一个定制的下一代Sequencing-Based小组,确定新的基因变异在痴呆疾病:一个试点研究

文摘

目的。下一代测序技术的进步(上天)技术允许快速,高效,cost-time-effective基因变异检测。然而,在临床实践和研究设置,测序仍是常常局限于基因面板的使用临床针对感兴趣的基因的疾病。方法。我们进行了neurogenetic研究通过特别的NGS-based定制测序基因小组为了屏幕16基因8不同类型的退行性认知障碍患者(阿尔茨海默病,轻度认知障碍,额颞叶痴呆和老年痴呆症与帕金森病相关)。这项协议是基于先前的证据显示高敏感性和特异性的技术即使面板仅限于一些热点外显子。结果。我们发现的变体TREM2和应用程序基因在三个病人;这些都是之前确定为致病或可能致病,因此,被认为是“疾病引起。“在剩下的科目,致病性评估根据指南的美国大学医学遗传学(ACMG)。在一个病人,p。R205W变体的CHMP2B基因被发现疾病的可能致病。的一个变种CSF1R和SERPINI1基因中发现两个病人分为良性的,而其他两个(入库单和应用程序基因)列为可能根据ACMG致病性。结论。尽管这项研究的初步价值,一些罕见的遗传变异发现了可能的疾病相关。尽管未来NGS-based传感器的应用和需要进一步复制这些实验数据,这种方法似乎带来了很大的平移视角的诊断和管理各种神经退行性疾病。

1。介绍

痴呆包括一群退行性疾病导致的认知功能逐步下降,在某些情况下,行为的变化和运动障碍,从一个缓慢一些汽车活动明显的震颤麻痹。痴呆症影响全球约4750万例,每年有770万新病例报告(1]。类似于其他退行性疾病,没有疾病修饰治疗是主要用于痴呆和早期诊断是最好的预测疾病的结果(2,3]。在这种背景下,深入了解痴呆可以提供分子基础的路径为早期诊断和新的靶向治疗方法的发展。

在其他退行性疾病,老年痴呆症的基因是一个重要的风险因素,以5 - 10%的病例被家族,通常归因于不同的基因(4,5]。然而,很可能评估家族病例的发病率仅基于临床观察导致低估真正的数量的情况下,因为其他医疗条件可能会造成死亡的个体发生前症状发作前的退化。此外,基因检测还没有一个普遍推荐的诊断工具痴呆(6- - - - - -8]。因此,临床医师选择使用基因测试经常从事的一小部分基因的筛选,关注患者的基因型变异外显率高,而不是疾病的所有基因的测序。这些临床问题和测试的高成本导致发病率的显著偏差的评估,临床流行病学不能被认为是准确的。

作为一般规则,退行性认知和运动障碍可能造成的,至少在某种程度上,由单一的、致病性变异(单基因)或由多个小效果,行为协同变异(寡基因)介导疾病表达(9]。在这种情况下,新方法的应用,比如下一代测序(上天)技术,导致快速和有效的基因变异检测以及减少成本。

三种类型的门店在临床应用程序当前可用:全基因组测序(WGS), whole-exome测序(韦斯)和目标基因板(10]。虽然WGS是一种非特异性的方法评估整个基因组信息的一个个体,韦斯只有基因组蛋白质编码区域的目标,基于证据表明疾病有关的变异明显的过多的编码区域。然而,尽管韦斯是最常用的方法,它有一些局限性10]。举例来说,其成本仍然高雇佣足够的覆盖率,使得研究使用大样本大小的累积成本昂贵。第二个挑战是,这种方式常常提供了大量的遗传变异外显子组,常常令研究人员,特别是如果genotype-specific所需基因诊断治疗。另一个问题是,它生成二次发现有时与感兴趣的疾病[无关11]。相反,使用目标基因面板侧重于特定基因潜在的疾病进行调查(9]。

最近改进的技术从事基因检测的神经退行性疾病的引入强大的并行DNA测序方法,使研究人员系统地屏幕个人基因组的测序DNA碱基对分辨率变化(12]。技术改进也帮助解决这个问题在失踪的继承性和揭示小说潜在致病基因变异。因此,临床上重要的有针对性的测序基因小组可能会导致一个高效的技术,也是耗费时间的有效利用Sanger测序相比,(13]。

