肟 氧化医学与细胞寿命 1942-0994 1942 - 0900 Hindawi出版公司 839298 10.1155 / 2012/839298 839298 研究文章 膳食酚酸在膜模型和培养细胞中发挥有效的抗氧化剂作用，在白血病细胞中显示促凋亡作用 萨伯因 劳拉 1 Caliceti 克里斯蒂亚娜 2 Vieceli Dalla世嘉 弗朗切斯科 1 Fiorentini 戴安娜 1 Hrelia 西尔瓦娜 1 兰迪 劳拉 1 普拉塔 塞西莉亚 1 ANGELONI 克里斯蒂娜 1 生物化学系G。Moruzzi” almator sudmiorum 博洛尼亚大学 通过Irnerio 48 40126年博洛尼亚 意大利 unibo.it 2 费拉拉大学和心血管研究中心 萨尔瓦多Maugeri基金会 IRCCS Via G. Mazzini 129, 25065 Lumezzane 意大利 unife.it. 2012 14 5 2012 2012 09 03 2012 03 05 2012 2012 版权所有©2012 Laura Zambonin等。 这是一篇在知识共享署名许可下发布的开放存取的文章，它允许在任何媒体上无限制地使用、传播和复制，只要原始作品被适当地引用。

咖啡酸、丁香酸和原儿茶酸都是酚酸，它们直接来自食物摄入或来自肠道代谢的多酚。在本研究中，这些化合物的抗氧化活性首先在膜模型中进行了评估，其中咖啡酸作为一种非常有效的断链抗氧化剂，而丁香酸和原儿茶酸只是脂质过氧化的缓凝剂。然而，这三种化合物在培养细胞受到低水平的H产生的外源性氧化应激时，都能很好地清除活性物种2O2．许多肿瘤细胞的特点是增加ROS水平与他们的非癌同行相比。因此，我们调查是否酚酸，在低浓度时，可媲美那些存在于人类血浆，能够降低基础的活性物质。结果表明酚酸在白血病细胞系（HEL）降低ROS，而在正常细胞中，诸如HUVEC没有观察到效果。化合物显示出无毒性对正常细胞，而他们在白血病细胞中减少的增殖，诱导细胞凋亡。在关于癌症治疗中最佳ros操纵策略的辩论中，我们在白血病细胞中的工作支持抗氧化剂ros消耗方法。

 1.介绍

在科学文献中，术语多酚也指酚酸，尽管从严格的结构角度纯粹基于化学定义，它们是单酚化合物，Quideau等人广泛声明[ 1］.将酚酸归入植物多酚家族的原因在于，它们是多酚的生物递归物，更重要的是，它们是多酚的代谢物。许多论文和综述描述了酚酸的生物利用度的研究，强调通过食物消费的直接摄入和由胃、肠和肝脏代谢产生的“真”多酚的间接生物利用度[ 2- - - - - - 8］.

当在细胞培养中测试膳食酚化合物作为模型时，必须考虑两个方面:游离形式，即苷元，很少是真正到达血液和组织的分子;使用的浓度应与循环系统中的浓度相似，即nmol/L至低mmol/L [ 6， 9］.

十几年前，我们开始研究的酚酸从多酚的肠道代谢获得，或直接从食物中，代表两大类酚酸，即，羟基和羟基苯甲酸来的抗氧化活性。我们关注的这些酚酸的抗氧化性能，在低微摩尔浓度下进行测试，在均相溶液中进行实验和膜模型开始。特别是，我们已经研究了咖啡酸（CAF），肉桂酸的带有两个羟基基团的衍生物 昊图公司SYR在3、5位有甲氧基，4位有羟基，PRO在3、4位有羟基。

CAF的直接来源有枣、浆果、水果(如杏子、苹果和猕猴桃)、香料、香草、蔬菜、饮料(如咖啡、葡萄酒)，以及少量啤酒[ 10- - - - - - 13］.SYR的主要来源是瑞士甜菜，橄榄，核桃，红枣，香料和南瓜[ 10， 14］.PRO，除了是花青素的主要代谢物之一[ 15，在可可粉、枣、菊苣、橄榄和洋葱中[ 10］.

