黄酮类化合物的作用及机理研究黄芪毛蕊异黄酮对人红白血病细胞的作用

摘要

黄酮类化合物存在于植物的大部分部位，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒和免疫刺激等多种生物活性。现有数据表明，黄酮类化合物黄芪（TFA）可以提供具有抗伤性耐受性的生物系统，可具有抗毒性，动脉粥样硬化抑制和其他生物学效应。本研究通过一系列技术研究了TFA和Calycosin（从TFA分离的化合物）的影响，在人赤孔血症细胞系K562的凋亡诱导和细胞周期中，包括增殖（MTT），PI染色，膜蛋白V / PI双倍染色和RT-PCR。实验数据表明，TFA和Calycosin可以抑制K562细胞的增殖。TFA和钙霉素的50％抑制浓度为98.63 μ.克/ mL和130.32 μ.分别g / mL。而黄芪多糖和毛茛菪碱均不能诱导K562细胞凋亡，但能增加细胞数量_0./ G₁阶段。三聚氰胺和毛莨素处理后K562细胞细胞周期蛋白D1 mRNA水平下降。本研究为黄酮类化合物的作用机制提供了新的认识黄芪毛蕊异黄酮对人红白血病细胞的作用。

1.介绍

白血病是一种恶性肿瘤，造成严重伤害人类健康，特别是因为它在儿童中的患病率[1-3.]．正在探索的一种治疗方法是使用黄酮类化合物黄芪（TFA）。TFA从蒙古提取黄芪是清除自由基的主要活性抗氧化成分[4.]．一系列研究表明，TFA具有生物系统抗损伤能力，具有抗诱变、抗肿瘤、抑制动脉粥样硬化等生物学作用[4.-9.]．此外，毛蕊是从TFA中分离的主要化学成分之一，它是不明确是否毛蕊能够发挥抑制对肿瘤细胞或不影响，因为已经对机制毛蕊的抗癌活性的报道。为了提供TFA和毛蕊是如何影响生物系统中的一些机械理解，我们在体外实验中开展研究TFA和毛蕊异黄酮的抗肿瘤活性。我们使用K562红白血病细胞系作为目标生物系统研究对肿瘤细胞的作用和TFA的机制和毛蕊。MTT法，我们可以检测到不同浓度的TFA对K562细胞的作用和毛蕊并研究其对K562细胞凋亡，细胞周期的影响，和cyclin D1 mRNA水平。这项研究提供了新的见解TFA的作用机制和毛蕊对人红白血病细胞。

2.材料和方法

2．1.试剂

TFA和毛蕊分离，并通过生物化学在中国解放军医院厅认定。他们被高压灭菌过程灭菌，溶于DMSO的适当量，并用培养基到所需的浓度稀释。MTT细胞增殖和细胞毒性测定试剂盒，膜联蛋白V-FITC和细胞周期试剂盒购自所述注册机生物科技发展获得。RPMI1640培养基和胎牛血清购自GIBCO公司。RT-PCR提取试剂盒和BioEasy的SYBR Green I实时PCR试剂盒手册，从北京尚佰公司。从生物工程获得核糖核酸酶抑制剂，和M-MLV逆转录酶购自Promega生物技术购买。

2.2。仪器

本研究使用以下实验装置：CO₂细胞恒温培养箱(三洋)、倒置显微镜(奥林巴斯)、Multiskan MK3酶标仪(Thermo Lab)、洁净台(北京东厅仪器)、流式细胞仪(美国Backman Kurt)、线基因荧光定量PCR检测系统(杭州日科)、HH。W21-Cr恒温水箱(北京长安科学仪器)，MS1/MS2微型振荡器(广州仪器牙科技术)。

2.3。细胞系和细胞培养

人红白血病细胞K562(来自中国人民解放军总医院血液学实验室)在37°C, 5% CO下培养₂培养箱用RPMI1640培养液，其含有10％胎牛血清。将培养液每2-3天更换。实验开始时，细胞呈对数增长。

