免疫调节的作用罗勒属gratissimum和抗坏血酸Nicotine-Induced小鼠腹腔巨噬细胞在体外

文摘

本研究的目的是评价免疫功能和免疫反应nicotine-induced(10毫米)巨噬细胞,同时建立水提物的免疫调节作用罗勒属gratissimum(Ae-Og)和抗坏血酸。在这项研究中,亚硝酸盐代和一些由巨噬细胞表型功能进行了研究。旁边,释放Th1细胞因子(TNF -α、il - 12)和Th2细胞因子(il - 10, TGF -β由ELISA)测定,这些细胞因子的表达在mRNA水平被实时PCR分析。Ae-Og,剂量的10μg / mL,显著降低nicotine-induced没有生成和iNOSII表达式。类似的反应观察抗坏血酸(0.01毫米)的补充。Ae-Og管理,抗坏血酸增加依从性下降,趋化性,在nicotine-treated巨噬细胞的吞噬作用,细胞内的细菌杀死。Ae-Og和抗坏血酸被发现保护小鼠腹腔巨噬细胞的差别通过对这些Th1细胞因子与并发nicotine-treated巨噬细胞激活Th2反应。这些发现强烈增强我们对分子机制的理解导致nicotine-induced抑制免疫功能和抗炎治疗方法的应用程序提供额外的理由o . gratissimum和抗坏血酸对不同炎性疾病预防和治疗期间尼古丁的毒性。

1。介绍

草药要求方法治疗几个公共卫生条件不足。在我们先前的实验报告,水提物和甲醇提取的罗勒属gratissimum林保护身上观察到尼古丁诱导下小鼠巨噬细胞的细胞损伤(1,2]。但是,水提物的免疫调节作用o . gratissimum在小鼠巨噬细胞对尼古丁毒性尚未开悟。o . gratissimum是一个重要的草药,俗称“Ram Tulshi”在印度。这种植物属于“Labiaceae“植物的家庭成员。民间医药治疗中使用的植物是不同的常见疾病如感冒和流感(3,4]。的新鲜果汁o . gratissimum叶被用作防腐剂。抗癌的,它与chemopreventive有关自由基清除,无线电保护,和许多其他药物使用[5]。水叶提取物和籽油抗增殖和chemopreventive活动在海拉细胞6]。

抗坏血酸(AA)用作医学实践有益的共同之处。AA在对抗氧化损伤起着重要的作用,由于其功能作为还原剂(7]。此外,抗坏血酸参与调制的复杂的生化途径免疫细胞的正常代谢的重要组成部分[8]。机械的研究表明,抗坏血酸可以调节免疫系统通过抑制FAS-induced单核细胞凋亡(9]。抗坏血酸提高了人类的免疫反应增强了反对A-induced人外周血(扩散10),中性粒细胞的趋化作用11),和单核白细胞的吞噬作用12]。据报道,抗坏血酸上调IgM抗体反应在spleenocytes cytokine-dependent方式(13]。的在体外函数的内毒素的触觉调制了巨噬细胞和淋巴细胞抗坏血酸(14,15]。它也抑制了免疫生物途径和产生抗炎活动如果和mitogen-stimulated外周血单核细胞在体外(16]。在当前的研究中,常等人报道,高剂量的AA补充可能会减弱过敏性炎症在活的有机体内通过调节Th1 / Th2平衡向Th1杆在Th2-skewed过敏性气道炎症,减少嗜酸性渗透进BALF [17]。因此,使用抗坏血酸(作为参考药物)来保护尼古丁的不利影响在小鼠腹腔巨噬细胞可以治疗方法。

炎症系统保持平衡通过互惠的主要促炎细胞因子的生产,包括肿瘤坏死因子-α(TNF -α1)T辅助(Th1)细胞,主要是抗炎细胞因子,包括白介素10 (il - 10)(主要)辅助T 2 (Th2)细胞18,19]。这种平衡的pro -抗炎细胞因子被描述为一个Th1 / Th2型反应比其他地方(20.,21]。巨噬细胞抗原呈递细胞和吞噬细胞和产生的影响,例如,生产的细胞因子白介素、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ(22]。通过分泌il - 12,他们调节向Th1-profile Th1 / Th2细胞因子的平衡。此外,巨噬细胞分泌的细胞因子可能会引发自由基的生产(23]。Th1细胞主要分泌TNF -α主要和il - 12,而Th2细胞释放il - 10。还有Th3细胞,产生TGF -β,作为监管者的效应T细胞(24]。

尼古丁,香烟烟雾的主要有毒产品和其他烟草产品,已经涉及到自由基介导的氧化损伤的发展在小鼠腹腔巨噬细胞,淋巴细胞,和白鼠组织(25- - - - - -28]。烟,尼古丁暴露于人类健康的主要来源,是全球主要的健康风险因素,一些疾病的发病率明显增加。在自然界中许多这些疾病的炎症或有炎症组件。尼古丁会抑制免疫系统的各种参数。Downregulation尼古丁释放il - 10和mRNA表达的已经观察到实验用小鼠肺泡巨噬细胞细胞系(29日),il - 6、TNF -α,干扰素γ发布在LPS-induced鼠spleenocyte [30.]。

