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氧化医学与细胞寿命
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氧化医学与细胞寿命/2012/文章
特刊

膳食多酚及其对细胞生物化学和病理生理的影响

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研究文章|开放访问

体积 2012 |文章的ID 839298 | https://doi.org/10.1155/2012/839298

Laura Zambonin, Cristiana Caliceti, Francesco Vieceli Dalla Sega, Diana Fiorentini, Silvana Hrelia, Laura Landi, Cecilia Prata， ＂膳食酚酸在膜模型和培养细胞中发挥有效的抗氧化剂作用，在白血病细胞中显示促凋亡作用"，氧化医学与细胞寿命， 卷。2012， 文章的ID839298， 12. 页面， 2012． https://doi.org/10.1155/2012/839298

膳食酚酸在膜模型和培养细胞中发挥有效的抗氧化剂作用，在白血病细胞中显示促凋亡作用

劳拉Zambonin，1 Cristiana Caliceti.，2 Francesco Vieceli Dalla Sega，1 Diana Fiorentini，1 西尔瓦娜Hrelia，1 劳拉兰迪，1 和 Cecilia Prata.1

1生物化学系“G.Moruzzi”，母校Studiorum，博洛尼亚大学，通过Irnerio 48，40126意大利博洛尼亚

2法拉拉大学和心血管研究中心，Salvatore Maugeri Foundation，IRCCS，Via G. Mazzini 129,25065灯笼，意大利

学术编辑器:克里斯蒂娜·安杰洛尼
收到了 2012年3月09
接受 2012年5月03
发表 2012年6月26日

抽象的

咖啡酸、丁香酸和原儿茶酸都是酚酸，它们直接来自食物摄入或来自肠道代谢的多酚。在本研究中，这些化合物的抗氧化活性首先在膜模型中进行了评估，其中咖啡酸作为一种非常有效的断链抗氧化剂，而丁香酸和原儿茶酸只是脂质过氧化的缓凝剂。然而，这三种化合物在培养细胞受到低水平的H产生的外源性氧化应激时，都能很好地清除活性物种2O2．许多肿瘤细胞的特征在于与非癌症对应物相比增加了ROS水平。因此，我们研究了低浓度，与人血浆中存在的低浓度的酚酸是否能够降低基础反应性物种。结果表明，酚醛酸在白血病细胞系（HEL）中还原RO，而在正常细胞中没有观察到效果，例如HUVEC。该化合物对正常细胞表现出毒性，同时它们在白血病细胞中减少，诱导细胞凋亡。在关于癌症治疗中最佳ros操纵策略的辩论中，我们在白血病细胞中的工作支持抗氧化剂ros消耗方法。

1.介绍

在科学文献中，术语多酚也指酚酸，尽管从严格的结构角度纯粹基于化学定义，它们是单酚化合物，Quideau等人广泛声明[1]．将酚酸归入植物多酚家族的原因在于，它们是多酚的生物递归物，更重要的是，它们是多酚的代谢物。许多论文和综述描述了酚酸的生物利用度的研究，强调通过食物消费的直接摄入和由胃、肠和肝脏代谢产生的“真”多酚的间接生物利用度[2- - - - - -8]．

两个方面必须加以考虑时在细胞培养物作为模型被测试膳食的酚类化合物：很少以游离形式，即，糖苷配基，是在到达血液和组织中的实际分子;和所使用的浓度应该是类似于在循环系统所发现，即，nmol / L的低毫摩尔/ L [6，9]．

十多年前，我们开始研究酚酸的抗氧化活性，这些酚酸来源于多酚的肠道代谢或直接来源于食物，代表酚酸的两大类，羟基肉桂酸和羟基苯甲酸。我们从均相溶液和膜模型实验开始，在低微摩尔浓度下测试了这些酚酸的抗氧化性能。特别地，我们研究了咖啡酸(CAF)，一种肉桂酸的衍生物携带两个羟基ortho.位置，丁香（SYR），和原（PRO）的酸，具有羟基的结构：SYR在位置3和5和羟基的甲氧基在4和PRO在位置3和4个羟基。

CAF的直接来源是日期，浆果，水果，如杏，苹果，猕猴桃，香料，药材，蔬菜，饮料，如咖啡，酒，并在较小程度上，啤酒[10.- - - - - -13.]．SYR的主要来源是瑞士甜菜，橄榄，核桃，红枣，香料和南瓜[10.，14.]．PRO，除了是花青素的主要代谢物之一[15.]，存在于可可粉，日期，菊苣，橄榄和洋葱中[10.]．

这些化合物已经主要研究了其对氧化性损伤性质导致各种退行性疾病，如心血管疾病，炎症和癌症。事实上，肿瘤细胞，包括白血病细胞，通常具有较高水平的活性氧簇（ROS）比正常细胞，以使它们对氧化应激特别敏感。在正常细胞和癌细胞之间ROS水平差异是由于在肿瘤细胞中的氧化还原平衡的时，例如，细胞内产生的ROS的增加，或当抗氧化防御系统被耗尽的是开发失调[16.- - - - - -22.]．ROS在癌症中的重要性是毋庸置疑的，但科学家们仍然不完全理解物种如何反应行动[23.]．许多评论广泛地描述癌症中ROS的来源，机制和参与，并说明细胞氧化还原调控在癌症治疗发展中的作用[24.- - - - - -30.]．特别是，最近王和易[31.[well review了“在癌症治疗中两个矛盾的ros操纵策略”，这是相反的前抗氧化剂和抗氧化方法。他们提出了“氧化还原信号特征”的发展，这是一组参数的组合，如氧化还原状态、抗氧化酶表达、细胞信号和转录因子激活谱，在特定类型的癌细胞中，用来作为选择硬币两面之一的指标:提高或消除ros的特定治疗特定类型的癌细胞。杀死细胞的一种方法是诱导细胞凋亡，即细胞程序性死亡。这一目标是否应该通过减少或增加ROS来实现尚存争议，可能取决于每种细胞类型的“氧化还原信号信号特征”。这种策略的优点，即诱导细胞凋亡通过死亡信号传导途径，是正常细胞不会显着影响，因为它们的基础ROS水平较低，因此，它们易于氧化还原的变化。最近，Halliwell观察到反应性物种的各种对癌症的各种贡献之一是它们抑制细胞凋亡的能力[23.]．Akt的是原型激酶促进细胞存活：Akt蛋白通过直接磷酸化凋亡级联的关键调控蛋白[增强生存32.]．事实上，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/ Akt途径是在许多肿瘤中组成性活性。PI3K的磷酸化激活Akt和磷酸化通过p-Akt的激活键生存蛋白质并失活促凋亡基材。这些蛋白的磷酸化降低肿瘤易感于凋亡应力。换句话说，所述PI3K / Akt途径的激活是由ROS调节细胞存活癌变过程的机制之一。