２.４.三聚氰胺和毛蕊异黄酮对K562细胞增殖的影响

将K562细胞接种在96孔板上每孔10个细胞在相同培养基中加入不同浓度的TFA和毛蕊异黄酮。四种TFA样品的最终浓度分别为20、50、100和200μ.克/毫升，分别和毛蕊样本集的最后五分浓度为20，50，100，200和400 μ.分别g / mL。每个浓度有6个重复井和一个空白对照井，只有100个的RPMI1640培养基中。Testing samples in the plate were cultured in an incubator and after 24 h, 20 μ.大号MTT加入每个孔中。另外的4小时温育在37℃，5％CO后₂，吸气中上清液，和150 μ.加入L DMSO并适当混合终止反应。测量450nm波长处的光密度(OD)值，计算癌细胞生长抑制率。细胞生长抑制的计算公式如下:

中位抑制浓度(IC50)的计算方法以对数剂量图上的细胞存活率为基础。

2．5．Annexin V-FITC双染色法评价芪甲苷和毛莨素对K562细胞凋亡的影响

在对数生长阶段的K562细胞接种在25ml培养瓶中，1×10^7./ L细胞密度。对于TFA和钙霉素基团和对照组（无药物），收集细胞并培养2,4,6,12和24小时。选择TFA和Calycosin的浓度是中值抑制浓度。通过流式细胞术测量细胞并分析标记膜蛋白V和PI的凋亡人口柱。

2.6。通过流式细胞术评估TFA和Calycosin对K562细胞周期的影响

in5厘米内的细胞²文化瓶;加入TFA和毛蕊异黄酮的IC50浓度。培养24小时后，PBS洗2次，2000 rpm/min离心5分钟。用PBS将细胞吹至完全悬浮后，用体积70%乙醇4℃固定48 h，洗去乙醇后PBS染色，2000 rpm/min离心5 min，洗2次;增加100μ.L RNase A and maintain in 37°C water bath for 30 min, and then add 400 μ.L PI染色，4°C避光30min。采用流式细胞术对细胞进行评价，评价细胞周期的变化。按PI% = (S + G)公式计算细胞增殖指数₂/ M) / (G_0./ G₁+ s + g₂/ m）。

2.7。RT-PCR检测黄芪多糖和毛蕊异黄酮对细胞周期蛋白D1 mRNA水平的影响

上游和下引物是5-CCTCG GTGTCCTA CTTCAAAT-3和TCTGTTCCT-3，分别为5-TCCTCGCACT。in/L细胞直径25 cm²文化的瓶子。添加不同浓度的TFA和毛蕊异黄酮，最终TFA浓度分别为50和100μ.g/mL，设空白对照孔，37℃，5% CO孵育₂培养48小时。在液氮中，每50-100 mg细胞质量加1 mg裂化液RL。用匀浆仪匀浆细胞。样品体积不应超过裂解液RL体积的1/10。应用RT-PCR技术检测K562细胞cyclin D1 mRNA水平。

2.8。统计处理

实验数据用并采用单因素方差分析进行分析- 试验采用SPSS13.0统计分析软件。使用概率单位法（概率单位）测定半数抑制浓度（IC 50），以及使用两样本细胞周期-测试方法。

3.结果

3.1。抑制TFA和钙霉素对K562细胞增殖的抑制作用

数据显示，TFA和钙霉素均对24,48和72小时的治疗后对K562细胞的增殖产生显着影响（表格1和2）．TFA和Calycosin显示出剂量依赖性抑制K562细胞增殖。在治疗24,48和72小时后K562细胞TFA上的TFA的中值抑制浓度（IC50）为98.63,87.90和63.10 μ.分别g / mL。毛蕊异黄酮对K562细胞作用24、48和72 h的半数抑制浓度(IC50)分别为130.32、123.03和122.18μ.分别g / mL。

3.2。TFA和Calycosin对K562细胞凋亡的影响

关于凋亡和坏死细胞的流式细胞仪的实验结果的评价，​​在K562细胞凋亡无明显变化用TFA后（100 μ.g/mL)，静置2、4、6、12、24 h。用钙霉治疗后K562细胞凋亡的明显变化（1300 μ.g/mL)，静置2、4、6、12、24 h。