在本试验研究中,我们使用了一个特别的NGS-based定做的测序基因小组识别退化性认知障碍患者的基因变异,即阿尔茨海默病(AD),轻度认知障碍(MCI),额颞叶痴呆(FTD)和痴呆与帕金森病(PD)有关。在临床实践中,他们的标识和鉴别诊断常常挑战,尽管由于生物标志物检测,改进诊断痴呆可以重叠症状和可能有共同的遗传背景14]。在这个场景中,基因检测可以帮助诊断,发现疾病的具体病因,为家庭提供信息,并注明合格的临床试验。

在这项研究中使用的工具允许屏幕在16个基因变异与神经退行性疾病的途径。这项协议是基于先前的证据贝克和他的同事们(13),显示高敏感性和特异性的技术,即使一些热点外显子面板是有限的。需要更多的工作来提高信息的文献和数据库的致病性和外显率的变异。出于这个原因,病人的进一步的分子特征有助于提供额外的证据对痴呆的临床和突变的异质性和更好地定义genotype-phenotype相关性。这是有关不仅对痴呆流程有更深一层的认识,也对病人和家属的遗传咨询和治疗方法。

2。材料和方法

2.1。参与者

遗传面板测试8例女性(4)的临床诊断:广告( ),MCI ( ),FTD ( ),和PD-associated痴呆( )。岁时考试范围从34到87岁,而在发病年龄32和84年之间。表1总结了相关临床和人口数据和主要实验室和仪器的发现。所有与会者都高加索和西西里岛的祖先。

家族病史收集通过详细的采访或直系亲属渊源者的配偶。每个病人的临床和过去的病史收集,和所有可用的文档相关影响的成员(如医疗记录、证书、药品处方)。在四个主题(病人2、4、5、6),神经退行性疾病的家族史是报道,而其他四个病例被认为是零星的,由病人回忆和由护理人员确认。所有临床诊断由一个训练有素的神经学家,依照目前的广告(诊断标准15],MCI [16],FTD [17],PD-dementia [18]。招聘发生在2017年7月和2018年10月。

所有对象(或其法定监护人)把他们的知情同意包含之前参加了实验。进行的这项研究是按照1964年的赫尔辛基宣言及其后来的修正案,协议是经伦理委员会批准的Oasi研究Institute-IRCCS Troina,意大利(批准代码:2018/07/18 / CE-IRCCS-OASI / 14)。

2.2。总会在测序

从所有的病人血液样本收集。根据标准程序得到了DNA和等离子体。基因组DNA是使用盐氯仿萃取法分离淋巴细胞,在琼脂糖凝胶检查退化,量化的量子位2.0荧光计。离子AmpliSeq™痴呆基因研究小组(13)是用来识别基因变异与痴呆有关。该面板包含214年2扩增子池。

聚合酶链反应amplicon-based图书馆准备(AmpliSeq设计师软件,生命技术、钙、美国)被用来屏幕下面的痴呆疾病的基因:含有朊(朊蛋白;Ex2),应用程序(淀粉样前体蛋白;例1、3、4、9、10、12、13、15—),PSEN1(presenilin 1;Ex2-12),PSEN2(presenilin 2;Ex5-8 13),入库单(granulin;Ex1-13),MAPT(microtubule-associatedτ蛋白;Ex2, 6日至14日,覆盖率98%),TREM2(髓细胞触发受体表达2;Ex1-5),CHMP2B(指控多泡体蛋白质2 b;Ex5-6),CSF1R(集落刺激因子1受体;Ex12-22),付家(在肉瘤融合;要是5 6、12 - 15),ITM2B(膜蛋白2 b积分;Ex6, ),NOTCH3(切口受体3;Ex3-4),SERPINI1我(serpin家庭成员1;Ex2-9),TARDBP(焦油DNA结合蛋白;Ex2-6),TYROBP(新手蛋白质酪氨酸激酶结合蛋白;Ex1-5),VCP(valosin-containing蛋白质;Ex1-17),SQSTM1(sequestosome 1;例1,2 - 8, ),据贝克和他的同事们(13]。