已经研究了这些化合物，主要用于抗氧化损伤的性质，导致各种退化疾病，如心血管疾病，炎症和癌症。实际上，肿瘤细胞包括白血病细胞，通常具有比正常细胞更高水平的反应性氧物质（ROS），使得它们对氧化应激特别敏感。正常和癌细胞之间ROS水平的差异是由于在肿瘤细胞中的氧化还原平衡的失调，例如，在例如ROS的细胞内产生，或当抗氧化防御耗尽时[ 16- - - - - - 22］.活性氧在癌症中的重要性是毋庸置疑的，但科学家们仍然不清楚反应物种是如何活动的[ 23］.许多综述广泛描述了ROS在癌症中的来源、机制和参与，并阐明了细胞氧化还原调节在癌症治疗发展中的作用[ 24- - - - - - 30.］.特别是，最近王和易[ 31]以及审查了是相反proantioxidant和抗氧化剂的方法“两似是而非ROS操纵在癌症治疗中，策略”。他们提出的发展“氧化还原信令签名，”一个组合的一组参数，例如氧化还原状态，抗氧化酶的表达，细胞信号传导和转录因子活化谱在给定类型的癌细胞，将被用作索引用于选择一个硬币的两个面的：ROS升降或ROS消耗特定治疗对某些类型的癌细胞。杀死细胞的方法是诱导细胞凋亡，程序性细胞死亡。不管这个目标应该通过减少或增加达到ROS是有争议的，可能取决于每个细胞类型的“氧化还原信号签名”。这种策略的优点，那就是，诱导细胞凋亡 通过由于基础ROS水平较低，正常细胞不太容易受到氧化还原变化的影响。最近，Halliwell观察到反应性物种对癌症的多种贡献之一是它们抑制细胞凋亡的能力[ 23］.Akt是促进细胞存活的原型激酶:Akt通过直接磷酸化凋亡级联反应的关键调节蛋白来提高细胞存活[ 32］.事实上，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/ Akt途径是在许多肿瘤中组成性活性。PI3K的磷酸化激活Akt和磷酸化通过p-Akt的激活键生存蛋白质并失活促凋亡基材。这些蛋白的磷酸化降低肿瘤易感于凋亡应力。换句话说，所述PI3K / Akt途径的激活是由ROS调节细胞存活癌变过程的机制之一。

ROS的通过使用抗氧化剂的抑制减小了由在癌细胞中ROS [激活抗凋亡途径 29， 33］.尽管一些研究报告高水平的活性氧打开细胞死亡信号[ 25Akt去磷酸化导致细胞凋亡是由ROS诱导的[ 34]，许多论文证明了PI3K / AKT途径增加了氧化还原胁迫之间的联系[ 35， 36］.

我们以前的研究调查IL-3对M07E人急性髓性白血病（AML）细胞系的影响指出，该细胞因子的耐受效应由NAD（P）H氧化酶同种型NOx2-衍生的ROS产生介导，并被抑制抗氧化剂，NAD（P）H氧化酶（NOx）抑制剂或NOx2表达的特异性敲低[ 37， 38］.在不同的AML细胞系中，B1647，表达NOx2和NOX4 [ 39]，我们表明VEGF信号传导和NOx活性偶联，并且NOx和VEGF受体2的抑制剂能够在这些白血病细胞系中诱导细胞凋亡[ 40］.