在本研究,我们假设nicotine-induced细胞功能的改变和Th1 / Th2细胞因子在小鼠巨噬细胞可能通过改善生产管理o . gratissimum产品。据我们所知,没有全面的研究可以在这个特定的问题。因此,我们有接近的抗炎/有益的作用o . gratissimum和抗坏血酸还原巨噬细胞功能和Th1 / Th2细胞因子的平衡。

2。结果

2.1。亚硝酸盐生成由巨噬细胞

我们已经研究了身上观察到尼古丁诱导下存在的小鼠腹腔巨噬细胞的亚硝酸盐生成Ae-Og格里斯试剂(图/抗坏血酸1(一))。没有一代明显()的nicotine-treated巨噬细胞增加了2.81倍控制巨噬细胞相比,它也显著()由Ae-Og共同改善,抗坏血酸和尼古丁。确认没有释放,我们还研究了iNOSII表达式在mRNA水平治疗后的日程安排。我们发现iNOSII表达式在mRNA水平显著()增加了3.02倍nicotine-treated细胞,补充Ae-Og和抗坏血酸能显著降低iNOSII表达式()nicotine-treated组相比,这些都是向控制水平(数字1 (b)和1 (c))。因此,Ae-Og,一种天然的植物产品,可以减少亚硝酸盐生成类似于nicotine-treated小鼠腹腔巨噬细胞抗坏血酸。

2.2。巨噬细胞功能的研究由于尼古丁,Ae-Og,抗坏血酸治疗

15岁腹膜巨噬细胞的细胞功能,治疗后30、60、90分钟计划如图2。依从性指标(图2(一个)(图),趋药性的索引2 (b)(图),吞噬索引2 (c))增加巨噬细胞的所有组时间时尚。这些索引减少nicotine-treated组显示显著差异()在每个时间间隔对腹膜巨噬细胞的对照组。但是,这些显著增加()补充Ae-Og和抗坏血酸而只有nicotine-treated组在每个时间间隔。的细胞内死亡金黄色葡萄球菌由治疗和治疗腹膜巨噬细胞在不同时间点估计来确定细胞内杀死巨噬细胞(图的属性2 (d))。可行的百分比金黄色葡萄球菌最初的时候是100年,随时间增加而降低在所有类型的治疗。细菌的生存能力是减少在15分钟的时间点,但是从30分钟增加到终点的研究区间比正常的巨噬细胞。可行的细菌的比例正常,逐渐减少尼古丁+ Ae-Og,尼古丁+抗坏血酸洗组在每个时间点的间隔进行了研究。

2.3。尼古丁的影响、Ae-Og和抗坏血酸对细胞因子的生产

完善,尼古丁是炎症的药物,调节免疫功能。因此,我们打算研究Ae-Og和抗坏血酸治疗是否可以调节促炎细胞因子(TNF -α和il - 12)和抗炎细胞因子(TGF -βil - 10)的释放和表达对小鼠腹腔巨噬细胞在mRNA水平。我们观察到治疗尼古丁在巨噬细胞显著增加释放肿瘤坏死因子-α和IL-12p70与控制细胞相比,显著降低Ae-Og和抗坏血酸(数据的补充3(一)和3(b))。肿瘤坏死因子-的显著增加α释放可能发挥关键作用的触发信号增强的一代。另一方面,释放TGF -β抗炎细胞因子il - 10,签名,显著降低尼古丁的治疗。共同服用Ae-Og和抗坏血酸的尼古丁(数字3(c)和3(d))显著增加这两个抗炎细胞因子的释放。确认我们的定量数据,所观察到的ELISA方法,我们进一步研究了mRNA的表达上述细胞因子治疗后安排使用实时PCR分析。结果表明,肿瘤坏死因子-的显著增加α(数据3(e)和3(f))和IL-12p40(数字3(e)和3(g))表达式nicotine-treated巨噬细胞与巨噬细胞的控制。巨噬细胞治疗尼古丁结合Ae-Og /抗坏血酸明显下降TNF的表达水平αIL-12p40,相比之下,nicotine-treated巨噬细胞。另一方面,在nicotine-treated巨噬细胞,有明显降低的TGF -β(数据3(e)和3(h))和il - 10(数字3(e)和3(我))与控制相比,巨噬细胞在mRNA水平。当巨噬细胞治疗尼古丁连同Ae-Og /抗坏血酸,TGF -的表达β和il - 10与nicotine-treated巨噬细胞相比显著增加。这是Th1、Th2细胞因子之间的平衡,决定了不同的免疫疾病的易感性31日]。我们目前的研究结果表明,nicotine-treated巨噬细胞诱导Th1细胞因子和抑制Th2细胞因子,在nicotine-treated Ae-Og和抗坏血酸治疗后巨噬细胞,抑制Th1细胞因子和增强Th2细胞因子,从而防止免疫紊乱的脆弱性。