通过使用抗氧化剂抑制ROS减少了癌细胞中ROS激活的抗凋亡途径[29.，33.]．尽管一些研究报告高水平的活性氧打开细胞死亡信号[25.]和去磷酸化的Akt导致细胞凋亡是由ROS [诱导34.]，许多论文表明肿瘤中与PI3K / Akt通路的增加的氧化还原应力之间的链路。35.，36.]．

我们以前的研究调查IL-3对M07E人急性髓性白血病（AML）细胞系的影响指出，该细胞因子的耐受效应由NAD（P）H氧化酶同种型NOx2-衍生的ROS产生介导，并被抑制抗氧化剂，NAD（P）H氧化酶（NOx）抑制剂或NOx2表达的特异性敲低[37.，38.]．在一个不同的AML细胞系，B1647，表达NOX2和的Nox4 [39.，我们发现VEGF信号和Nox活性是耦合的，并且Nox和VEGF受体2的抑制剂能够诱导这些白血病细胞系的凋亡[40]．

从我们的经验在模型系统和抗氧化特性的研究对活性氧的作用及其在白血病细胞增殖抑制剂,这项工作的目的是探讨三个饮食中酚酸的抗氧化活性膜模型和白血病细胞系,冥界,并探讨反应种、细胞增殖和细胞凋亡之间的关系。

2.材料和方法

2.1。材料

蛋黄卵磷脂(磷脂酰胆碱，PC)购自英国红山脂质制品公司。热稳定性偶氮化合物2,2 ' -偶氮二(2-甲基丙脒)盐酸盐(AAPH)、咖啡酸(CAF)、丁香酸(SYR)、原儿茶酸(PRO)、6-羟基-2,5,7,8-四甲基铬-2-羧酸(Trolox, TRO)、α.-生育酚(Tocoph)，双氧水，2 '，7 ' -二氯二氢荧光素二醋酸(H2DCFDA，二氯荧光酸二甲酸二乙酸酯，3-（4,5-二甲基 - 噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴（MTT），台盼蓝，IgePal Ca-630，荧光底物N-乙酰基ASP-Glu-Val-ASP-7-酰氨基-4-甲基香豆素（AC-DEVD-AMC）用于胱天蛋白酶3，N-乙酰基异亮氨酸 - 谷氨酸 - 苏氨酸 - 天冬氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素（AC-IETD-AMC），用于Caspase 8，N-乙酰-Leu-glu-His-ASP-7-氨基-4-三氟甲基伞素格林素（AC-LEHD-AFC）用于胱天蛋白酶9，脱钒酸钠，苯基甲磺酰氟（PMSF），N氯甲基酮盐酸盐(TLCK)N-P-Tosyl-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK），蛋白酶抑制剂鸡尾酒，含有2-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液，从Sigma-Aldrich获得小鼠单克隆抗胰岛素抗体。HEL（人赤瘤血症）细胞培养来自DSMZ（Braunschweig，德国）;Huvec（人脐静脉内皮细胞）被Claudio Muscari教授，博洛尼亚大学生物化学系克劳迪奥穆斯卡里捐赠;RPMI 1640（用HEPES，带L-谷氨酰胺），胎牛血清，青霉素/链霉素，购自PAA。Atlite 1step发光套件来自PerkinElmer。硝酸纤维素膜和Amersham ECL加上Western印迹检测试剂来自Ge-Healthcare。抗胱天悬浮酶3，抗BAX，抗BCL-2和抗P-AKT抗体购自电池信号技术。从Santa Cruz生物技术获得与辣根过氧化物酶缀合的抗兔和抗小鼠IgG。PageRerer Prested蛋白梯是来自Fermentas，Thermo Fisher Scientific。所有其他化学品和溶剂都是最高的分析级。

2.2。制备大不玻璃囊泡

通过在圆底管中加入适量的磷脂酰胆碱来制备囊泡。用氮气流小心地除去溶剂，得到薄膜，然后0.6ml磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2，含有1mM Na2EDTA是补充道。旋涡搅拌7分钟，获得的乳白色悬浮液转移到LiposoFast (Avestin, Ottawa, Canada)中，通过两个聚碳酸酯过滤器(孔径100 nm, Nucleopore Corp.， Pleasenton, CA)来回挤压21次，获得大的单瓣囊泡(LUVET)。然后调整总体积，使最终浓度为15mm PC。酚酸的乙醇溶液加入到LUVET中，最终浓度在1.3 ~ 10之间μ.所述酸的M个。

2.3。囊泡自动氧化

在存在或不存在抗氧化剂的自氧化实验通过用Clark型电极（耶洛斯普林斯仪器公司，OH）监测的氧浓度下进行。After thermal equilibration of LUVET at 37°C, the appropriate amount of AAPH was added to the suspension in order to obtain a final AAPH concentration of 17 mM, suitable for LUVET peroxidation initiated by water soluble azo compounds [41.]．反应池总是从室温光保护，以避免光分解引发剂。

２.４.细胞培养

从患有急性髓性白血病的患者获得的外周血中建立的人类红癣菌细胞系（HEL）在补充有10％（v / v）的热灭活胎牛血清的RPMI中生长，其补充有100u / ml青霉素和100克/在37℃下在37℃下硫酸盐硫酸盐维持在5％Co.2．用不同浓度（5,10,20,50或100处理细胞 μ.m）caf，syr，pro，trolex，和α.-生育酚，溶于乙醇或超纯水20小时。

2.5。测量细胞内ROS

细胞( /毫升）在PBS中洗涤两次，并用5孵育 μ.M 2'，7'-二氯二氢荧光二乙酸酯（H2DCFDA) for 20 min at 37°C. H2DCFDA是一种扩散到细胞内的非极性、非荧光小分子，在细胞内被酯酶去乙酰化成极性非荧光化合物，氧化成高度绿色荧光2 '， -dichlorofluorescein（DCF）。使用多孔板读数器（Wallac Victor）测量氧化探针的荧光2PerkinElmer)。激发波长为485 nm，发射波长为535 nm [42.，43.]．

