我们已经研究了身上观察到尼古丁诱导下存在的小鼠腹腔巨噬细胞的亚硝酸盐生成Ae-Og格里斯试剂(图/抗坏血酸 1(一))。没有一代明显( P < 0.05 )的nicotine-treated巨噬细胞增加了2.81倍控制巨噬细胞相比,它也显著( P < 0.05 )由Ae-Og共同改善,抗坏血酸和尼古丁。确认没有释放,我们还研究了iNOSII表达式在mRNA水平治疗后的日程安排。我们发现iNOSII表达式在mRNA水平显著( P < 0.05 )增加了3.02倍nicotine-treated细胞,补充Ae-Og和抗坏血酸能显著降低iNOSII表达式( P < 0.05 )nicotine-treated组相比,这些都是向控制水平(数字 1 (b)和 1 (c))。因此,Ae-Og,一种天然的植物产品,可以减少亚硝酸盐生成类似于nicotine-treated小鼠腹腔巨噬细胞抗坏血酸。

15岁腹膜巨噬细胞的细胞功能,治疗后30、60、90分钟计划如图 2。依从性指标(图 2(一个)(图),趋药性的索引 2 (b)(图),吞噬索引 2 (c))增加巨噬细胞的所有组时间时尚。这些索引减少nicotine-treated组显示显著差异( P < 0.05 )在每个时间间隔对腹膜巨噬细胞的对照组。但是,这些显著增加( P < 0.05 )补充Ae-Og和抗坏血酸而只有nicotine-treated组在每个时间间隔。的细胞内死亡 金黄色葡萄球菌由治疗和治疗腹膜巨噬细胞在不同时间点估计来确定细胞内杀死巨噬细胞(图的属性 2 (d))。可行的百分比 金黄色葡萄球菌最初的时候是100年,随时间增加而降低在所有类型的治疗。细菌的生存能力是减少在15分钟的时间点,但是从30分钟增加到终点的研究区间比正常的巨噬细胞。可行的细菌的比例正常,逐渐减少尼古丁+ Ae-Og,尼古丁+抗坏血酸洗组在每个时间点的间隔进行了研究。

完善,尼古丁是炎症的药物,调节免疫功能。因此,我们打算研究Ae-Og和抗坏血酸治疗是否可以调节促炎细胞因子(TNF - α和il - 12)和抗炎细胞因子(TGF - βil - 10)的释放和表达对小鼠腹腔巨噬细胞在mRNA水平。我们观察到治疗尼古丁在巨噬细胞显著增加释放肿瘤坏死因子- α和IL-12p70与控制细胞相比,显著降低Ae-Og和抗坏血酸(数据的补充 3(一)和 3(b))。肿瘤坏死因子-的显著增加 α释放可能发挥关键作用的触发信号增强的一代。另一方面,释放TGF - β抗炎细胞因子il - 10,签名,显著降低尼古丁的治疗。共同服用Ae-Og和抗坏血酸的尼古丁(数字 3(c)和 3(d))显著增加这两个抗炎细胞因子的释放。确认我们的定量数据,所观察到的ELISA方法,我们进一步研究了mRNA的表达上述细胞因子治疗后安排使用实时PCR分析。结果表明,肿瘤坏死因子-的显著增加 α(数据 3(e)和 3(f))和IL-12p40(数字 3(e)和 3(g))表达式nicotine-treated巨噬细胞与巨噬细胞的控制。巨噬细胞治疗尼古丁结合Ae-Og /抗坏血酸明显下降TNF的表达水平 αIL-12p40,相比之下,nicotine-treated巨噬细胞。另一方面,在nicotine-treated巨噬细胞,有明显降低的TGF - β(数据 3(e)和 3(h))和il - 10(数字 3(e)和 3(我))与控制相比,巨噬细胞在mRNA水平。当巨噬细胞治疗尼古丁连同Ae-Og /抗坏血酸,TGF -的表达 β和il - 10与nicotine-treated巨噬细胞相比显著增加。这是Th1、Th2细胞因子之间的平衡,决定了不同的免疫疾病的易感性 31日]。我们目前的研究结果表明,nicotine-treated巨噬细胞诱导Th1细胞因子和抑制Th2细胞因子,在nicotine-treated Ae-Og和抗坏血酸治疗后巨噬细胞,抑制Th1细胞因子和增强Th2细胞因子,从而防止免疫紊乱的脆弱性。