3所示。讨论

生物活性天然产物的使用是获得越来越多的流行日复一日在传统医学作为一个引人注目的替代治疗各种疾病。o . gratissimum已经从古老的药用的年龄,,最近我们发现了大量的有益的角色身上观察到尼古丁诱导下小鼠腹腔巨噬细胞的毒性(1,6,32,33]。在本研究中,我们已经证明了在体外治疗o . gratissimum产品(Ae-Og)显著降低身上观察到尼古丁诱导下小鼠腹腔巨噬细胞的亚硝酸盐生成(图1(一))。

腹膜巨噬细胞在免疫反应中起着关键作用的宿主炎症和感染过程。在目前的研究中,我们检验的一些细胞活动巨噬细胞细胞粘附、趋化迁移、吞噬作用,细胞内杀死化验,促炎和抗炎细胞因子释放证明Ae-Og的防护措施和抗坏血酸对nicotine-induced调制的细胞活动。由炎症细胞吞噬作用是一个重要的步骤和抵御外来病原体的先天免疫和微生物或删除死细胞。吞噬细胞的吞噬作用的第一步涉及坚持组织基质在这些细胞迁移的炎症。这需要巨噬细胞识别和奉行足够强烈,他们不是被流动的血液。在体外细胞粘附试验可能反映了在活的有机体内细胞粘附能力。巨噬细胞的粘附显示显著减少尼古丁中毒(图后时间的方式2(一个))。nicotine-exposed细胞的趋化指数显著降低(图2 (b))。因此它可以表明尼古丁中毒可能以某种方式改变形状和功能活性的巨噬细胞,使他们迁移以较慢的速度向趋化剂(fMLP)。吞噬作用是一个重要的决定因素的免疫细胞的功能。虽然,自由基生成被发现在更高层次身上观察到尼古丁诱导下浓度和时间的小鼠腹腔巨噬细胞的方式(25,26),在本研究中,我们发现,吞噬指数和细胞内的细菌杀死nicotine-treated细胞与对照组相比显著减少(数字2 (c)和2 (d))。支持我们的结果,许多研究人员报道了肺泡巨噬细胞吞噬和杀菌活性的降低吸烟者(34- - - - - -36]。除此之外,在我们目前的研究中,这些表型功能(粘附能力,趋化现象的属性,吞噬作用,和细胞内死亡)显著增加在时间依赖方式由于Ae-Og补充和抗坏血酸(图2)。这可能是由于这种生物活性的作用原理o . gratissimum和抗坏血酸保护小鼠腹腔巨噬细胞从尼古丁和有害的效应,同时,有助于恢复正常功能。所以,天然产品(Ae-Og)和强有力的抗氧化剂,抗坏血酸,可以用作免疫调制器药物在当前的未来。

我们发现尼古丁增加促炎细胞因子的分泌和iNOSII小鼠巨噬细胞中表达。这部小说发现尼古丁增加促炎细胞因子反应巨噬细胞可以解释nicotine-augmented免疫障碍的分子机制在体外模型。尼古丁可能直接诱发iNOSII和TNF -α通过烟碱乙酰胆碱受体表达在巨噬细胞。反过来,激活巨噬细胞,渗入病变后,可能激活NF -κB在巨噬细胞分泌促炎细胞因子和转录因子生成氧化应激(37]。同时增加自由基促进不同免疫疾病的进展。没有免疫介导性疾病的作用是有争议的38- - - - - -40]。自由基不直接介导组织破坏(38,41),和其他发现更多的调节作用没有炎症。此外,有人建议,没有调节的Th1 / Th2平衡有利于Th1反应(39,40]。在这项研究中,尼古丁导致没有代(图1(一))在小鼠腹腔巨噬细胞以及iNOSII表达式在mRNA水平下调细胞补充Ae-Og或抗坏血酸存在尼古丁(数字1 (b)和1 (c))。所以,草药产品(Ae-Og)和抗坏血酸抑制小鼠腹腔巨噬细胞没有生产在尼古丁毒性。

巨噬细胞表达细胞因子的主要来源;这些都是容易调节巨噬细胞的多种功能。但是,尼古丁对巨噬细胞的免疫调节作用尚未完全阐明,和报告的数据往往是相互矛盾的,特别是对尼古丁的影响细胞因子的生产(29日,30.,42,43]。我们发现尼古丁的毒性作用是一致的观察尼古丁可以像TNF -调节趋化因子的表达α白介素,TGF -β和il - 12(图3)。因此,尼古丁改变化学炎症介质的分泌和减少巨噬细胞活动(44]。也报道了梅斯等人,Th1 / Th2反应者的比率已被证明是更能反映免疫功能(21]。在我们目前的研究中,能够很好的证明,尼古丁可以触发Th1细胞因子(TNF -α和il - 12)和减少Th2 (TGF -β和il - 10)细胞因子释放(数字3(一)-3(d))以及在mRNA水平(数字3(e) -3(我)),这表明尼古丁可能至少短期影响到了正常的免疫平衡。缺乏Th2反应来应对增加的Th1 nicotine-exposed小鼠腹腔巨噬细胞的反应表明,尼古丁,吸烟的重要成分,扰乱了正常健康的Th1 / Th2平衡水平导致更高的脆弱性对正常细胞发展中某些自身免疫性疾病的风险更大。这些初步的结果可能表明尼古丁会增加疾病的机制脆弱性。旁边,我们也展示了Ae-Og和抗坏血酸的重要性产生一个新的抗炎药物打击nicotine-induced免疫障碍;我们的研究结果清楚地证实cotreatment Ae-Og和抗坏血酸的尼古丁可以减少nicotine-induced增强Th1细胞因子(TNF -α和il - 12)释放和在mRNA水平以及促进Th2 (il - 10和TGF -β)细胞因子释放和mRNA水平或多或少控制水平(图3)。