2.6。细胞活力和增殖

通过台盼蓝排除试验评估可活细胞。MTT测定还测定细胞活力，因为四唑鎓盐的还原被广泛接受作为检查细胞活力/增殖的可靠方法[44.]．细胞( )在96孔平板中加入0.5 mg/mL MTT, 37℃孵育4 h。孵育结束时，形成蓝紫色福马赞盐晶体，加入增溶液(10% SDS, 0.01 M HCl)溶解，然后在37℃，5% CO的湿化气氛中孵育过夜2）确保完全裂解。使用多孔板读取器（Wallac Victor）测量570nm处的吸光度2PerkinElmer)。此外，通过使用基于Firefly（Photinus Pyralis）荧光素酶的ATP监测系统，通过使用Atplite 1step Luminescence试剂盒来评估细胞活力。由ATP与添加的荧光素酶和D-荧光素的反应产生的发光光与所有代谢活性细胞中存在的ATP浓度成比例。根据供应商的指示，在96孔黑色透明板中，100μ.将重组试剂的L加到每孔中 细胞（100 μ.l），在室温下平衡。使用轨道微孔板振荡器在700rpm下摇动2分钟，然后使用多阱读卡器测量发光（Wallac Victor2PerkinElmer)。

2.7。半胱天冬酶活力测定

AC-DevD-AMC用作Caspase 3的荧光基底，用于Caspase 8的AC-IETD-AMC，以及Caspase的AC-Lehd-AFC 9.在不同的处理之后，在37℃下在37℃下与特定底物一起温育细胞裂解物15 min. The activity of caspase 3 and caspase 8 was measured following the hydrolysis of fluorogenic substrates resulting in the release of the fluorescent AMC; excitation wavelength was 370 nm, emission wavelength was 455 nm. The caspase 9 activity was determined by measuring the fluorescence of AFC; the excitation and emission wavelengths of AFC were 400 and 505 nm, respectively. Measurements were performed by a Jasco FP-777 spectrofluorometer.

2.8。免疫印迹和密度分析

Western印迹分析以检测胱天蛋白酶原3，切割的胱天蛋白酶3和Bax，Bcl-2和P-Akt和微管蛋白，通过使用相应的抗体。细胞s were lysed with a lysis buffer (1% Igepal, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 0.1 mM TLCK, 0.1 mM TPCK, 1 mM sodium orthovanadate and protease inhibitor cocktail, pH 8.0) in ice for 15 min. Samples were added to Laemmli sample buffer containing 2-mercaptoethanol and kept at 95°C for 5 min to solubilise the proteins. Then they were separated on 10% SDS-polyacrylamide gel using a Mini-Protean III apparatus (Bio-Rad Laboratories). Proteins were transferred electrophoretically to nitrocellulose membrane at 100 V for 60 min. Nonspecific binding was blocked by incubating with Tris-buffered saline (TBS)/Tween, pH 8.0, containing 5% nonfat, dry milk for 1 h at room temperature. Nitrocellulose membranes were incubated overnight at 4°C with primary antibodies, washed 3 times with TBS/Tween, and incubated for 60 min at room temperature with secondary antibodies in TBS/Tween containing 5% nonfat dry milk. Membranes were washed and developed using Amersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents. Images of the blots were obtained using a CCD imager (Fluor-S Max MultiImager System, Bio-Rad Laboratories) and bands were acquired and analyzed by using Bio-Rad Quantity One analysis software. Cleaved caspase 3 immunoreactive bands were quantitated and expressed as the ratio of each band density to control band density. Bax and Bcl-2 immunoreactive bands were quantitated and expressed as the ratio of Bax band density to Bcl-2 band density for each sample.

2.9。统计分析

结果表达为具有标准偏差至少三个独立实验的手段。手段之间的差异由双尾学生确定t通过单向ANOVA进行测试或通过Newman-Keuls多个比较测试。

3。结果与讨论

起初，CAF，SYR和Pro的抗氧化活性（见图1）在磷脂酰胆碱的大单层囊泡，其中的界面相互作用，分子堆积，和脂质相的动力学可以设想类似于天然膜的膜模型进行了研究。


图1
所研究的酚酸化学结构。

自氧化试验通过监测与小型化的克拉克型电极的氧消耗，并通过使用水溶性偶氮化合物AAPH作为自由基过氧化引发剂和水溶性维生素E作为抗氧化剂的参考进行。AAPH，由于其亲水性，根据明确定义的路径在水相中以恒定的速率产生了自由基链引发[45.[是理解亲水性和亲脂过氧化抑制剂对来自外部水环境的氧自由基对生物膜的侵蚀的有效工具。

抗氧化剂在1-10的浓度范围内进行了测试μ.m，和图2显示在5μ.M，在我们的实验条件下，15 mM PC单片囊泡和17 mM AAPH在37℃下的最佳抗氧化剂抑制期识别浓度[46.，47.]．在图中报告的氧消耗痕迹2在37℃和pH 7.2中获得，表明CAF表现为非常有效的抗氧化剂，显示比用相同量的滴水量测量的抑制时间和更高的抑制时间和更高的速率常数。此外，线性关系（ = 0.996）被发现CAF的浓度和在此处报道的浓度范围内的抑制周期之间（见插图图2）。


图2.
μ. μ. Oxygen uptake traces during AAPH (17 mM) induced peroxidation of PC (15 mM) unilamellar vesicles at 37°C and pH 7.2 in the absence of inhibitor (control) and in the presence of one of the various phenolic antioxidants, each at the same concentration (5 箭头显示抗氧化注射。插图:CAF浓度之间的关系(1.3到10m）和测量的抑制期。

在类似量的SYR和PRO的存在下，氧消耗率稍微相对于对照实验减少，但没有发生任何明显的抑制时间。这种减少大于当CAF或水溶性维生素E的相同量加入到该测定中观察到的非常小（图2）。因此，Syr和Pro表现不示为有效的抗氧化剂，因为在它们存在下没有发生明显的抑制时间。根据Pryor等人。[48.“这类化合物通常被归类为缓凝剂而不是抗氧化剂，”因为它们与过氧自由基发生反应，减缓了脂质氧化的起始和增殖步骤，但并不完全阻止它。

许多因素负责化合物的自由基清除活性体外．必须考虑到结构、热力学和动力学方面[47.，49.- - - - - -54.]．分子中的儿茶酚部分存在是最深入的研究特征之一。第二方面是环取代基的影响。例如，丙烯酸类CH = CH-CH-CHOHpar关于酚醇的位置在确定肉桂酸如咖啡酸的良好抗氧化性能方面是一些相关性。相反，Protocatechuic酸的较低反应性是由于电子抽出的CoOH环取代基的存在;电子捐赠OH组具有更强的效果然后och3.抗氧化能力的能力。不太常见的特征是 羟基的值，即确实导致抗氧化活性对测试化合物的缓冲溶液的pH值的非常强烈的依赖性​​。最后，但不尽面，必须考虑分子的不同亲水性，导致水与脂质相之间的抑制剂的不同分配。

