50%的病例(24]。在这项研究中,61.4%的高清病例是由于原发性肾小球肾炎(GN)。此外,MUTYH GG基因型也从GN ESRD的风险明显增加(或= 1.75)。这种联系仍然在人AluYb8MUTYH P等位基因,从GN ESRD的风险增加1.73倍。因此,MUTYHc。972GG或AluYb8MUTYH可能是小说ESRD的遗传风险因素,以及这些基因变异筛查或综合分析可能有预测价值在评估潜在风险在中国。

基于相关性的误码率多态性和8-OHdG水平,患者遗传多态性被发现在不同的误码率增加累积氧化DNA损伤的风险。因此,我们提出了遗传因素之间的关系和ESRD 8-OHdG水平增加主导这一过程的影响。8-OHdG的积累越来越多的证据表明,在DNA可以增加DNA突变与癌症发展的风险(29日,30.]。我们还表明,增加DNA氧化可能导致衰老相关疾病(12]。8-OHdG HD患者白细胞DNA的水平明显高于健康对照组,已证实了其他组(31日,32]。然而,到目前为止,还没有直接证据证明氧化DNA损害之间的因果关系和GN的发展和迹象。我们的研究使用遗传分析支持这种关系,但还需要进一步的研究来阐明氧化DNA损伤的病理意义对ESRD的人发展。

ESRD贫血和高血压是最常见的并发症和死亡率的增加有关33,34]。增加DNA损伤负责抑郁生产促红细胞生成素(EPO),高血压的形成,和心血管疾病(CVD) (35,36]。观察性研究揭示了一个强大的协会之间的严重性贫血和心血管疾病发病率和死亡率的风险和HD患者的其他原因19,37];高血压也可能是这些事件的主要因素(38]。在这项研究中,我们说明了基因突变误码率紧密与HD患者贫血和高血压的并发症。作为心血管事件在HD患者死亡的主要原因,这些数据表明,DNA氧化损伤可能参与并发症的风险和长期的结果。

然而,并非所有的本研究中关于误码率多态性的关系可以解释。它是证明了误码率多态性相关残疾修复氧化DNA,然后积累8-OHdG白细胞的DNA的水平。因此,高水平的8-OHdG对ESRD的发展作出贡献。基因变异之间的连接,氧化DNA损伤和疾病情况也不一致。取OGG1c。977C > G for instance, theGG和/或CG变化显著增加8-OHdG水平,预测高氧化DNA损伤的风险。但是,OGG1c。977C > G polymorphism did not appear to be related to ESRD among the investigated Chinese population. Tarng et al. also showed similar results among patients undergoing HD, but did not provide a detailed interpretation [31日]。

总之,我们的研究表明,光通信系统中的多态性,包括MUTYHc。972GG和AluYb8MUTYH,增加ESRD的风险在中国发展,尤其是他们的综合效应OGG1c.977GG。它表明氧化DNA损伤可能是一个常见的危险因素相关的肾脏疾病,和基因的误码率途径可能参与肾功能恶化的进展和并发症。那些纯合或杂合的误码率ESRD多态性可能的候选基因因素的发展。筛选这些多态性将有利于预防慢性肾脏疾病的进展和改善血液透析患者的长期结果。

确认

作者非常感谢大喜霁大悲教授和徐本博士在招聘合作调查的患者。这项工作得到了江苏科学技术基金会(批准号BK2009236),中国国家自然科学基金(批准号81070579和81070579)和开放的基础医药生物技术国家重点实验室(批准号kf - gn - 201201)。