在我们早期的报道,nicotine-induced自由基生成和氧化损伤的补充改善o . gratissimum植物产品通过减少自由基生成(1、2、32)。众所周知,活性氧生成及其有效的氧化应激参与调节redox-sensitive转录因子调节炎症介质的表达细胞因子和趋化因子等。所以,在目前的研究中,抗炎治疗方法o . gratissimum工厂产品可能直接/间接保护细胞免受不利影响身上观察到尼古丁诱导下小鼠腹腔巨噬细胞的氧化损伤的扭曲Th1细胞因子向Th2细胞因子。

总之,我们的研究增强了分子步骤的理解导致身上观察到尼古丁诱导下小鼠巨噬细胞的免疫功能的弱化和提供额外的理由o . gratissimum植物的应用产品和抗坏血酸作为抗炎治疗期间工具不同炎性疾病预防和治疗尼古丁的毒性。

4所示。材料和方法

4.1。化学物质

氢tartarate盐的尼古丁和十二烷基硫酸钠(SDS)从σ,获得美国。RPMI 1640胎牛血清(的边后卫),抗生素解决方案(细胞文化品位),肝素钠、乙二胺四乙酸(EDTA)和抗坏血酸从Himedia购买,印度。ELISA试验设备对肿瘤坏死因子(TNF)α白介素- 12 (IL) p70, IL - 10和转化生长因子- (TGF)β(Quantikine米;研发系统,明尼阿波利斯,美国)采购。隔离的总RNA,三试剂购自σ,美国。核苷酸,RevertAid M-MuLV逆转录酶,低聚糖dT,核糖核酸酶抑制剂,和其他化学品所需的互补脱氧核糖核酸合成从Fermentas购买,美国。电力SYBR绿色PCR反应混合液(X 2)定量实时PCR从应用生物系统公司购买,英国。寡核苷酸实时PCR从σ购买,美国。所有其他化学物质来自默克有限公司,SRL pvt Ltd .)孟买,可用的最高等级。

4.2。动物

实验使用瑞士雄性老鼠6 - 8周大,重达20 - 25 g。动物喂养标准颗粒与维生素的饮食,抗生素和水有随意安置在聚丙烯笼(Tarson)在部门动物屋12 h:黑暗周期和温度°C。动物们被允许适应一周。所使用的动物没有任何迹象表明恶性肿瘤或其他病理过程。动物是依法维护国家营养研究所的指导方针,印度医学研究理事会,海得拉巴,印度和维德雅瑟格大学的伦理委员会批准。

4.3。水提物的制备罗勒属gratissimum

o . gratissimum收集从波尔,西孟加拉邦,印度,2007年9月,在早上。凭证标本存放标本的植物学,维德雅瑟格大学。新鲜的空中的一部分o . gratissimum晒干后,用重蒸馏的水混合,并提取(10:1)。混合物与绘画纸滤纸过滤(1号),集中在旋转蒸发器38°C,然后允许站在室温下过夜。过滤和浓度过程重复产生水溶液中。这个解决方案在400 g×10分钟然后离心机和上层清液冻干的获取原油水提物(Ae-Og) [1]。

4.4。制备的药物

美国tartarate氢盐的尼古丁(σ)是溶解在生理盐水(0.9%氯化钠)所需的浓度。尼古丁溶液的pH值是由氢氧化钠(调整到7.432]。股票解决Ae-Og在生理盐水稀释所需浓度。

4.5。隔离的腹膜巨噬细胞和细胞培养

所有的努力都是尽量减少动物痛苦和减少实验用动物的数量。巨噬细胞被分离从瑞士雄性小鼠腹膜灌洗,24小时注射后2毫升4%的淀粉根据我们以前的报告(25]。洗腹膜腔与冰冷的磷酸缓冲盐(PBS)补充20 U /毫升肝素和1毫米EDTA进行灌洗。是注意不要引起内出血而收集巨噬细胞分泌物。细胞被培养在60毫米petridishes rpmi - 1640年媒体补充10%的边后卫,50μ50 g / mL庆大霉素,μ青霉素g / mL, 50μg / mL链霉素为24小时37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂空气中CO / 95%₂孵化器。不依从细胞与冰冷的PBS被大力清洗三次。微分项的贴壁细胞用于实验测定染色和染色后显微镜下细胞生存能力评估通过台盼蓝排斥从未低于95%。