因此，我们评估了CAF，SYR和PRO在低于外源性H的低致病水平产生的氧化应激后降低细胞内ROS含量的能力2O2在人造血细胞系HER（人灌水血症）和初级培养的HUVEC（人脐静脉内皮细胞）中。

HUVEC和造血细胞(如HEL)有一个共同的祖细胞，称为成血管细胞，这是一种多能细胞，能够分化为内皮细胞和造血细胞。尽管许多细胞途径仍不清楚，但近百岁的血管成细胞假说现在已被证实[55.，因为已经检测到一些细胞事件和通路。此外，血管生成和癌症发展之间的严格关系已被广泛证实:VEGF及其受体参与促进固体和液体肿瘤的生长和增殖[56.- - - - - -61.]．因此，HUVEC是“正常”细胞，经常被选择与肿瘤细胞进行比较[62.，63.特别是本研究中的HEL细胞系。

用细胞 - Permant探针H测量ROS水平2DCFDA，由于细胞内转化为高度绿色荧光的DCF，通常用于检测细胞中自由基/ROS的产生[64.]．一般而言，dihydrofluorescein确实的各种活性氧/氮物种之间不判别，但它仍然是细胞氧化应激的最直接的和通用的指示符。

如图所示3.，预先孵育20小时的酚酸，表现为良好的抗氧化剂，因为它们能够在30分钟阐述至50后降低ROS水平 μ.M.2O2在两个细胞系统中;这一减少可与由α.-Tocophherol，最有效的脂溶性抗氧化剂营养素，以及其水溶性类似物，滴油。

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图3.
μ. 2 2 μ. μ. 2 2 2 2 HEL细胞中酚类化合物和HUVEC暴露于50的氧化胁迫抗氧化效应 M.O．细胞与不同的化合物(5或10M为HEL细胞，(a);10M表示HUVEC，（b）中）处理20小时，用H处理O30.．．．分钟，然后通过H测量ROS水平DCFDA测定如部分所述．结果表示为平均值±三次独立实验的SD，每个在一式八份进行。，与对照细胞显着不同;，与控制单元明显不同。

与非肿瘤细胞相比，许多肿瘤细胞的特征是ROS生成增加。检测HEL细胞的基础细胞内ROS水平，并与HUVEC细胞内ROS水平进行比较。数字4确认癌细胞表现出体积高水平RO的观点，显示HEL细胞中的ROS含量约为正常细胞HUVEC。


图4.
2 2 HEL细胞和HUVEC中基底ROS水平的比较。通过H测量ROS水平DCFDA测定如部分所述．结果表示为平均值±三次独立实验的SD，每个在一式八份进行。显着差异．

随后，我们研究了低浓度的酚酸是否可能与人血浆中存在的那些相当[12.，65.- - - - - -67.，能够减少基础反应物质。图中显示的图形5表明，在HEL细胞的减少约20％的20-h后，而在HUVEC甚至在较高浓度下，没有观察到效果。

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图5.
μ. μ. 2 2 酚类化合物对HEL细胞和HUVEC基础ROS水平的影响。用不同的化合物(5或10M为HEL细胞，(a);20M表示HUVEC，（B））为20小时，然后ROS水平的H来测量DCFDA测定如部分所述．结果以平均数±标准差表示，四个独立实验，每个八重复。，与对照细胞显着不同;，与控制单元明显不同。

ROS可能会促进细胞增殖并有助于癌症发展的大量文献报告。在过去的十年中，我们证明ROS对于两种不同（红斑）巨核细胞白血病细胞系中的细胞存活是必不可少的，类似于HEL;Nox家族是ROS的主要来源（NOX4和/或NOX2）;ROS生产可以充当抗腐蚀因子，保护白血病细胞免受凋亡，抗氧化剂抵消的影响[37.- - - - - -40，68.- - - - - -72]．

为了验证ROS在肿瘤细胞增殖中的作用，我们检查了CAF，SYR和Pro对细胞活力的影响，由台盼蓝排除试验和MTT测定评估（图6），并将其与Trolex相比α.生育酚的效果。所有抗氧化剂都轻微地降低了白血病细胞的活力/增殖(图)图6（a）和6（b）），而它们并不影响HUVEC生存能力甚至在较高的浓度（图6（c））。

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图6.
μ. μ. 2 μ. 2 酚类化合物对细胞活力/增殖的影响。用不同的化合物（5至100℃处理细胞 M代表HEL细胞中，（a），（b）和（d）;20.M表示HUVEC，（c））的20小时。（A）：活力通过台盼蓝排除测试估计。（b）和（c）中：活力/增殖通过MTT测定评价为部分所述．结果表示为平均值±三次独立实验的SD，每一式四份进行。，与对照细胞显着不同;，与对照细胞显着不同;，与控制单元明显不同。(d): 10、50或100处理20小时后HEL细胞的活力M化合物，由Atplite 1Step发光试剂盒测定，如截面所述．结果表示为三种独立实验的平均值±SD，各自一式三份进行。所有值与控制有显着差别（）。

以排除MTT测定伪像或干涉[73- - - - - -76，但未检测到对四唑盐的直接反应体外，我们进行了补充活力实验，通过测量细胞内ATP水平的HEL细胞，也在较高的酚酸浓度。图中报告的测量值6（d）确认使用其他方法获得的结果。

考虑到缺少对HUVEC生存能力测试的化合物的效果，进行了进一步的研究以表征白血病HEL细胞诱导酚酸的细胞死亡，着眼于典型的细胞凋亡的特征。半胱氨酸蛋白酶在调节各种细胞凋亡反应中发挥核心作用，并在分裂的连续级联被激活。效应胱天蛋白酶的活化，例如胱天蛋白酶3，由引发剂胱天蛋白酶，例如特定的内部天冬氨酸残基后的胱天蛋白酶8和9，通过蛋白水解裂解执行，以分离成熟Caspase的大，小亚单位。为了检测胱天蛋白酶的酶活性，三个荧光底物被使用：AC-DEVD-AMC被用作底物胱天蛋白酶3;的Ac-IETD-AMC用于胱天蛋白酶8;的Ac-LEHD-AFC为胱天蛋白酶9 HEL细胞与抗氧化剂的治疗刺激以剂量依赖性方式所有测试胱天蛋白酶的活性，如图7，报告了AMC或AFC的荧光。