模板制备、克隆扩增、复苏和浓缩template-positive离子球™粒子和加载sequencing-ready离子激流半导体芯片(离子314)进行离子厨师™系统。测序运行进行了使用离子S5测序工具包(热费希尔科学)。运行数据的处理使用离子激流套件5.10,5.10变量调用者,覆盖率分析5.10(热费希尔科学),离子记者(热费希尔科学),和/或wANNOVAR工具(19]。DNA序列是通过整合基因组学查看器显示20.]。桑格测序进行确认所有突变。

使用PolyPhen-2变异进行评估,筛选,MutationTaster FATHMM和PROVEAN软件工具。此外,CADD数据库分类变量用作有害或不是基于数值截止值( )。我们删除了所有常见变异( )报道在公共数据库1000基因组计划和外显子组测序。根据这些数据库,变异可分为容忍的,有害的,良性的,中性的,有害的注意,和有害的。最后,基于美国大学医学遗传学(ACMG)指南21],致病性的证据被分配到每个变种鉴定如下:1(良性),2(可能良性),3(不确定的意义),4(可能致病)和5(致病性)。

3所示。结果

门店分析通过使用16上述基因面板(含有朊,PSEN1,PSEN2,应用程序,入库单,MAPT,TREM2,CHMP2B,CSF1R,付家,ITM2B,NOTCH3,SERPINI1,TARDBP,TYROBP,VCP在所有病人中)是成功完成。通过使用离子AmpliSeq™痴呆基因研究小组(13),我们看到了平均98%的基地> 20 x的报道。每个样本的平均阅读深度是420 x。变异的数量/病人~ 180。

表2说明了变种被发现的病人,以及位置,基因遗传模式,类型(拼接、错义和其他人),基因型,哪些已经知道。特别是,变体c。482 + 2 t > CTREM2基因(22),c。C613T在CHMP2B基因(23,24],c。G2137A在应用程序基因(25)是已知的。相反,变体c。G2239A在CSF1R基因,c。G289A在SERPIN1基因,c。C110G在入库单基因,c。G1604A在应用程序基因没有先前描述。

表3显示的结果在网上分析变异导致致病性根据分类标准建立和提供数据的等位基因频率。Sanger-sequenced变异都是按照捷的结果。

4所示。讨论

4.1。主要发现

门店测序技术的发展允许快速和高效的同时分析多个基因,从而提供重要的临床优势,尤其是对复杂疾病的诊断具有较高的遗传异质性(即。不同的基因相同的临床表型),认知障碍、运动障碍等。

在这项研究中,我们支持先前的证据贝克和他的同事们(13通过证明,虽然限于一些热点外显子,面板具有很高的敏感性和特异性。屏幕痴呆的主要基因的可能性,包括早发性形式,与良好的成功概率和相对降低成本,是主要的优势。另一方面,事实上只有少数外显子在有限数量的基因可以被检查是一个限制。exoma-trios方法,虽然比较贵,可能会披露更多的结果。然而,之前订购基因检测,临床医生必须确定适当的基因测试和使用最好的基因测试类型。没有这个分析,解释的遗传结果是很困难的。病人和家属应建议的好处和限制不同类型的基因测试,这样他们就可以做出明智的决定测试。

在我们的研究中,一个定制的面板的应用16 dementia-associated基因8病人可以识别一个或多个变量和相关致病的作用。其中一些变异之前没有报道的,而另一些是已知的。也就是说,突变的TREM2(例1和2),CHMP2B(3)病人应用程序(5)病人的基因已经被发现是文学和致病性或可能致病,因此,它们可以被认为是“疾病导致”(26]。在病人3中,种族隔离在家庭中没有报道,相同的变异也被描述在患者不同的表型(23,24),而不是在一般人群;因此,进一步的功能的研究是必要的。

在剩下的病人,因为变异不存在于数据库(HGMD ClinVar),根据ACMG致病性评估指南(21]。中的变异患者4和6 (CSF1R和SERPINI1基因)应该分为2类,分别,而其他两个变量(入库单在病人7和基因应用程序基因在病人8)应该划分为4类。值得注意的是,错义p。R535H突变患者8位于一个相关的应用程序的功能“collagen-binding”域蛋白质。特别是特定绑定的应用表明,细胞外基质分子应用调节细胞相互作用,作为细胞粘附分子和/或基质粘附分子(27]。