4.6。实验设计

腹膜巨噬细胞被分成4组,包含4×10⁶细胞。实验组和对照组的细胞保持RPMI 1640媒体补充10%的边后卫,50μ50 g / mL,庆大霉素μ青霉素g / mL, 50μ在37°C g / mL链霉素空气95% / 5%股份有限公司₂大气中有限公司₂孵化器。第二组被认为是为实验和培养12小时:集团我:控制(培养基);第二组:10毫米尼古丁在媒体文化;第三组:10毫米尼古丁+ 10μg Ae-Og /毫升培养基;第四组:10毫米尼古丁+ 0.01毫米抗坏血酸在媒体文化。尼古丁的浓度选择根据我们先前的实验报告(25,32)、抗坏血酸的浓度和Ae-Og之后根据我们先前的实验报告(1]。

4.7。身上观察到尼古丁诱导下小鼠巨噬细胞的亚硝酸盐(NO)生产

亚硝酸盐生产小鼠巨噬细胞被格里斯反应测量spectrophotometrically根据我们先前的实验报告(33]。治疗计划后,细胞然后在10000转离心20分钟。浮在表面的游离是转移到独立的微型离心机管一氧化氮释放试验。到100年μ100年每一个浮在表面的游离,LμL格里斯试剂(含1%磺胺在5%磷酸和0.1% N-C-1 napthyl乙二胺盐酸盐在1:1的比例)添加和孵化在黑暗在室温下10分钟。阅读是在紫外分光光度计相比在550纳米和亚硝酸钠标准曲线(值介于0.5和25μ米)。

4.8。依从性指数(AI)的确定

依从性的量化能力是由先前描述的方法(45]。在实验过程中,200整除μL的腹膜巨噬细胞群被安置在埃普多夫管和孵化37°C。10μ30 L细胞吸气在15日,60岁和90分钟间隔eppendrof管后轻轻摇动resuspend沉淀细胞,和nonadhered巨噬细胞的数量是由计数在纽鲍尔钱伯斯(布劳品牌,德国)在一个光学显微镜(40倍放大镜头)。依从性指数(AI)计算如下:AI = 100−[巨噬细胞/毫升上层清液)/(巨噬细胞/毫升原始样本)]×100。

4.9。趋化现象的指数(CI)的确定

腹膜巨噬细胞的趋化现象的指标测定根据威尔金森和轻微的修改(46]。三个小圆井穿孔等距在0.8%琼脂凝胶。中央充满了腹膜巨噬细胞(5×10⁴/)。外围井之一是填写与fMLP第九PBS和其他(10⁻⁸米),一个著名的化学引诱物。趋化因子在fMLP径向通过琼脂扩散和向fMLP吸引了巨噬细胞。细胞吸气15、30、60和90分钟从每个盘子的外围油井和涂片分别画在玻璃幻灯片,允许风干,固定在甲醇,沾染了染色。趋化指数各自组织确定的定向迁移的比率;也就是说,细胞转向fMLP包含随机迁移;即细胞转向PBS-containing。

4.10。测定吞噬指数(PI)

惰性粒子的吞噬作用分析(乳胶珠子)进行了方法后De la款(47]。200年整除μL腹膜悬挂的孵化在细胞培养板(Tarson) 30分钟。获得的粘单层与prewarmed PBS洗,然后200年μL汉克的媒介和20μL乳胶珠子(直径:1.09μ米)(σ)补充道。孵化后30分钟,洗盘子,固定、染色、粒子数100年巨噬细胞是由计算摄入的光学显微镜(100倍放大镜头)。每100巨噬细胞摄取巨噬细胞的数量也决定。

4.11。测定细胞内杀死活动(IKA)

金黄色葡萄球菌细菌(10⁷/毫升)和巨噬细胞(10孵化⁶/毫升)总量的1毫升RPMI-BSA含10%正常小鼠血清和细菌/巨噬细胞是旋转准备20分钟在37°C。Noningested细菌通过差速离心(10分钟,900 rpm)在4°C和两个与冰冷的RPMI-BSA洗。细胞摄取含有细菌在RPMI-BSA resuspended含有10%正常小鼠血清然后reincubated 37°C(100年的存在μg / mL庆大霉素杀死细菌胞外)1 h。细胞被洗RPMI-BSA去除庆大霉素。洗后,细胞reincubated 1 h和在此培养细胞在不同的时间间隔,使细胞保持在冰离心细胞内死亡终止。后添加蒸馏水含有0.01% BSA颗粒,细胞被大力涡流在上层清液释放细胞内的细菌。0.1毫升的上层清液连续镀在无菌蒸馏水稀释,在营养琼脂来确定可行的细胞内的细菌的数量。殖民地的数量获得实验开始时(0分钟reincubation后)被指定为100%的细菌。细胞内杀死被表示为百分比从初始可行的细菌数量减少48]。

4.12。测量细胞因子释放的夹心ELISA

小鼠肿瘤坏死因子的水平αIL-12p70, il - 10, TGF -β巨噬细胞条件培养液的文化测量使用夹心酶联免疫试剂盒(Quantikine M;研发系统)。执行的分析是根据制造商的详细说明。这些化验的检出限是< 5.1,< 2.5,< 4,< TNF - 3 pg / mLαIL-12p70, il - 10, TGF -β,分别。