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图7.
μ. 2 胱天蛋白酶活性在酚类化合物处理后HEL细胞。HEL细胞用不同的化合物（5，10，50，或100中温育 M）20小时，然后细胞裂解物与三种不同的底物在37℃下孵育15分钟，这是Ac-DEVD-AMC作为胱天蛋白酶3的（a），AC-IETD-AMC用于胱天蛋白酶8（具体荧光底b）中，和Ac-LEHD-AFC为胱天蛋白酶9（c）中，如在部分所述．结果表示为四种独立实验的平均值±SD，各自一式三份进行。，与对照细胞显着不同;，与对照细胞显着不同;，与控制单元明显不同。

接着，我们研究了酚类化合物的促凋亡作用在HEL细胞，进行SDS-PAGE，随后通过在细胞裂解物蛋白质印迹检测胱天蛋白酶3和Bax和Bcl-2蛋白（图8）。切割的Caspase 3上的Western印迹结果与通过荧光测定获得的结果吻合良好，如图所示8(c).此外，酚酸能够提高促凋亡细胞Bax的表达;同时，原存活Bcl-2也减少了。Bax和Bcl-2是参与细胞凋亡的蛋白，作用方式相反;因此，Bax/Bcl-2比值是一个有用的凋亡指标。抗氧化化合物在20小时的孵育后，导致该比率呈剂量依赖性增加(图)8（d））。


图8.
μ. 2 对细胞凋亡的酚类化合物。HEL cells were incubated with different compounds (5, 10, 50, or 100m）20小时，然后将细胞裂解物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹，与所示的抗体如截面所述．管蛋白检测用作对照。显示了代表性免疫印迹。（a）：抗Caspase 3;（b）：抗BAX和抗BCL-2;（e）：抗p-akt。（c）：裂解胱天蛋白酶3的三个独立蛋白印迹测定的密度分析（17kDa片段）。（d）：BAX / BCL-2与三个独立实验密度分析的比例。，与对照细胞显着不同;，与对照细胞显着不同;，与控制单元明显不同。

在哺乳动物中，最有效的抗凋亡存活途径之一是通过PI3K / Akt信号[表示77，78]．活化的Akt是PI3K调控的促生存信号的主要中介[79]．Akt活性磷酸化形式(p-Akt)通过磷酸化下游调控细胞周期和凋亡的分子来促进细胞增殖和存活[80]．数字8(e)表明，研究中的酚类分子处理轻微降低了Akt的磷酸化水平，再次证实了它们的促凋亡作用。

4。结论

在这项研究中，我们评估了一些酚酸的抗氧化活性，这些酚酸来源于食物的直接吸收和肠道微生物对类黄酮的裂解。这些化合物作为断链抗氧化剂，在膜模型中具有不同的效果，并能够对比白血病和正常细胞中由于外源性氧化应激而引起的细胞内ROS的升高。此外，我们观察到酚酸能够清除HEL细胞中的活性氧，其特点是细胞内ROS水平非常高。它们对正常细胞没有毒性，而在白血病细胞中却减少增殖，诱导细胞凋亡。事实上，它们提高了caspase 3、8和9的活性，增加了凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的比例，并降低了Akt的激活。

在关于癌症治疗中最佳ros操纵策略的辩论中，我们在白血病细胞中的工作支持抗氧化剂ros消耗方法。

缩写

CAF: 咖啡酸
湖浆: Syringic酸
亲： 原儿茶酸
有望: 水溶性维生素E
Tocoph： α.生育酚
ROS: 反应性氧气
AML： 急性髓系白血病
氮: NAD（P）H氧化酶
VEGF: 血管内皮细胞生长因子
Aaph： 2， -azobis (2-methylpropionamidine)盐酸盐
PC: 磷脂酰胆碱
帮助: 人类erythromegakaryocytic白血病细胞系
： 2'， -二氯二氢荧光素二乙酸酯(也称二氯荧光素二乙酸酯)
贴现: 二氯荧光素
MTT： (3) - 4 5-dimethyl-thiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子
HUVEC： 人脐静脉内皮细胞
AC-DEVD-AMC： n -乙酰Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-methylcoumarin
Ac-IETD-AMC: N-乙酰-Ile-glu-thr-Asp-7- amido-4-甲基伞素
AC-Lehd-AFC： N-乙酰基亮氨酸 - 谷氨酸 - 组氨酸 - 天冬氨酸 - 7-酰氨基-4-三氟甲基
AMC: 7-amido-4-methylcoumarin
亚: 7-amido-4-trifluoromethylcoumarin。

作者的贡献

L. Zambonin和C. Caliceti：同等贡献这项工作。

致谢

作者非常感谢Chiara的甘贝里尼博士和弗朗西斯Bonafè博士谁慷慨地提供用于该研究培养HUVEC，并加布里埃莱哈基姆教授科学的建议和指导。他们感谢CIRB（炫酷Interdipartimentale二Ricerche Biotecnologiche，博洛尼亚大学，意大利）的使用Bio-Rad公司氟-S最大MultiImager系统。这项工作是由MIUR和基金会蒙特博洛尼亚Ë意大利拉文纳的资助。该资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿没有任何作用。