从我们在模型系统中研究的抗氧化特性的经验以及ROS和抑制剂在白血病细胞增殖中的作用中，这项工作的目的是探讨膜模型和白血病细胞系中三种膳食酚醛酸的抗氧化活性，Hel，以及研究反应性物种，细胞增殖和凋亡之间的关系。

 2.材料和方法 2．1.材料

蛋黄卵磷脂（磷脂酰胆碱，PC）是由脂质产品（红山，UK）购买。不耐热的偶氮化合物的2,2'-偶氮二（2-甲基丙）二盐酸盐（AAPH），咖啡酸（CAF），丁香酸（SYR），原儿茶酸（PRO），6-羟基 - 2,5,7,8-tetramethylchromane -2-羧酸（水溶性维生素E，TRO）， α.-生育酚(Tocoph)，双氧水，2 '，7 ' -二氯二氢荧光素二醋酸(H2DCFDA，dichlorofluorescin二乙酸酯），3-（4,5-二甲基 - 噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT），台盼蓝，IGEPAL CA-630，荧光底物N-乙酰基天冬氨酸，谷氨酸-Val-ASP-7-酰氨基-4-甲基香豆素（AC-DEVD-AMC）用于胱天蛋白酶3，N-乙酰基异亮氨酸 - 谷氨酸 - 苏氨酸 - 天冬氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素（AC-IETD-AMC），用于胱天蛋白酶8，和N-乙酰基亮氨酸 - 谷氨酸 - 组氨酸 - 天冬氨酸-7-酰氨基-4-三氟甲基香豆素（AC-LEHD-AFC），用于胱天蛋白酶9，原钒酸钠，苯甲基磺酰氟（PMSF）， N氯甲基酮盐酸盐(TLCK) N-P-Tosyl-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK），蛋白酶抑制剂鸡尾酒，含有2-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液，从Sigma-Aldrich获得小鼠单克隆抗胰岛素抗体。HEL（人赤瘤血症）细胞培养来自DSMZ（Braunschweig，德国）;Huvec（人脐静脉内皮细胞）被Claudio Muscari教授，博洛尼亚大学生物化学系克劳迪奥穆斯卡里捐赠;RPMI 1640（用HEPES，带L-谷氨酰胺），胎牛血清，青霉素/链霉素，购自PAA。Atlite 1step发光套件来自PerkinElmer。硝酸纤维素膜和Amersham ECL加上Western印迹检测试剂来自Ge-Healthcare。抗胱天悬浮酶3，抗BAX，抗BCL-2和抗P-AKT抗体购自电池信号技术。从Santa Cruz生物技术获得与辣根过氧化物酶缀合的抗兔和抗小鼠IgG。PageRerer Prested蛋白梯是来自Fermentas，Thermo Fisher Scientific。所有其他化学品和溶剂都是最高的分析级。

 2.2。制备大不玻璃囊泡

在圆底管中加入适量的磷脂酰胆碱制备囊泡。用氮气流小心地去除溶剂，获得薄膜，然后加入0.6 mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)， pH 7.2，含1mm Na2EDTA是补充道。旋涡搅拌7分钟，获得的乳白色悬浮液转移到LiposoFast (Avestin, Ottawa, Canada)中，通过两个聚碳酸酯过滤器(孔径100 nm, Nucleopore Corp.， Pleasenton, CA)来回挤压21次，获得大的单瓣囊泡(LUVET)。然后调整总体积，使最终浓度为15mm PC。酚酸的乙醇溶液加入到LUVET中，最终浓度在1.3 ~ 10之间 μ.M(酸)

 ２.３.泡自然氧化

通过用克拉克型电极（黄泉仪器有限公司，哦）通过监测氧浓度来进行抗氧化剂存在或不存在抗氧化剂的自动氧化实验。在37℃的Luvet热平衡后，向悬浮液中加入适量的APH浓度，以获得17mm的最终AaPH浓度，适用于由水溶性偶氮化合物引发的Luvet过氧化[ 41.］.反应池总是被保护在室内光线下，以避免引发剂光解。

 ２.４.细胞培养

人类erythromegakaryocytic白血病细胞系(HEL)建立外周血从急性骨髓性白血病患者获得生长在RPMI补充10% (v / v) heat-inactivate胎牛血清补充与100 U /毫升青霉素和100 g / mL硫酸链霉素在37°C在湿润的气氛中保持在5%有限公司2．用不同浓度（5,10,20,50或100处理细胞  μ.M) CAF, SYR, PRO, Trolox，和 α.-生育酚，溶于乙醇或超纯水20小时。