总而言之,四个新变种已确定在我们的研究中。而在患者4和6变种可能被归类为良性或良性的,因此没有发挥重要的致病作用,在病人7和8在网上分析、数据从CADD_phred和没有变异的一般人群允许假设致病作用。然而,额外的功能研究和进一步的数据支持一个潜在的致病性(例如,等位基因频率在种族人口,隔离在家庭中,在蛋白质水平的影响,和蛋白质域)是必要的。

迄今为止,小说变异的作用意义不明的常见和罕见dementia-associated基因没有详尽的阐明,尽管一些小说,可能致病变种最近发表在意大利痴呆患者(28]。在我们的研究中,剪接变体c。482 + 2 t > C被发现的TREM2基因1和2的病人,没有亲人,甚至不遥远。鉴于这种变体的患病率在意大利,特别是在西西里岛的人口(6/20等位基因,30%)22,29日),一个“创始人效应”的发生可能会猜测。与大样本进一步研究是必要的,虽然这些数据可以帮助在解开基因变异的作用观察(30.]。

目前的结果也支持了假设早发性痴呆可能的结果相互联系的机制,导致神经退化的含义相同的基因中可以看到一个或多个系统(31日,32]。这里大部分的基因检测在多个细胞通路发挥关键作用而不是参与单一形式的痴呆症。这些途径包括能量代谢、磷脂和胆固醇流出,细胞内和泡贩卖,neuronal-viability和生存,通常妥协在每个神经退行性过程,涉及其他几个分子演员(32]。

这牵涉到一个潜在的添加剂/痴呆的早期形式的协同效应与国际米兰和家庭内部表现性,最近展示了通过使用一个NGS-based分析患者的早发性痴呆(12]。例如,TREM2基因,编码小胶质脂质传感器,与几个因素参与脂肪的新陈代谢,可以减少痴呆的发生阈值(33]。这意味着TREM2突变会导致一个异常的先天免疫细胞信号,导致一些神经退行性途径提升和传播(12),包括那些参与FTD和PD-dementia [32]。

早发性情况下似乎还与罕见变异或风险等位基因相关联,可以帮助相关基因型和表现型。总的来说,这些发现加强使用外显子组/整个门店的方法,刺激更大的样本和研究候选基因的扩展板。在特定情况下病人携带的广告入库单突变,由于错义突变不影响progranulin的水平,致病作用似乎是不可能的。然而,正如没有执行功能的研究,我们不能排除致病作用除了“丧失功能”,被这个基因涉及诸多病理生理学机制中导致广告(12]。

NGS-based专门设计的重测序面板使用在我们的研究中已经被证明是一个快速、准确诊断传感器并联平行筛选的一些神经退行性基因,从而使识别特定疾病风险标记和潜在的重叠在最常见的痴呆疾病的途径。此外,在图书馆准备后,我们可以分析基因数据24样本在不到30 h。

最后,目标总会在面板数据可以提供进一步的见解的基因与神经可塑性和小胶质神经发生。特别是,一个有趣的一些诱发基因表达式之间的关系和突触形态学和神经可塑性的变化最近被确认。例如,应用程序基因家族和其产品能够调节海马长期可塑性现象(34),以及小胶质TREM2基因可能参与突触的损失取决于广告阶段(35),而CHMP2基因调节突触可塑性在树突棘36]。因此,基因的研究铺平了道路在活的有机体内和“实时”功能评价皮质电路使用无创性脑刺激技术(上司)37- - - - - -39]NIBS-related神经生物学的后遗症,甚至(基因激活/监管,新创蛋白表达,形态变化,内在的发射特性的变化和修改网络活动改变了抑制,造成稳态过程和神经胶质功能)(40- - - - - -42]。患者诱发突变,基因研究结果,结合临床、认知心理,neuroradiological,和电生理数据,将允许采取预防性策略发生前症状的阶段,开始以来治疗疾病的早期阶段(43- - - - - -46)和多维监测疾病进展(47,48]。