参考

  1. S. Quideau，D. Deffieux，C. Douat-Casassus，和L.Pouységu，“植物多酚：化学性质，生物活性，和合成，”Angewandte Chemie，第50卷，第5期。3，第586-621，2011。视图:出版商网站|谷歌学者
  2. S. Lafay和A.Gil-Izquierdo，“酚醛酸的生物利用度”植物化学评论，第7卷，第5期2，第301-311页，2008。视图:出版商网站|谷歌学者
  3. C. Manach, A. Scalbert, C. Morand, C. Rémésy，和L. Jiménez，《多酚:食物来源和生物利用度》，美国临床营养杂志，第79卷，第5期。5，页727-747,2004。视图:谷歌学者
  4. C. Manach，G. Williamson，C. Morand，A. Scalbert和C.Rémésy，“人类中多酚的生物效率和生物效率。I.审查97个生物利用度研究，“美国临床营养杂志第81卷第1期1、增刊，2300s - 242s页，2005。视图:谷歌学者
  5. M. D'ARCHIVIO，C. Filesi，R.狄Benedetto的，R. GARGIULO，C.焦万尼尼和R. Masella，“多酚，食物来源和生物利用度，”安娜丽·戴尔·桑尼塔高等学校，卷。43，不。4，pp。348-361,2007。视图:谷歌学者
  6. A. Crozier，I. B. Jaganath和M. N.Clifford，“饮食酚类：化学，生物利用度和对健康的影响”天然产物报告第26卷第2期8, pp. 1001-1043, 2009。视图:出版商网站|谷歌学者
  7. M. D'ARCHIVIO，C. Filesi，R. VARI，B. Scazzocchio和R. Masella“的多酚的生物利用度：状态和争议，”国际分子科学杂志，第11卷，第5期。4, pp. 1321-1342, 2010。视图:出版商网站|谷歌学者
  8. S. C. Forester和A. L. Waterhouse，“代谢物是了解葡萄酒多酚的健康影响”的关键，“营养杂志，第139卷，第139期9，第1824S-1831S页，2009。视图:出版商网站|谷歌学者
  9. P. A.克朗，M. N.克利福德A.克罗泽等人，“我们应该如何评估暴露于体外？饮食多酚的影响”美国临床营养杂志，卷。80，不。1，第15-21，2004。视图:谷歌学者
  10. V.NEVEU，J.Perez-Jiménez和F. Vos，“苯酚探险家：在食品中的多酚内容的在线综合数据库”。视图:出版商网站|谷歌学者
  11. D.德尔里奥，G博尔赫斯和A.克罗泽，“贝瑞黄酮类和酚类物质：生物利用度和保护作用的证据。”英国营养杂志， vol. 104, supplement 3, pp. S67-S90, 2010。视图:出版商网站|谷歌学者
  12. M.纳尔迪尼，E.奇里洛，F. Natella和C. Scaccini，“在饮用咖啡后人类的酚酸吸收”农业和食品化学杂志，第50卷，第5期。20，页5735-5741,2002。视图:出版商网站|谷歌学者
  13. M. Nardini, F. Natella, C. Scaccini, and A. Ghiselli，“啤酒中的酚酸在人体中被吸收和广泛代谢，”营养生物化学的，卷。17，不。1，pp。14-22,2006。视图:出版商网站|谷歌学者
  14. M. I. GIL，F. Ferreres和F.A.Tomás-Barberán，改良气氛包装对黄酮类化合物和维生素C含量的影响最小加工的瑞士汉语（Beta寻常亚种Cycla），“农业和食品化学杂志第46卷，第46期第5页，2007-2012,1998。视图:谷歌学者
  15. P. Vitaglione，G. Donnarumma，A.纳波利塔诺等人，“原儿茶酸是矢车菊素糖苷的主要的人类代谢物”营养杂志第137卷第1期9，页2043 - 2048,2007。视图:谷歌学者
  16. H.蒲田和H.平田，“细胞信号的氧化还原调节，”蜂窝信令，第11卷，第5期。1，第1 - 14页，1999。视图:出版商网站|谷歌学者
  17. N. Ballatori，S. M. Krance，S. Notenboom，S. Shi，K.Iteu，以及C.L.Hamond，“谷胱甘肽失调和人类疾病的病因和进展”，“生物化学，卷。390，没有。3，pp。191-214，2009。视图:出版商网站|谷歌学者
  18. J. P. Fruehauf和F. L. Meyskens Jr.，《活性氧物种:生或死的呼吸?》临床癌症研究，卷。13，不。3，pp。789-794,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
  19. V. Battisti，L. D. D. Maders，M. D.Bagatini等，“急性淋巴细胞白血病患者中的氧化应激和抗氧化状态的测量”临床生物化学号，第41卷。7-8，页511-518,2008。视图:出版商网站|谷歌学者
  20. M. J. Farquhar和D. T. Bowen，“氧化应激和骨髓增生异常综合征”，国际血液学杂志，卷。77，没有。4，pp。342-350,2003。视图:谷歌学者
  21. A. Sallmyr, J. Fan，和F. V. Rassool，“髓系恶性肿瘤的基因组不稳定性:活性氧(ROS)增加，DNA双链断裂(DSBs)和容易出错的修复”癌症信件，卷。270，没有。1，第1-9，2008年。视图:出版商网站|谷歌学者
  22. M. M. Reddy, M. S. Fernandes, R. Salgia, R. L. Levine, J. D. Griffin，和M. Sattler，“NADPH氧化酶调节由致癌酪氨酸激酶转化的髓系细胞的生长和迁移，”白血病，卷。25，不。2，pp。281-289,2011。视图:出版商网站|谷歌学者
  23. B.哈利韦尔，“氧化应激和癌症：有我们前进？”生物化学杂志，卷。401，没有。1，第1-11页，2007年。视图:出版商网站|谷歌学者
  24. P. S.孔，R. L.达利，和A.唐克斯，“不要活性氧在髓细胞性白血病中发挥作用？”血液，第117卷，第117号22, pp. 5816-5826, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者
  25. G. Y.十六大和P.斯托斯，“在癌症活性氧”自由基研究，卷。44，不。5，第479-496，2010。视图:出版商网站|谷歌学者
  26. A. J. Montero和J. Jassem，“细胞氧化还原途径作为治疗癌症的治疗靶标”药物，卷。71，没有。11，页。1385年至1396年，2011。视图:出版商网站|谷歌学者
  27. D. Trachootham，J.亚历山大，和P.黄“由ROS介导的机制靶向癌细胞：自由基的治疗方法？”自然评论药物发现，第8卷，第2期7，第579-591页，2009。视图:出版商网站|谷歌学者
  28. A.阿查里雅，一达斯，D.查铎和T.萨哈，“氧化还原调控的癌症：具有治疗潜力的一个双刃剑”氧化医学与细胞寿命，第3卷，第2期。1，页23-34,2010。视图:谷歌学者
  29. J.S.Clerkin，R.Naughton，C. Quiney和T.G.Cotter，致癌物中的ROS调制细胞存活机制，“癌症信件，卷。266，没有。1，pp。30-36,2008。视图:出版商网站|谷歌学者