 2.5。测量细胞内ROS

细胞( 1 × 10 6 /毫升）在PBS中洗涤两次，并用5孵育  μ.2 '，7 ' -二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2(DCFDA)在37°C下保存20分钟。H2DCFDA是一个小的非极性的，非荧光分子扩散到细胞中，在那里它被酶促通过细胞内酯酶脱乙酰极性非荧光化合物，即氧化成高度绿色荧光2'， 7 ” 二氯荧光素(DCF)。使用多孔平板阅读器(Wallac Victor)测量氧化探针的荧光2PerkinElmer)。激发波长为485 nm，发射波长为535 nm [ 42.， 43.］.

 2.6。细胞活力和增殖

通过台盼蓝排除试验评估可活细胞。MTT测定还测定细胞活力，因为四唑鎓盐的还原被广泛接受作为检查细胞活力/增殖的可靠方法[ 44.］.细胞( 2 × 10 4 )在96孔平板中加入0.5 mg/mL MTT, 37℃孵育4 h。孵育结束时，形成蓝紫色福马赞盐晶体，加入增溶液(10% SDS, 0.01 M HCl)溶解，然后在37℃，5% CO的湿化气氛中孵育过夜2)以确保完全溶解。使用多孔平板阅读器(Wallac Victor)测量570 nm处的吸光度2PerkinElmer)。此外，通过使用基于Firefly（Photinus Pyralis）荧光素酶的ATP监测系统，通过使用Atplite 1step Luminescence试剂盒来评估细胞活力。由ATP与添加的荧光素酶和D-荧光素的反应产生的发光光与所有代谢活性细胞中存在的ATP浓度成比例。根据供应商的指示，在96孔黑色透明板中，100 μ.将L的重构试剂加入每个孔中 2 × 10 4 细胞(100 μ.L），平衡在室温下。The plate was shaken for 2 minutes at 700 rpm using an orbital microplate shaker, then the luminescence was measured using a multiwell plate reader (Wallac Victor2PerkinElmer)。

 2.7。胱天蛋白酶活性分析

Ac-DEVD-AMC作为caspase 3的荧光底物，Ac-IETD-AMC作为caspase 8的荧光底物，Ac-LEHD-AFC作为caspase 9的荧光底物。不同处理后，细胞裂解液与特定底物在37°C下孵育15分钟。caspase 3和caspase 8的活性是在荧光底物水解后释放的荧光AMC;激发波长为370 nm，发射波长为455 nm。用AFC荧光法测定caspase 9活性;AFC的激发波长和发射波长分别为400和505 nm。使用Jasco FP-777荧光光谱仪进行测量。

 2.8。免疫印迹和密度分析

Western blot检测procaspase 3、cleaved caspase 3、Bax、Bcl-2、p-Akt和微管蛋白。用裂解缓冲液(1% Igepal, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 0.1 mM TLCK, 0.1 mM TPCK, 1 mM原钒酸钠和蛋白酶抑制剂鸡尾酒，pH 8.0)在冰中裂解15分钟。将样品加入含有2-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中，在95℃下保存5 min，使蛋白溶解。然后用Mini-Protean III仪器(Bio-Rad Laboratories)在10% sds -聚丙烯酰胺凝胶上分离。蛋白在100 V下电泳转移到硝化纤维素膜上60分钟。用tris缓冲盐水(TBS)/Tween (pH 8.0，含5%脱脂奶粉)在室温下孵育1小时，阻断非特异性结合。硝化棉膜与一抗在4°C孵育过夜，用TBS/Tween洗涤3次，二抗在含5%脱脂奶粉的TBS/Tween中室温孵育60 min。膜用Amersham ECL Plus Western Blotting检测试剂冲洗和显像。使用CCD成像仪(Bio-Rad Laboratories Fluor-S Max MultiImager System, Bio-Rad Laboratories)获取印迹图像，使用Bio-Rad Quantity One分析软件获取条带并进行分析。将Cleaved caspase 3免疫反应条带定量表达为各条带密度与对照条带密度的比值。 Bax and Bcl-2 immunoreactive bands were quantitated and expressed as the ratio of Bax band density to Bcl-2 band density for each sample.

