中国一个DFNA9家族的大规模平行测序发现了COCH的LCCL结构域的一个新的错义突变

摘要

DFNA9是一种晚发、进行性、常染色体显性遗传的伴有前庭功能障碍的感音神经性听力损失，由co(凝血因子C同源)基因。在这项研究中，我们调查了一个中国家族分离常染色体显性非综合征感音神经性听力损失。我们在LCCL区域发现了一个错义突变c.T275A p.V92Dco在100名正常听力对照组中与疾病同时存在这种突变导致疏水缬氨酸被酸性氨基酸天冬氨酸取代。本研究的数据丰富了DFNA9的突变谱，提示了DFNA9突变筛选的重要性co与年龄相关的听力损失与前庭功能障碍。

1.介绍

听力损失是最常见的感觉障碍，每500名新生儿中就有一名受到影响，5岁以下儿童的听力损失发生率为2.7‰，青春期儿童为3.5‰[1，2］.HL是一种遗传和临床杂合性疾病，可根据遗传模式(常染色体显性、常染色体隐性或x -连锁隐性和线粒体遗传)、其他临床特征的缺失(非综合征)或存在(综合征)以及发病年龄(语前或语后)进行分类[3.］.迄今为止，研究人员已经确定了98个与非综合征性听力损失(NSHL)相关的基因(遗传听力损失主页，http://hereditaryhearingloss.org）.常染色体显性基因座的大多数突变导致舌后听力障碍[4］.

突变coDFNA9是导致前庭功能不全外显率晚发进行性ADNSHL的基因[5］.COCH基因编码一种550-aa的细胞外蛋白耳蜗蛋白，它是人类和小鼠内耳中最高表达的蛋白[6］.cochlin氨基酸序列包含一个n端信号肽，一个与因子C高度同源的LCCL结构域，一个参与免疫应答的丝氨酸蛋白酶鲎，以及两个von Willebrand因子A (vWFA)域[7］.到目前为止，在LCCL结构域、vWFA结构域和中间结构域发现了23个DFNA9突变[8- - - - - -15］.DFNA9患者表现为晚发进行性HL，通常在第4或第5年之前发病[16］.HL发病初期为高频率，逐渐发展为低频率，通常在60岁时导致严重的HL。COCH突变还会导致许多患者前庭功能障碍和平衡问题[16］.

在这项研究中，我们对一个非血缘的中国家族分离常染色体显性感音神经性HL进行了大规模的平行测序，并在LCCL结构域发现了一个新的错义突变。

2.结果

2．1．临床表型

G405家族中有7人经耳科和听力测量分析诊断为感音神经性听力损失(图)1(一)）.受影响的家庭成员表现出中度至严重的双侧感觉内听力损失最初影响高频，随着年龄的增加，发展到中低频，导致平坦或向下倾斜的听力图（图1 (b)）.自述的听力损失发病年龄是在第二或第三十岁。除VI:12外，所有受影响的家庭成员均报告或诊断有眩晕、头晕和耳鸣。

2．2．大规模并行测序

针对131个耳聋相关基因的靶向MPS应用于G123家族先证者。平均深度覆盖176个，10个以上阅读覆盖目标基地98.6%以上。使用前面描述的策略调用和过滤变量。简单地说，过滤掉满足以下条件的变异:(1)测序reads小于10个的变异;(2)内含子变体和同义变体;(3) 1000个基因组数据库、ESP6500数据库或ExAC数据库中等位基因频率在0.01以下的变异。因此，COCH突变c.T275A p.V92D (NM_001135058)是唯一通过所有过滤步骤的候选变异。

２．３．突变分析

通过Sanger测序进行候选变体的分离分析。新型Coch突变C.T275A：P.V92D（NM_001135058）（图2(一)在所有受影响的个人身上都有，但在40岁以上的正常家庭成员身上没有。这一突变导致了耳蜗蛋白LCCL结构域的氨基酸替换。不同物种COCH的序列比对分析表明，该氨基酸具有高度保守性(图)2(b))。四个计算程序预测这种突变是有害的(图)2(c))。然后，我们扫描的外显子4co基因在100个无关的中国控制人员中。因此，没有检测到变体。