4.2。限制

本研究的主要限制是它的小样本大小,排除了数据泛化和进一步的结论,因此,它应该被认为是初步的。

尽管它的效率和速度,挥动方法有一定的局限性。其中一个是传感器不能发现小说疾病位点,只因为它捕获在选定的基因变体和相关的外显子。另一个限制是它不能捕获multinucleotide在基因重复扩张,然而,限制,描述所有门店平台(49]。实际上,当前门店的检测方法不能帮助一些神经疾病,如亨廷顿氏舞蹈症,弗里德希氏共济失调,脆性X综合征、肌强直性营养不良,和一个子集的脊髓小脑的共济失调(诊断不包括在本研究),这是由于multinucleotide重复扩张(50,51]。进一步的研究,针对新的突变基因的识别除了那些外显子描述或位于传统拼接网站是必要的。

第三个局限性在于基因外显率和表现性的修饰基因不同,等位基因变化,环境因素,而复杂的环境和遗传交互,因此解释,至少在某种程度上,这些患者中观察到的表型差异。另一个需要注意的是,在网上分析需要谨慎处理和进一步的证据在临床和诊断设置预测每个变体产生的影响需要拒绝或支持新变体的致病的作用在日常临床实践(30.]。

最后,正如通常观察到在这种类型的研究中,基因变异在晚发性疾病的致病性通过隔离机制的变体在家庭中很复杂,经常挑战不同的原因(例如,不可用DNA从病人的父母或晚发型的临床表型在其他家庭成员,如兄弟姐妹或表兄弟姐妹)。在目前的研究中,排序不执行的家庭成员四个痴呆家族史的患者,因此,我们无法验证是否影响亲戚运营商相同的变异。验证痴呆的风险多基因变异所扮演的角色需要的实现系统筛查在几个dementia-associated罕见和常见变异基因和前瞻性队列中。

尽管上述限制和神经退化过程的复杂性和发展,我们可以发现一些罕见变异有可能,但不是绝对肯定,疾病协会,基于等位基因频率在普通人群和多个预测评分在网上软件。退化性疾病的病因通常是异构的,多种因素(如饮食摄入量,创伤性脑损伤,血管疾病,感染,或毒素暴露)可以赋予一个变量风险疾病发病和课程,这些遗传变异(尤其是小说变异)需要未来验证确定疾病的影响大小和贡献。特别感兴趣的是基因变异与多个疾病关联,因为它们可能提供线索的发展创新疗法。这进一步证实了确实有证据表明dementia-associated基因多效性的影响在不同的神经退行性疾病。

5。结论

尽管初步研究的价值和局限性,这里使用的“靶向基因”面板可能允许增加潜在痴呆症引起的变异和扩展的数量描述的临床特征与基因变异有关TREM2,CHMP2B,应用程序,入库单基因。总会在技术的开发和持续进步开辟了一个激动人心的窗口几种疾病的分子诊断由大量基因的突变引起的。转化,这种技术已经证明的可靠性和准确性,以及DNA测序成本显著降低,基于桑格相比,测试方法。NGS-based传感器和未来的应用程序的进一步复制这些实验数据将取代所谓的“gene-by-gene”的方法与“基因小组”战略提供有前途的观点在老年痴呆症和其他神经退行性疾病的诊断和管理。

数据可用性

作者声明,关于这个提交的所有数据完全中可用的手稿。

的利益冲突

作者宣称他们没有竞争的经济利益或个人关系可能出现影响工作报告。

作者的贡献

GL、FC和MV设计研究;MV, FIIC、MT和TM数据收集;FIIC、MT、RSS和MC解释数据;GL、FC、RB、TM和射频准备和修订后的手稿;MC, RB和射频进行文献检索;和RSS和射频收集资金。所有作者批准提交的版本和同意亲自负责相关作者的贡献,确保问题的准确性或完整性的任何部分的工作。朱塞佩•兰扎和弗朗西斯科·卡利同样导致了这项工作。

确认

我们要感谢Antonino Musumeci, Chiavetta,艾达Ragalmuto,安吉洛格洛里亚,罗赞娜加拉茨的技术贡献。这项工作已经部分支持的意大利卫生部“Ricerca Corrente”和“5千分率”资金。

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