 2.9。统计分析

结果用至少三个独立实验的标准偏差表示。平均值之间的差异由双尾学生确定 t或采用单因素方差分析后的纽曼-科尔斯多重比较检验。

 3.结果与讨论

起初，CAF，SYR和Pro的抗氧化活性（见图 1)的研究，模型膜的界面相互作用，分子堆积，和动力学的脂相可以设想类似于那些天然膜。

研究酚酸的化学结构。

以水溶性偶氮化合物AAPH为自由基过氧化引发剂，Trolox为参比抗氧化剂，采用小型Clark-type电极监测氧耗，进行自氧化实验。AAPH由于其亲水性，在水相中根据明确的路径以恒定的速率引发自由基链[ 45.[是理解亲水性和亲脂过氧化抑制剂对来自外部水环境的氧自由基对生物膜的侵蚀的有效工具。

在1-10的范围内以几种浓度进行抗氧化剂测试  μ.男，图 2显示在5 μ.M，在我们的实验条件下，15 mM PC单片囊泡和17 mM AAPH在37℃下的最佳抗氧化剂抑制期识别浓度[ 46.， 47.］.氧消耗的痕迹在图中报告 2在37℃和pH 7.2获得的，表明CAF表现为一种非常有效的抗氧化剂，示出两个较长的抑制时间和用于与过氧自由基比那些用相同量的Trolox的测得的反应更高的速率常数。此外，具有线性关系（ r 2 = 0.996)，在本报告的浓度范围内，CAF浓度与抑制期之间(见图中的插图) 2）.

AAPH (17 mM)诱导PC (15 mM)单片囊泡在37°C和pH 7.2条件下的过氧化过程中的摄氧痕迹，在没有抑制剂(对照)和存在一种不同的酚类抗氧化剂的情况下，每一种浓度相同(5 μ.箭头显示抗氧化注射。插图:CAF浓度之间的关系(1.3到10 μ.m）和测量的抑制期。

当SYR和PRO浓度相近时，氧耗率较对照有所降低，但抑制时间不明显。与添加相同量的CAF或Trolox时观察到的还原量相比，这种还原量要小得多(图) 2）.因此，SYR和PRO并不是有效的抗氧化剂，因为在它们的存在下没有明显的抑制时间发生。根据Pryor等人[ 48.“这种类型的化合物通常被归类为阻燃剂而不是作为抗氧化剂，”由于它们与过氧基自由基反应减缓脂质氧化的起始和繁殖步骤，但不完全停止它。

许多因素负责化合物的自由基清除活性 在体外．必须考虑到结构、热力学和动力学方面[ 47.， 49.- - - - - - 54.］.分子中的儿茶酚部分存在是最深入的研究特征之一。第二方面是环取代基的影响。例如，丙烯酸类CH = CH-CH-CHOH par关于酚醇的位置在确定肉桂酸如咖啡酸的良好抗氧化性能方面是一些相关性。相反，Protocatechuic酸的较低反应性是由于电子抽出的CoOH环取代基的存在;电子捐赠OH组具有更强的效果然后och3.抗氧化能力。另一个较少被考虑的特征是 p K 一个 这确实导致抗氧化活性对测试化合物的缓冲溶液的pH值有很强的依赖性。最后，但不是全部，有必要考虑分子的不同亲水性，导致抑制剂在水和脂相之间的不同分配。

因此，我们评估了CAF，SYR和PRO在低于外源性H的低致病水平产生的氧化应激后降低细胞内ROS含量的能力2O2在人造血细胞系HER（人灌水血症）和初级培养的HUVEC（人脐静脉内皮细胞）中。