4.13。隔离的RNA和实时PCR

总RNA提取4×10⁶小鼠腹腔巨噬细胞使用三试剂(σ)根据制造商的协议。孤立的总RNA (1μg)然后使用恢复援助反向转录M-MuLV逆转录酶(美国Fermentas)。由此产生的cDNA当时用于iNOSII实时PCR和细胞因子(IL-12p40, TNF -α、il - 10和TGF -β)使用ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统公司、英国)与DNA结合SYBR绿色染料。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)被用作参考。使用的正向和反向特定引物序列如下:

iNOSII:提出5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3′,反向5′-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3′;

肿瘤坏死因子-α:提出5′-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGC-3′,反向5′-ACATTCGAGGCTCCAGTGAATTCGG-3′;

IL-12p40:提出5′-CAACATCAAGAGCAGTAGCAG-3′,反向5′-TACTCCCAGCTGACCTCCAC-3′;

il - 10:提出5′-CGGGAAGACAATAACTG-3′反向5′-CATTTCCGATAAGGCTTGG-3′;

TGF -β:提出5′-GGATACCAACTATTGCTTCAGCTCC-3′,反向5′-AGGCTCCAAATATAGGGGCAGGGTC-3′;

GAPDH:提出5′-CAAGGCTGTGGGCAAGGTCA-3′,反向5′-AGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTG-3′。

实时定量PCR,每个反应包含X 1 SYBR绿色PCR主混合物(权力SYBR绿色PCR反应混合液;应用生物系统公司、英国),每个引物10 pmol, 1μ20 L (cDNA在最后一卷μl .反应条件如下:最初的激活步骤(5分钟在95°C)和循环步骤(变性30年代在94°C,退火30年代在58°C,然后扩展1分钟在72°C×40周期)其次是融化曲线分析。dequenched探测器的检测,计算阈值周期(Ct值),并进一步分析这些数据进行序列检测器的软件。相对iNOSII和细胞因子的变化(IL-12p40, TNF -α、il - 10和TGF -β)mRNA表达与如果控制相比,规范化GAPDH和量化的方法。因此,所有实验样本的值表示为示例mRNA和褶皱差异校准器(GAPDH) mRNA。数据的均值±S.E.M.数据从三个独立的实验,取得了类似的结果。

4.14。光密度分析

基因表达数据分析使用一个模型gs - 700成像密度计和分子分析1.5版本软件(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。

5。统计分析

实验进行了三次,数据提出了均值±S.E.M.对比实验组和对照组的手段是由双向方差分析测试(使用统计软件包,起源6.1,北安普顿,马01060年美国)与多重比较t测试,限制的意义。