3.方法

３．１．研究对象与临床诊断

来自中国上海复旦大学附属眼耳鼻喉科的中国非近亲家庭，G405，患有迟发进行性听力损失。G405家族有五代人，通过耳科和听力测量分析分离出晚发常染色体显性感音神经性听力损失。招募了25名家庭成员，包括7名受影响的个人。应用耳镜和纯音测听(包括频率从250到8000赫兹)来识别表型。通过热量试验和眼震电图对部分家庭成员的前庭功能进行了评估。研究人员从参与者身上抽取了血液样本。根据复旦大学伦理委员会的规定，所有参与者均须获得书面知情同意。

３．２．大规模并行测序

采用基因组DNA分离试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从全血中提取基因组DNA。根据制造商的协议，使用TruSeq Exome Enrichment Kit进行外显子组捕获。捕获的文库加载到Hiseq2000平台上，进行100 bp的配对端测序，为每个样本提供至少80倍的覆盖率。原始图像文件由Illumina的木薯管道处理，使用默认参数进行基调用。G123家族的先证者接受了包含131个耳聋基因的基因检测。由Otogenetics Corporation (Norcross, GA)在HiSeq2000 (Illumina)上对131个耳聋基因的侧边内含子序列进行了编码外显子+ 100 bp的捕获和MPS分析。总共3个μ.G基因组DNA被用作NimbleGen捕获方法的输入材料，以产生2×100对末端读数。使用挖掘机轮车对准器（BWA）程序对准读取读取读取与人参考基因组（HG19 / NCBI 37），使用基因组分析工具套件（GATK）软件和Picard精制。使用GATK统一的基因液鉴定目标区域中的基因型;重新校准变体的质量评分。anchovar进行变体的功能注释[17］.

３．３．突变分析

在G405家族可用成员中进行PCR分离，然后对扩增片段进行双向Sanger测序(ABI 3730XL;应用生物系统公司，福斯特市，CA)。此外，研究人员还对100个听力正常的种族匹配样本进行了序列分析。

4。讨论

在本研究中，我们在一个患有迟发进行性感觉神经性HL和前庭功能障碍的中国大家族中发现了一个位于cochlin LCCL域的新杂合错义突变。这些突变与疾病共分离，并没有在公共数据库或100个种族匹配的对照中观察到。

本研究发现的p.V92D突变位于cochlin的n端LCCL结构域，导致疏水缬氨酸被酸性氨基酸天冬氨酸取代。该结构域的突变已被证明以显性负性方式引起耳蜗蛋白的错误折叠和聚集，并导致细胞毒性[7，16］.值得注意的是，大多数患者在LCCL结构域中携带突变表现出前庭功能障碍。我们的研究支持这种基因型表型相关性，因为几乎所有受影响的家庭患者G405都表现出前庭功能障碍。

DFNA9突变的致病机制尚未完全揭示;最近的研究表明了几种可能的机制。几项研究表明，LCCL结构域中的突变诱导错误折叠的LCCL结构域，并表明细胞毒性导致内耳损坏[6，18］.另一些研究表明，突变的cochlin形成了一种对还原剂敏感的稳定二聚体。突变型cochlin可以稳定野生型cochlin的二聚体构象，为DFNA9突变的显性性质提供了可能的解释[19］.最近的一项研究表明，耳蜗中的氨基酸替换降低了耳蜗对凝集酶诱导的裂解酶的敏感性，从而导致LCCL结构域向细胞外腔的分泌减少[8］.我们研究中的p.V92D突变也可能导致cochlin错误折叠。

综上所述，我们的发现丰富了DFNA9的突变谱和基因型表型相关谱，提示了COCH突变筛查在迟发性听力损失合并前庭功能障碍中的重要性。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

仙东古，温岭苏，明兰唐，罗国源同样贡献了这项工作。

致谢

国家重点基础研究发展计划项目(no . 2016YFC0905200, no . 973 2015CB965000);国家自然科学基金项目(no . 81470687, no . 81230019, no . 81500801);上海市科委建设项目(no . 12DZ2251700);厦门市科技计划项目(3502z2014013)。

参考

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