HUVEC和造血细胞(如HEL)有一个共同的祖细胞，称为成血管细胞，这是一种多能细胞，能够分化为内皮细胞和造血细胞。尽管许多细胞途径仍不清楚，但近百岁的血管成细胞假说现在已被证实[ 55.，因为已经检测到一些细胞事件和通路。此外，血管生成和癌症发展之间的严格关系已被广泛证实:VEGF及其受体参与促进固体和液体肿瘤的生长和增殖[ 56.- - - - - - 61.］.因此，HUVEC是“正常”细胞，经常被选择与肿瘤细胞进行比较[ 62.， 63.特别是本研究中的HEL细胞系。

用细胞渗透探针H测定ROS水平2DCFDA，由于细胞内转化为高度绿色荧光的DCF，通常用于检测细胞中自由基/ROS的产生[ 64.］.一般来说，二氢荧光素不能区分各种活性氧/氮物种，但它仍然是细胞氧化应激最直接和通用的指标。

如图所示 3.，预先孵育20小时的酚酸，表现为良好的抗氧化剂，因为它们能够在30分钟阐述至50后降低ROS水平  μ.M.2O2在两个细胞系统中;这一减少可与由 α.-生育酚，最有效的脂溶性抗氧化营养素，并通过其水溶性类似物，Trolox。

酚类化合物在50℃氧化应激下HEL细胞和HUVEC中的抗氧化作用 μ.M.2O2．细胞与不同的化合物(5或10 μ.M为HEL细胞，(a);10 μ.M治疗HUVEC， (b)) 20小时，H治疗2O230分钟，然后通过H测量ROS水平2DCFDA测定方法如本节所述 2．结果用三个独立实验的平均值±SD表示，每个实验都是8个重复。 P ＊ ＊ < ０．００５ ，与对照细胞显着不同; P ＊ ＊ ＊ < 0.0005 ，与控制单元明显不同。

与非肿瘤细胞相比，许多肿瘤细胞的特征是ROS生成增加。检测HEL细胞的基础细胞内ROS水平，并与HUVEC细胞内ROS水平进行比较。数字 4证实了癌细胞表现出组成型高水平的ROS的，显示出在HEL细胞ROS含量为约8倍高于正常细胞，HUVEC的概念。

HEL细胞和HUVEC中基底ROS水平的比较。通过H测量ROS水平2DCFDA测定方法如本节所述 2．结果用三个独立实验的平均值±SD表示，每个实验都是8个重复。显著性差异 P ＊ ＊ ＊ < 0.0001 ．

随后，我们研究了低浓度的酚酸是否可能与人血浆中存在的酚酸相媲美[ 12， 65.- - - - - - 67.]，能够降低基础反应性物种。图中报告的图表 5结果表明，在HEL细胞中，治疗20小时后下降约20%，而在HUVEC中，即使在更高的浓度下也没有观察到这种效果。

酚类化合物对HEL细胞和HUVEC基础ROS水平的影响。用不同的化合物(5或10 μ.M为HEL细胞，(a);20 μ.M表示HUVEC，（B））为20小时，然后ROS水平的H来测量2DCFDA测定方法如本节所述 2．结果表示为四个独立实验的平均值±SD，各自在偶数术中进行。 P ＊ ＊ < ０．００５ ，与对照细胞显着不同; P ＊ ＊ ＊ < 0.0005 ，与控制单元明显不同。

体大的文献报道，ROS可促进细胞增殖，并有助于癌症的发展。在过去的十年中，我们证明了ROS在两个不同（赤）巨核细胞白血病细胞系，类似于HEL对细胞生存所必需的;NOX家族是ROS（的Nox4和/或NOX2）的主要来源;ROS产生可以作为保护白血病细胞凋亡促存活因子起作用，抵消效果通过抗氧化剂[ 37- - - - - - 40， 68.- - - - - - 72.］.

为了验证ROS在肿瘤细胞增殖中的作用，我们检查了CAF，SYR和Pro对细胞活力的影响，由台盼蓝排除试验和MTT测定评估（图 6），并将其与Trolex相比 α.生育酚的效果。所有抗氧化剂都轻微地降低了白血病细胞的活力/增殖(图) 6(一)和 6 (b))，而即使在较高浓度下，它们也不影响HUVEC的生存能力(图 6 (c)）.