氢tartarate盐的尼古丁和十二烷基硫酸钠(SDS)从σ,获得美国。RPMI 1640胎牛血清(的边后卫),抗生素解决方案(细胞文化品位),肝素钠、乙二胺四乙酸(EDTA)和抗坏血酸从Himedia购买,印度。ELISA试验设备对肿瘤坏死因子(TNF) α白介素- 12 (IL) p70, IL - 10和转化生长因子- (TGF) β(Quantikine米;研发系统,明尼阿波利斯,美国)采购。隔离的总RNA,三试剂购自σ,美国。核苷酸,RevertAid M-MuLV逆转录酶,低聚糖dT,核糖核酸酶抑制剂,和其他化学品所需的互补脱氧核糖核酸合成从Fermentas购买,美国。电力SYBR绿色PCR反应混合液(X 2)定量实时PCR从应用生物系统公司购买,英国。寡核苷酸实时PCR从σ购买,美国。所有其他化学物质来自默克有限公司,SRL pvt Ltd .)孟买,可用的最高等级。

实验使用瑞士雄性老鼠6 - 8周大,重达20 - 25 g。动物喂养标准颗粒与维生素的饮食,抗生素和水有随意安置在聚丙烯笼(Tarson)在部门动物屋12 h:黑暗周期和温度 25 ± 2 °C。动物们被允许适应一周。所使用的动物没有任何迹象表明恶性肿瘤或其他病理过程。动物是依法维护国家营养研究所的指导方针,印度医学研究理事会,海得拉巴,印度和维德雅瑟格大学的伦理委员会批准。

o . gratissimum收集从波尔,西孟加拉邦,印度,2007年9月,在早上。凭证标本存放标本的植物学,维德雅瑟格大学。新鲜的空中的一部分 o . gratissimum晒干后,用重蒸馏的水混合,并提取(10:1)。混合物与绘画纸滤纸过滤(1号),集中在旋转蒸发器38°C,然后允许站在室温下过夜。过滤和浓度过程重复产生水溶液中。这个解决方案在400 g×10分钟然后离心机和上层清液冻干的获取原油水提物(Ae-Og) [ 1]。

美国tartarate氢盐的尼古丁(σ)是溶解在生理盐水(0.9%氯化钠)所需的浓度。尼古丁溶液的pH值是由氢氧化钠(调整到7.4 32]。股票解决Ae-Og在生理盐水稀释所需浓度。

所有的努力都是尽量减少动物痛苦和减少实验用动物的数量。巨噬细胞被分离从瑞士雄性小鼠腹膜灌洗,24小时注射后2毫升4%的淀粉根据我们以前的报告( 25]。洗腹膜腔与冰冷的磷酸缓冲盐(PBS)补充20 U /毫升肝素和1毫米EDTA进行灌洗。是注意不要引起内出血而收集巨噬细胞分泌物。细胞被培养在60毫米petridishes rpmi - 1640年媒体补充10%的边后卫,50 μ50 g / mL庆大霉素, μ青霉素g / mL, 50 μg / mL链霉素为24小时37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂空气中CO / 95%₂孵化器。不依从细胞与冰冷的PBS被大力清洗三次。微分项的贴壁细胞用于实验测定染色和染色后显微镜下细胞生存能力评估通过台盼蓝排斥从未低于95%。

腹膜巨噬细胞被分成4组,包含4×10⁶细胞。实验组和对照组的细胞保持RPMI 1640媒体补充10%的边后卫,50 μ50 g / mL,庆大霉素 μ青霉素g / mL, 50 μ在37°C g / mL链霉素空气95% / 5%股份有限公司₂大气中有限公司₂孵化器。第二组被认为是为实验和培养12小时:集团我:控制(培养基);第二组:10毫米尼古丁在媒体文化;第三组:10毫米尼古丁+ 10 μg Ae-Og /毫升培养基;第四组:10毫米尼古丁+ 0.01毫米抗坏血酸在媒体文化。尼古丁的浓度选择根据我们先前的实验报告( 25, 32)、抗坏血酸的浓度和Ae-Og之后根据我们先前的实验报告( 1]。

亚硝酸盐生产小鼠巨噬细胞被格里斯反应测量spectrophotometrically根据我们先前的实验报告( 33]。治疗计划后,细胞然后在10000转离心20分钟。浮在表面的游离是转移到独立的微型离心机管一氧化氮释放试验。到100年 μ100年每一个浮在表面的游离,L μL格里斯试剂(含1%磺胺在5%磷酸和0.1% N-C-1 napthyl乙二胺盐酸盐在1:1的比例)添加和孵化在黑暗在室温下10分钟。阅读是在紫外分光光度计相比在550纳米和亚硝酸钠标准曲线(值介于0.5和25 μ米)。

依从性的量化能力是由先前描述的方法( 45]。在实验过程中,200整除 μL的腹膜巨噬细胞群被安置在埃普多夫管和孵化37°C。10 μ30 L细胞吸气在15日,60岁和90分钟间隔eppendrof管后轻轻摇动resuspend沉淀细胞,和nonadhered巨噬细胞的数量是由计数在纽鲍尔钱伯斯(布劳品牌,德国)在一个光学显微镜(40倍放大镜头)。依从性指数(AI)计算如下:AI = 100−[巨噬细胞/毫升上层清液)/(巨噬细胞/毫升原始样本)]×100。