3.3。TFA和Calycosin对K562细胞细胞周期的影响

TFA(50和100μ.g/mL)和毛蕊异黄酮(在60和130μ.g/mL)能明显阻断K562细胞生长周期_0./ G₁与对照组相比。在G的期细胞_0./ G₁显着增加，在S显着降低的阶段中的细胞（表3.和4.）．

3．4．TFA和毛蕊异黄酮对K562细胞Cyclin D1 mRNA水平的影响

细胞周期蛋白D1 mRNA水平为3.58±0.63对照样品。细胞周期蛋白D1 mRNA水平为50至100 μ.g/mL TFA处理后的样品分别为2.23±0.42和1.72±0.21。同样，对照组细胞周期蛋白D1 mRNA水平为3.31±0.71，对照组细胞周期蛋白D1 mRNA水平为50和100μ.g/mL毛蕊异黄酮处理的样品分别为2.27±0.33和2.02±0.25。TFA和毛莨素均可显著降低K562细胞Cyclin D1 mRNA水平。

4.讨论

白血病是造血系统的恶性肿瘤之一。它在癌症总发病率中占5%，死亡率很高。K562是取自人类慢性粒细胞性白血病的红白血病细胞系。到目前为止，化疗仍是治疗白血病最重要、最基本的方法[10.那11.]．中药（TCM）也在治疗白血病方面取得了积极的成就[12.-14.]．许多草药具有明显的疗效[15.-18.]．

邦吉是一种历史悠久、临床应用广泛的中草药。TFA是被分离出来的活性成分黄芪具有清除过氧自由基能力的[4.]．研究表明，TFA具有反伤害和抗偏差活动[4.那5.那7.那8.]．此外，TFA对人类肝细胞癌BEL-7402细胞具有显着的抑制作用[6.]．

因为在DNA含量的差异，细胞周期被划分成离散的阶段：ģ_0./ G₁S和G₂/ M。根据实验结果，利用软件计算了所研究细胞在各相中的分布百分比。已知S期肿瘤细胞高于正常细胞[19.]，因此我们也观察到了大量的细胞是在S期与活性DNA的合成。实验结果进一步显示TFA导致在G细胞_0./ G₁，特别是G细胞₁期增加，S期细胞明显减少，说明K562细胞增殖活性减弱。

细胞周期蛋白D是细胞外生长信号的传感器。生长因子的存在导致cyclin d的持续表达_0.和G.₁并参与G的控制₁通过与周期蛋白依赖性激酶4 (CDK4)和6 (CDK6)结合，导致细胞进入S期增殖。cyclin D1或CDK4/CDK6的不可控表达可诱导细胞周期失调。研究表明，许多肿瘤都存在cyclin D1过表达，如套细胞淋巴瘤(CML)、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、头颈癌、食管癌等[20.那21.]．

细胞周期蛋白D1也是细胞周期的重要调节蛋白。细胞周期蛋白D1的水平和活性在不同时期均达到峰值，呈规律性波动。在G_0.，细胞受到细胞外有丝分裂原的刺激，随后在G的早期表达cyclin D1₁。Cyclin D1参与G的控制₁通过结合CDK4/CDK6。Cyclin D1-CDK4复合物通过其n端LXCXE阵列使视网膜母细胞瘤(RB)磷酸化。在CDK4/6磷酸化RB后，RB从E2F-DP1异源二聚体中分离出来，导致其对DNA合成的抑制作用失活，随后细胞从G阶段进入S阶段₁［22.]．很少有关于在国内或国外的细胞周期蛋白D1对白血病的影响。在这项研究中，我们发现TFA和Calycosin可以尤利地降低细胞周期蛋白D1的表达，这可能与TFA和钙霉素抑制K562繁殖并保留G中的细胞_0./ G₁阶段。

综上所述，三聚氰胺和毛蕊异黄酮对K562细胞的增殖有抑制作用。他们也被认为是在G_0./ G₁细胞周期蛋白D1 mRNA水平的降低。

致谢

基金资助:国家自然科学基金资助项目(no。30572349)。感谢中国人民解放军总医院输血科的所有同仁。

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