  30. G. T. wondrake，《氧化还原导向的癌症治疗:分子机制和机遇》，抗氧化剂和氧化还原信号，第11卷，第5期。12，pp。3013-3069，2009。视图:出版商网站|谷歌学者
  31. J. Wang和J. Yi，“通过ROS杀死癌细胞:增加或减少，这是一个问题，”癌症生物学与治疗，第7卷，第5期第12页，1875-1884,2008。视图:谷歌学者
  32. A. M.Martelli，G.Gabellini，R.Bortul等，“磷酸阳性3-激酶/ AKT信号传导途径的抗性在人白血病治疗治疗中”的参与“组织学和组织病理学，第20卷，第2期。1，页239-252,2005。视图:谷歌学者
  33. S. Dong-Yun, D. Yu-Ru, L. shan lin, Z. Ya-Dong, W. Lian，“氧化还原应激通过Akt蛋白磷酸化调控人肝癌细胞增殖和凋亡，”费用字母，卷。542，没有。1-3，pp。60-64,2003。视图:出版商网站|谷歌学者
  34. J.曹，D.许，D. Wang等人，“ROS驱动的Akt去磷酸化的Ser-473参与4-HPR介导的凋亡在NB4细胞，”自由基生物学与医学，第47卷，第47期。5，第536-547页，2009。视图:出版商网站|谷歌学者
  35. E. Dozio, M. Ruscica, L. Passafaro等，“天然抗氧化剂α -硫辛酸诱导MCF-7人乳腺癌细胞p27kip1依赖的细胞周期阻滞和凋亡，”欧洲药理学杂志，卷。641，没有。1期，第29-34，2010。视图:谷歌学者
  36. A. M.马尔泰利，M.Nyåkern，G. Tabellini等人，“磷脂酰肌醇3-激酶/ Akt信号通路及其对人类急性骨髓性白血病治疗的影响，”白血病，第20卷，第2期。6，pp。911-928，2006。视图:出版商网站|谷歌学者
  37. T. Maraldi，C.Prata，F. Vieceli Dalla Sega等，“NAD（P）H氧化酶同种型NOx2在人白血病细胞中起着刺激作用”自由基研究，卷。43，不。11，PP。1111-1121,2009。视图:出版商网站|谷歌学者
  38. T.Maraldi，C.Prata，D.Fiorentini，L. Zambonin，L. Landi和G. Hakim，通过抗氧化剂的反应性氧物种调节诱导人白血病细胞系中的细胞凋亡“自由基生物学与医学第46卷，第46期2期，第244-252，2009。视图:出版商网站|谷歌学者
  39. C. Prata, T. Maraldi, D. Fiorentini, L. Zambonin, G. Hakim，和L. Landi，“在白血病细胞系中，氮氧化物产生的ROS调节葡萄糖摄取”，自由基研究，卷。42，不。5，PP。405-414,2008。视图:出版商网站|谷歌学者
  40. T. Maraldi，C.煎饼，C. Caliceti等人，“VEGF诱导的ROS产生从NAD（P）H氧化酶保护免于凋亡的人类白血病细胞，”国际肿瘤学杂志，卷。36，不。6，PP。1581-1589,2010。视图:出版商网站|谷歌学者
  41. D. Fiorentini, M. Cipollone, M. C. Galli, A. Pugnaloni, G. Biagini，和L. Landi，“作为研究由偶氮化合物引发的脂质过氧化的模型的大单叶囊泡的特性”，自由基研究，卷。21，不。5，第329-339，1994。视图:谷歌学者
  42. M. Lepoivre, A. C. Roche, J. P. Tenu, J. F. Petit, D. noolibe，和M. Monsigny，“通过监测氧化破裂和吞噬功能的流式细胞术鉴定两个巨噬细胞群体”，细胞生物学，卷。57，没有。2，pp.143-146,1986。视图:谷歌学者
  43. S. J. Vowells, S. Sekhsaria, H. L. Malech, M. Shalit, T. a . Fleisher，“粒细胞呼吸爆发的流式细胞分析:荧光探针的比较研究”，免疫学方法杂志，卷。178，不。1，第89-97，1995。视图:出版商网站|谷歌学者
  44. S. P.科尔，“使用MTT测定人肺肿瘤细胞的快速化学敏感性测试，”癌症化疗和药理学，卷。17，不。3，第259-263，1986。视图:谷歌学者
  45. Y.山本，E.尼基，Y.神谷，和H. Shimasaki，“脂质的氧化。7.氧化在均匀的溶液，并在水中分散磷脂酰胆碱，”生物化学与生物物理学ACTA，卷。795，没有。2，第332-340，1984。视图:出版商网站|谷歌学者
  46. G.F.Pedulli，M. Lucarini，E. Marchesi等，“脱吡哚的抗氧化活性的中等作用”自由基生物学与医学第26卷第2期3-4，页295-302,1999。视图:出版商网站|谷歌学者
  47. R.Amorati，G.F.F.Pepulli，L.Babrini，L. Zambonin和L. Landi，“溶剂和pH对碳酸和其他酚酸的抗氧化活性的影响”，“农业和食品化学杂志，卷。54，没有。8，第2932至2937年，2006年。视图:出版商网站|谷歌学者
  48. W. A. Pryor, J. A. Cornicelli, L. J. Devall et al.，“测定天然和合成抗氧化剂抗氧化能力的快速筛选试验”，有机化学杂志，第58卷，第2期13，第3521-3522页，1993。视图:谷歌学者
  49. C. A.稻草，N.J.Miler，P.G.Bolwell，P.M.Bramley，以及J.B.P.Pridham，“植物衍生的多酚类黄酮的相对抗氧化活性”自由基研究第22卷第2期4，第375-383页，1995。视图:谷歌学者
  50. C. A. Rice-Evans, N. J. Miller，和G. Paganga，“类黄酮和酚酸的结构-抗氧化活性关系”，自由基生物学与医学，第20卷，第2期。7，PP。933-956,1996。视图:出版商网站|谷歌学者
  51. W. boors, C. Michel和K. Stettmaier，“类黄酮的抗氧化作用，”生物膜，卷。6，不。4，PP。399-402，1997。视图:谷歌学者
  52. W.BORS，C. MICHEL和K. Stettmaier，“治疗植物多酚的抗氧化能力的结构 - 活性关系”方法酶学，第335卷，166-180页，2001。视图:出版商网站|谷歌学者
  53. P. Pedrielli，G. F. Pedulli和L. H. SKIBSTED，“黄酮类化合物的抗氧化机制。速率常数为溶剂的效果断链槲皮素的反应和在亚油酸甲酯的自氧化表儿茶素，”农业和食品化学杂志，卷。49，没有。6，PP。3034-3040,2001。视图:谷歌学者
  54. G. Brigati，M. Lucarini，V.Mugnaini和G.F.Pedulli，“EPR激进平衡技术的酚类抗氧化剂O-H粘合解离焓的取代基效应”有机化学杂志，卷。67，没有。14，pp。4828-4832，2002。视图:出版商网站|谷歌学者
  55. N.Cao和Z. X. Yao，“血管素：从概念到身份验证”解剖记录，第294卷，第2期4, pp. 580-588, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者