腹膜巨噬细胞的趋化现象的指标测定根据威尔金森和轻微的修改( 46]。三个小圆井穿孔等距在0.8%琼脂凝胶。中央充满了腹膜巨噬细胞(5×10⁴/)。外围井之一是填写与fMLP第九PBS和其他(10⁻⁸米),一个著名的化学引诱物。趋化因子在fMLP径向通过琼脂扩散和向fMLP吸引了巨噬细胞。细胞吸气15、30、60和90分钟从每个盘子的外围油井和涂片分别画在玻璃幻灯片,允许风干,固定在甲醇,沾染了染色。趋化指数各自组织确定的定向迁移的比率;也就是说,细胞转向fMLP包含随机迁移;即细胞转向PBS-containing。

惰性粒子的吞噬作用分析(乳胶珠子)进行了方法后De la款( 47]。200年整除 μL腹膜悬挂的孵化在细胞培养板(Tarson) 30分钟。获得的粘单层与prewarmed PBS洗,然后200年 μL汉克的媒介和20 μL乳胶珠子(直径:1.09 μ米)(σ)补充道。孵化后30分钟,洗盘子,固定、染色、粒子数100年巨噬细胞是由计算摄入的光学显微镜(100倍放大镜头)。每100巨噬细胞摄取巨噬细胞的数量也决定。

金黄色葡萄球菌细菌(10⁷/毫升)和巨噬细胞(10孵化⁶/毫升)总量的1毫升RPMI-BSA含10%正常小鼠血清和细菌/巨噬细胞是旋转准备20分钟在37°C。Noningested细菌通过差速离心(10分钟,900 rpm)在4°C和两个与冰冷的RPMI-BSA洗。细胞摄取含有细菌在RPMI-BSA resuspended含有10%正常小鼠血清然后reincubated 37°C(100年的存在 μg / mL庆大霉素杀死细菌胞外)1 h。细胞被洗RPMI-BSA去除庆大霉素。洗后,细胞reincubated 1 h和在此培养细胞在不同的时间间隔,使细胞保持在冰离心细胞内死亡终止。后添加蒸馏水含有0.01% BSA颗粒,细胞被大力涡流在上层清液释放细胞内的细菌。0.1毫升的上层清液连续镀在无菌蒸馏水稀释,在营养琼脂来确定可行的细胞内的细菌的数量。殖民地的数量获得实验开始时(0分钟reincubation后)被指定为100%的细菌。细胞内杀死被表示为百分比从初始可行的细菌数量减少 48]。

小鼠肿瘤坏死因子的水平 αIL-12p70, il - 10, TGF - β巨噬细胞条件培养液的文化测量使用夹心酶联免疫试剂盒(Quantikine M;研发系统)。执行的分析是根据制造商的详细说明。这些化验的检出限是< 5.1,< 2.5,< 4,< TNF - 3 pg / mL αIL-12p70, il - 10, TGF - β,分别。

总RNA提取4×10⁶小鼠腹腔巨噬细胞使用三试剂(σ)根据制造商的协议。孤立的总RNA (1 μg)然后使用恢复援助反向转录M-MuLV逆转录酶(美国Fermentas)。由此产生的cDNA当时用于iNOSII实时PCR和细胞因子(IL-12p40, TNF - α、il - 10和TGF - β)使用ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统公司、英国)与DNA结合SYBR绿色染料。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)被用作参考。使用的正向和反向特定引物序列如下:

iNOSII:

提出5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3′,

肿瘤坏死因子- α:

提出5′-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGC-3′,

IL-12p40:

提出5′-CAACATCAAGAGCAGTAGCAG-3′,

il - 10:

提出5′-CGGGAAGACAATAACTG-3′

TGF - β:

提出5′-GGATACCAACTATTGCTTCAGCTCC-3′,

GAPDH:

提出5′-CAAGGCTGTGGGCAAGGTCA-3′,

实时定量PCR,每个反应包含X 1 SYBR绿色PCR主混合物(权力SYBR绿色PCR反应混合液;应用生物系统公司、英国),每个引物10 pmol, 1 μ20 L (cDNA在最后一卷 μl .反应条件如下:最初的激活步骤(5分钟在95°C)和循环步骤(变性30年代在94°C,退火30年代在58°C,然后扩展1分钟在72°C×40周期)其次是融化曲线分析。dequenched探测器的检测,计算阈值周期(Ct值),并进一步分析这些数据进行序列检测器的软件。相对iNOSII和细胞因子的变化(IL-12p40, TNF - α、il - 10和TGF - β)mRNA表达与如果控制相比,规范化GAPDH和量化的 22 - - - - - - ddCt 方法。因此,所有实验样本的值表示为示例mRNA和褶皱差异校准器(GAPDH) mRNA。数据的均值±S.E.M.数据从三个独立的实验,取得了类似的结果。

基因表达数据分析使用一个模型gs - 700成像密度计和分子分析1.5版本软件(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。