引用

1. s . k .塔,s . p . Chakraborty和s·罗伊,“水提物罗勒属gratissimum林恩和抗坏血酸改善身上观察到尼古丁诱导下小鼠腹腔巨噬细胞的细胞损伤,”亚洲太平洋热带医学杂志》上,3卷,不。10日,775 - 782年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. s . k .塔,s . p . Chakraborty s Das和s·罗伊甲醇提取的罗勒属gratissimum保护小鼠腹腔巨噬细胞从尼古丁毒性减少自由基生成、脂质和蛋白质损伤和提高抗氧化保护,”氧化医学和细胞寿命,卷2,不。4、222 - 230年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. f . d . Onajobi“Smoth肌肉收缩lipidicsoluble色谱分数的原则罗勒属gratissimum”,民族药物学杂志卷。18日,3-11,1986页。视图:谷歌学术搜索
4. m . o . Ilori a . o . Sheteolu e·a·Omonigbehin和a . a . Adeneye”Antidiarrhoeal活动罗勒属gratissimum(唇形科),“腹泻疾病研究杂志》上,14卷,不。4、283 - 285年,1996页。视图:谷歌学术搜索
5. s·k·古普塔,j·普拉卡什,斯利瓦斯塔瓦,“验证传统的坦声称,罗勒属圣所绝壁。作为一种药用植物,”印度实验生物学杂志》上,40卷,不。7,765 - 773年,2002页。视图:谷歌学术搜索
6. j·普拉卡什,s·k·古普塔:辛格诉Kochupillai和k·古普塔,“抗增殖和chemopreventive活动罗勒属圣所绝壁,”国际医学杂志》上,生物学和环境,27卷,不。2、165 - 171年,1999页。视图:谷歌学术搜索
7. r . j . Jariwalla和s . Harakech“抗坏血酸,”生物化学和生物医学细胞生物学艾德,j·r·哈里斯,页215 - 231,充气出版社,纽约,纽约,美国,1996年。视图:谷歌学术搜索
8. 美国美国保释,Weindruch r, r . l . Walford“自由基、衰老和退化性疾病,”抗氧化剂和免疫应答,j·e·约翰逊Jr ., i l . Walford d·哈曼和m . j .丽丝。,页427 - 756年,阿兰·r·丽丝纽约,纽约,美国,1996年。视图:谷歌学术搜索
9. Perez-Cruz, j . m . Carcamo, d . w . Golde“维生素C抑制FAS-induced在单核细胞凋亡和U937细胞,”血,卷102,不。1,第343 - 336页,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. j . c . De La葡萄酒和r s Panush”调制的某些免疫反应的维生素c。增强伴刀豆球蛋白模拟淋巴细胞反应”,国际维生素和营养研究》杂志上,50卷,不。1,44-51,1980页。视图:谷歌学术搜索
11. b .作者莱博维茨和b . v .西格尔”,抗坏血酸,中性粒细胞功能,免疫反应,”国际维生素和营养研究》杂志上,48卷,不。2、159 - 164年,1978页。视图:谷歌学术搜索
12. e . j .葛佐美国沃瑟曼,吉利,和k·f·奥斯汀,“增强随机迁移和人类白细胞的趋化反应抗坏血酸,”《临床研究杂志》上,53卷,不。3、813 - 818年,1974页。视图:谷歌学术搜索
13. h . Mitsuzumi m . Kusamiya t Kurimoto,山本,“要求增加的细胞因子抗原抗体反应的抗坏血酸盐培养小鼠T-cell-depleted脾细胞,”日本药理学杂志》上的报告,卷78,不。2、169 - 179年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. 诉诉维克多,n . Guayerbas m . Puerto麦地那,和m . De La项目“抗坏血酸调节体外巨噬细胞的功能与内毒素休克小鼠,”免疫药理学,46卷,不。1,第101 - 89页,2000。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. m . De La葡萄酒和v . m .维克多,“抗坏血酸和防治作用提高体外淋巴细胞与endotoxin-induced小鼠氧化应激的作用,“自由基的研究,35卷,不。1,第84 - 73页,2001。视图:谷歌学术搜索
16. C·温克勒k . Schroecksnadel h . Schennach d·福克斯,“维生素C和E抑制mitogen-stimulated外周血单核细胞在体外,”国际档案过敏和免疫学,卷142,不。2、127 - 132年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. h . h, C . s . Chen j.y.林,”高剂量维生素C补充Th1 / Th2细胞因子的分泌率增加,但减少嗜酸性渗透在支气管肺泡灌洗液ovalbumin-sensitized和挑战的老鼠,”农业与食品化学杂志》上卷,57号21日,第10476 - 10471页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. n·希尔和n . Sarvetnick“细胞因子:发起人和缓冲器,自身免疫,”当前舆论免疫学,14卷,不。6,791 - 797年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. Krause, g . Valesini r . Scrivo, y Shoenfeld,“自体免疫细胞因子和anticytokine疗法,”美国医学杂志,卷115,不。5,390 - 397年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. m·梅斯,c的歌,林a . et al .,“心理压力对人类的影响:增加生产的促炎细胞因子和Th1-like压力反应的迹象,”细胞因子,10卷,不。4、313 - 318年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. m·梅斯、c .歌和林,“免疫和临床相关的心理应激移行细胞和白细胞介素- 10”在人类的生产,”细胞因子:压力和免疫力:p .他是r . e .信仰,a . j . Murgo, Eds r .答:好。页,39-50 CRC出版社,华盛顿特区,美国,1999年。视图:谷歌学术搜索
22. z,“当前的理解1型巨噬细胞细胞因子反应在细胞内感染,”组织学和组织病理学,15卷,不。1,第205 - 199页,2000。视图:谷歌学术搜索
23. t . Tabatabaie a . Vasquez-Weldon d·r·摩尔和y Kotake自由基和1型糖尿病的发病机理:β细胞通过cyclooxygenase-2 cytokine-mediated自由基生成。”糖尿病,52卷,不。8,1994 - 1999年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. z, l . Chang x y梅,和l .易”的作用和机制的CD4 + CD25 +调节性T细胞在移植耐受的诱导和维护”移植免疫学,17卷,不。2、120 - 129年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. s . k .塔,s Das,保护好,n . Gautam s Majumdar和s·罗伊,“体外身上观察到尼古丁诱导下小鼠腹腔巨噬细胞的氧化应激:存在剂量依赖的相关性的方法,”毒理学机制和方法,19卷,不。2、100 - 108年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. 美国卡塔,s . p . Chakraborty,罗伊,“体外与时间有关的nicotine-induced自由基生成和小鼠腹腔巨噬细胞谷胱甘肽循环状态,”艾尔Ameen医学科学杂志》上,3卷,不。3、182 - 194年,2010页。视图:谷歌学术搜索