酚类化合物对细胞活力/增殖的影响。用不同的化合物(5到100种)处理细胞 μ.M为HEL细胞，(a)、(b)和(d);20. μ.M为HUVEC， (c)) 20小时。(a):采用台盼蓝排除试验评估生存能力。(b)和(c):用MTT法评估增殖能力，如第一部分所述 2．结果用三个独立实验的平均值±SD表示，每个实验重复四次。 P ＊ < ０．０５ ，与对照细胞显着不同; P ＊ ＊ < 0．01 ，与对照细胞显着不同; P ＊ ＊ ＊ < ０．００１ ，与控制单元明显不同。(d): 10、50或100处理20小时后HEL细胞的活力 μ.M化合物，由Atplite 1Step发光试剂盒测定，如截面所述 2．结果用三个独立实验的平均值±SD表示，每个实验重复3次。所有值与控制( P ＊ ＊ ＊ < ０．００１ ）.

排除MTT测定中的人为因素或干扰[ 73.- - - - - - 76.，但未检测到对四唑盐的直接反应 在体外中，我们通过在HEL细胞测量细胞内ATP水平，也以更高的酚酸浓度执行的处理互补存活力实验。测量报告图 6 (d)验证了其他方法的结果。

考虑到缺少对HUVEC生存能力测试的化合物的效果，进行了进一步的研究以表征白血病HEL细胞诱导酚酸的细胞死亡，着眼于典型的细胞凋亡的特征。半胱氨酸蛋白酶在调节各种细胞凋亡反应中发挥核心作用，并在分裂的连续级联被激活。效应胱天蛋白酶的活化，例如胱天蛋白酶3，由引发剂胱天蛋白酶，例如特定的内部天冬氨酸残基后的胱天蛋白酶8和9，通过蛋白水解裂解执行，以分离成熟Caspase的大，小亚单位。为了检测胱天蛋白酶的酶活性，三个荧光底物被使用：AC-DEVD-AMC被用作底物胱天蛋白酶3;的Ac-IETD-AMC用于胱天蛋白酶8;的Ac-LEHD-AFC为胱天蛋白酶9 HEL细胞与抗氧化剂的治疗刺激以剂量依赖性方式所有测试胱天蛋白酶的活性，如图 7，报告了AMC或AFC的荧光。

酚类化合物处理后HEL细胞Caspase活性的变化。HEL细胞用不同的化合物(5、10、50或100)孵育 μ.m）20小时，然后在37℃下在37℃下用三种不同的基材温育15分钟，即Ac-Devd-AMC作为Caspase 3（A）的特异性荧光基底，用于Caspase 8的AC-IETD-AMC（b），和Caspase 9（c）的AC-Lehd-AFC，如截面所述 2．结果表示为四种独立实验的平均值±SD，各自一式三份进行。 P ＊ < ０．０５ ，与对照细胞显着不同; P ＊ ＊ < 0．01 ，与对照细胞显着不同; P ＊ ＊ ＊ < ０．００１ ，与控制单元明显不同。

随后，我们研究了酚类化合物在HEL细胞中的促凋亡作用，通过SDS-PAGE和Western blot检测细胞裂解液中caspase 3、Bax和Bcl-2蛋白(图) 8）.上切割的胱天蛋白酶3 Western印迹结果吻合良好通过荧光测定得到的结果，如示于图的密度计分析 8（C）。此外，酚醛酸能够提高促凋亡凋亡的表达;在音乐会中，产生了抗衰性BCL-2的减少。Bax和Bcl-2是患有相反的凋亡的蛋白质;因此，BAX / BCL-2比是凋亡的有用指标。孵育20小时后抗氧化剂化合物导致这种比例的剂量依赖性增加（图 8(d))。