  56. Z.Zhu，K. Hattori，H.张等人，“抑制人体白血病在动物模型中，用血管内皮生长因子受体的人抗体进行2.抗体亲和力与生物活性之间的相关性，”白血病，卷。17，不。3，第604-611，2003。视图:出版商网站|谷歌学者
  57. A. Aguayo，H. Kantarjian，T.Manshouri等，“急性和慢性白血病的血管生成和骨髓增生症综合征”，血液，卷。96，没有。6，pp。2240-2245,2000。视图:谷歌学者
  58. G.麦克马洪，“肿瘤血管生成VEGF受体信号传导，”肿瘤学家， 2000年第5卷，增刊1，第3-10页。视图:谷歌学者
  59. S. Shinkaruk，M. Bayle，G.Laïn和G.Déléris，“血管内皮细胞生长因子（VEGF），癌症化疗的新兴靶标”目前的药用化学 - 抗癌剂，第3卷，第2期。2，页95-117,2003。视图:出版商网站|谷歌学者
  60. 血管内皮生长因子受体-1和受体-2在血管生成中的不同作用生物化学与分子生物学杂志，卷。39，没有。5，第469-478，2006年。视图:谷歌学者
  61. S. M.韦斯和D. A. Cheresh，“肿瘤血管生成：分子途径和治疗靶标，”自然医学，卷。17，不。11，pp。1359-1370，2011。视图:谷歌学者
  62. V. Rajagopalan, D. W. Essex, S. S. Shapiro, and B. A. Konkle， "肿瘤坏死因子-α.调节糖蛋白Ibα.在人内皮细胞和红白血病细胞中的表达血液，卷。80，不。1，pp。153-161,1992。视图:谷歌学者
  63. K. A. Weigel-Kelley, M. C. Yoder，和A. Srivastava，“重组人细小病毒B19载体:红细胞P抗原是成功转导人类造血细胞的必要但不是充分的，”病毒学杂志，卷。75，不。9，pp。4110-4116，2001。视图:出版商网站|谷歌学者
  64. E. Eruslanov和S. Kusmartsev，“ROS鉴定使用氧化DCFDA和流式细胞术，”分子生物学方法，卷。594，第57-72，2010。视图:出版商网站|谷歌学者
  65. A. Farah，M. Monteiro，C.M. donangelo和S. Lafay，绿色咖啡提取物的绿原酸在人类中高度生物，“营养杂志，卷。138，不。12，PP。2309-2315,2008。视图:出版商网站|谷歌学者
  66. R. M. Valls, A. Soler, J. Girona等人，“长期定期摄入初榨橄榄油对人类空腹血浆中酚代谢物的影响，”医药与生物医学分析杂志，卷。53，不。1，pp。68-74,2010。视图:出版商网站|谷歌学者
  67. D. Del Rio，A. Stalmach，L. Calani和A. Crozier，“咖啡绿原酸和绿茶Flavan-3-Ols的生物利用度”营养物质，第2卷，第2期8，页820-833,2010。视图:出版商网站|谷歌学者
  68. T. Maraldi, C. Prata, D. Fiorentini, L. Zambonin, L. Landi，和G. Hakim，“血小板生成素和粒细胞巨噬细胞集束刺激因子在人白血病细胞系中葡萄糖运输调节中的信号过程和ROS的产生，”自由基研究号，第41卷。12，PP。1348-1357,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
  69. T. Maraldi, D. Fiorentini, C. Prata, L. Landi，和G. Hakim，“白血病细胞中的葡萄糖转运调节:如何能H2O2模仿干细胞因子的影响？”抗氧化剂和氧化还原信号，第9卷，第5期。2，页271-279,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
  70. C. Prata, T. Maraldi, L. Zambonin, D. Fiorentini, G. Hakim，和L. Landi，“两种人类巨核细胞系的ROS产生和Glut1活性”，生物膜，第20卷，第2期。4，页223-233,2004。视图:谷歌学者
  71. D. Fiorentini, C. Prata, T. Maraldi等人，“活性氧对细胞因子敏感性不同的两种造血细胞系中Glut1调节的贡献”自由基生物学与医学，第37卷，第2期9、pp. 1402-1411, 2004。视图:出版商网站|谷歌学者
  72. T. Maraldi，D.菲奥伦蒂尼，C.煎饼，L.蓝底，和G.哈基姆，“干细胞因子和H2O2诱导M07e细胞GLUT1易位生物膜，第20卷，第2期。2，第97-108，2004年。视图:谷歌学者
  73. J. T. Sims和R. Plattner，“MTT法不能用于研究STI571/Gleevec对实体肿瘤细胞系生存能力的影响，”癌症化疗和药理学号，第64卷。3，第629-633页，2009。视图:出版商网站|谷歌学者
  74. R. Bruggisser, K. von Daeniken, G. Jundt, W. Schaffner，和H. Tullberg-Reinert，“MTT四唑分析对植物提取物、植物雌激素和抗氧化剂的干扰”Planta Medica.，卷。68，没有。5，第445-448，2002。视图:出版商网站|谷歌学者
  75. L.彭，B.王和P.仁，“在没有细胞的情况下，黄酮类化合物减少了MTT”胶体和表面b，卷。45，不。2，第108-111，2005。视图:出版商网站|谷歌学者
  76. K. N. Wisman, A. A. Perkins, M. D. Jeffers, and A. E. Hagerman，“细胞培养中氧化还原活性多酚生物活性的准确评估”，农业和食品化学杂志，卷。56，没有。17，pp。7831-7837，2008。视图:出版商网站|谷歌学者
  77. J.布罗尼亚尔，A.S。克拉克，Y. Ni和P. A.丹尼斯，“AKT / pbotein kinace B是组成型活性的非小细胞肺癌细胞和促进细胞存活和抗化疗和放疗，”癌症研究第61卷第1期10，第3986-3997页，2001。视图:谷歌学者
  78. a . Dutton, G. M. Reynolds, C. W. Dawson, L. S. Young, P. G. Murray，“磷脂酰肌醇3激酶的组成性激活通过涉及Akt激酶和mTOR的机制有助于霍金氏淋巴瘤细胞的存活”病理学杂志第205卷第5期4，页498-506,2005。视图:出版商网站|谷歌学者
  79. B. D. Manning和L. C. Cantley，“Akt / PKB信令：导航下游”细胞，卷。129，没有。7，pp。1261-1274,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
  80. I.Vivanco和C.L.Sakyers，“人类癌症中的磷脂酰肌醇3-激酶-AKT途径”，自然评论癌症，第2卷，第2期7，页489 - 501,2002。视图:谷歌学者

版权所有©2012 Laura Zambonin等人。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。

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