27. s Das s Neogy: Gautam,罗伊,”尼古丁体外诱导超氧化物介导淋巴细胞DNA碎片:穿心莲香需要雇保护作用,”毒理学体外,23卷,不。1,第98 - 90页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. s . Neogy s Das, s . k .塔,n . Mandal和s·罗伊,“Amelioratory穿心莲香需要雇对肝、肾、心脏、肺脏和脾脏中尼古丁引起的氧化应激,”环境毒理学和药理学,25卷,不。3、321 - 328年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. y欧阳:Virasch, p .郝et al .,“人类il - 1的抑制β2,干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α由香烟烟雾提取物生产。”变态反应与临床免疫学杂志》上,卷106,不。2、280 - 287年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. a . Hakki n . Hallquist h·弗里德曼,s .普罗斯“微分尼古丁对细胞增殖和细胞因子的影响生产LPS-stimulated小鼠脾细胞,”国际免疫药理学杂志》上,22卷,不。6,403 - 410年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. c . a . Whetzel e·j·科文和l·c·克莱恩,“中断Th1 / Th2免疫反应在年轻的成年吸烟者,”成瘾行为,32卷,不。1,1 - 8,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. 美国卡塔,s . p . Chakraborty s Majumdar b . g .袋和罗伊,“丁香酚保护身上观察到尼古丁诱导下小鼠腹腔巨噬细胞的过氧化物氧化损伤介导的体外,”欧洲药理学杂志,卷623,不。1 - 3、132 - 140年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. 美国卡塔,保护好,s . p . Chakraborty s Majumdar和s·罗伊,“免疫功能的改变和Th1 / Th2细胞因子的平衡nicotine-induced小鼠巨噬细胞:免疫调节作用的丁香酚和n -乙酰半胱氨酸常”国际免疫药理学,11卷,不。4、485 - 495年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. e·奥尔特加f . Hueso m . e . Collazos Pedrera, c . Barriga a和b·罗德里格斯“乳胶珠子的肺泡巨噬细胞的吞噬作用小鼠暴露于香烟烟雾,“比较免疫学,微生物学和传染病,15卷,不。2、137 - 142年,1992页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. e·奥尔特加,c . Barriga和a·b·罗德里格斯“肺泡巨噬细胞的吞噬功能下降从小鼠暴露于香烟烟雾,“比较免疫学,微生物学和传染病,17卷,不。1,第84 - 77页,1994。视图:谷歌学术搜索
36. k·m·布劳恩·t·康沃尔,a . Valm j . Cundiff j·l·保利和美国球迷,”Immunotoxicology的烟冷凝物:干扰素抑制巨噬细胞反应γ”,毒理学和药理学应用,卷149,不。2、136 - 143年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. a·j·p·p·刘,l . Li营销上,a . l . Zhang k . w . s . Ko和l . Chan“尼古丁诱发巨噬细胞的促炎反应和主动脉导致加速动脉粥样硬化的低密度脂蛋白受体- / -小鼠,”动脉硬化、血栓和血管生物学,26卷,不。1,第149 - 143页,2006。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. p•j•巴恩斯和刘f . y .一氧化氮和哮喘炎症。”今天免疫学,16卷,不。3、128 - 130年,1995页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. h·科尔布和诉Kolb-Bachofen一氧化氮在自身免疫性疾病:细胞毒性或监管中介?”今天免疫学,19卷,不。12日,第561 - 556页,1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. a . w . Taylor-Robinson“生产- 2抑制一氧化氮:小说自律Th1细胞增殖的机制,”免疫学和细胞生物学,卷75,不。2、167 - 175年,1997页。视图:谷歌学术搜索
41. f·l·m·Ricciardolo p . j .斯德克已b·加斯顿和g . Folkerts“一氧化氮在呼吸系统的健康和疾病,”生理上的评论,卷84,不。3、731 - 765年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. d k歌,y . b . Im, j·s·荣格et al .,“中央注射尼古丁会增加肝和脾白介素6 (il - 6) mRNA表达和在小鼠血浆il - 6水平:外周交感神经系统的参与,“美国实验生物学学会联合会杂志,13卷,不。10日,1259 - 1267年,1999页。视图:谷歌学术搜索
43. t·m·佩特罗,s·d·Schwartzbach和美国,“无烟烟草和尼古丁带来过度的细胞因子反应的小鼠记忆t细胞,”国际免疫药理学杂志》上,21卷,不。2、103 - 114年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. r ., n . Sugano h . Orii t .福田康夫和k .伊藤”身上观察到尼古丁诱导下基因表达的变化的微阵列分析macrophage-like人类细胞系,”牙周研究期刊》的研究,42卷,不。6,518 - 526年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. v . m .维克多和m . De la葡萄酒”防治作用提高体外巨噬细胞的功能与endotoxin-induced小鼠氧化应激,”自由基的研究,36卷,不。1,33-45,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. p·c·威尔金森“运动、白细胞趋化性”实验免疫学的手册d . m .堰,艾德。,页51.1 - -51.16,布莱克韦尔科学出版物,伦敦,英国,1977年第四版。视图:谷歌学术搜索
47. m . De La葡萄酒“巨噬细胞功能随年龄增长的变化,”比较生物化学和生理学,卷81,不。4、935 - 938年,1985页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. p·c·j·李,r·范·菲尔特和t . l . Zwet”体外测定由多形核中性粒细胞和单核吞噬细胞吞噬作用和细胞内杀死,”实验免疫学的手册,艾德。d . m .堰46卷,页。-布莱克韦尔科学出版物,伦敦,英国,1977年第四版。视图:谷歌学术搜索

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