酚类化合物对细胞凋亡的影响。HEL细胞用不同的化合物(5、10、50或100)孵育 μ.m）20小时，然后将细胞裂解物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹，与所示的抗体如截面所述 2．微管蛋白的检测被用作对照。代表性免疫印迹显示。（A）：抗胱天蛋白酶3;（B）：抗Bax和抗Bcl-2;（E）：抗p-Akt的。(c)：Densitometric analysis of three independent Western blot assays for cleaved caspase 3 (17 kDa fragment). (d): Bax/Bcl-2 ratio from densitometric analysis of three independent experiments. P ＊ < ０．０５ ，与对照细胞显着不同; P ＊ ＊ < 0．01 ，与对照细胞显着不同; P ＊ ＊ ＊ < ０．００１ ，与控制单元明显不同。

在哺乳动物中，最有效的抗凋亡存活途径之一是PI3K/Akt [ 77.， 78.］.活化的Akt是PI3K调控的促生存信号的主要中介[ 79.］.AKT（p-AKT）的活性脑鞘化形式通过磷酸化下游分子促进细胞增殖和存活，该分子调节细胞周期和细胞凋亡[ 80］.数字 8(e)表明，研究中的酚类分子处理轻微降低了Akt的磷酸化水平，再次证实了它们的促凋亡作用。

 4.结论

在这项研究中，我们评估了一些酚酸的抗氧化活性，这些酚酸来源于食物的直接吸收和肠道微生物对类黄酮的裂解。这些化合物作为断链抗氧化剂，在膜模型中具有不同的效果，并能够对比白血病和正常细胞中由于外源性氧化应激而引起的细胞内ROS的升高。此外，我们观察到酚酸能够清除HEL细胞中的活性氧，其特点是细胞内ROS水平非常高。它们对正常细胞没有毒性，而在白血病细胞中却减少增殖，诱导细胞凋亡。事实上，它们提高了caspase 3、8和9的活性，增加了凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的比例，并降低了Akt的激活。

在关于癌症治疗中最佳ros操纵策略的辩论中，我们在白血病细胞中的工作支持抗氧化剂ros消耗方法。

 缩写 CAF：

咖啡酸

 湖浆:

Syringic酸

 亲：

原儿茶酸

 特拉：

Trolox

 Tocoph：

α.生育酚

 ROS：

活性氧

 AML：

急性髓系白血病

 氮:

NAD (P) H氧化酶

 VEGF:

血管内皮细胞生长因子

 AAPH:

2， 2 ” -azobis（2-甲基丙胺脒）二盐酸盐

 PC:

磷脂酰胆碱

 帮助:

人红细胞巨核细胞白血病细胞系

 H 2 DCFDA ：

2》, 7 ” -二氯二氢荧光素二乙酸酯(也称二氯荧光素二乙酸酯)

 DCF：

二氯荧光素

 麻省理工:

3-（4,5-二甲基 - 噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四

 HUVEC:

人脐静脉内皮细胞

 Ac-DEVD-AMC:

n -乙酰Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-methylcoumarin

 Ac-IETD-AMC:

N-Acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp-7-amido-4-methylcoumarin

 Ac-LEHD-AFC:

N-Acetyl-Leu-Glu-His-Asp-7-amido-4-trifluoromethylcoumarin

 AMC：

7-酰氨基-4-甲基香豆素

 亚:

7-amido-4-trifluoromethylcoumarin。

 作者的贡献

L. Zambonin和C. Caliceti对这项工作做出了同样的贡献。

 致谢

作者非常感谢Chiara Gamberini博士和Francesca Bonafè博士为本研究提供了培养的HUVEC，并感谢Gabriele Hakim教授提供科学建议和指导。他们感谢意大利博洛尼亚大学国际生物技术中心(Centro interpartimentale di Ricerche biotechnology iche)使用Bio-Rad fluo - s Max多成像系统。这项工作得到了MIUR和意大利博洛尼亚拉文纳蒙特基金会的资助。资助方在研究设计、数据收集和分析、决定发表或手稿准备方面没有作用。

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