激活的哺乳动物雷帕霉素靶延髓吻腹内侧有助于维护神经大鼠创伤性神经性疼痛

文摘

哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR) serine-threonine蛋白激酶,将细胞外的信号,从而调节多种生理和病理过程,包括疼痛。先前的研究已经表明,雷帕霉素(mTOR抑制剂)可以减弱疼痛的行为在许多疼痛模型中,最有可能在脊髓水平。然而,mTOR的机制在脊椎上的层面,特别是在延髓吻腹内侧的水平(RVM),尚不清楚。因此,本研究的目的是阐明mTOR的作用区,一个关键继电器地区下行疼痛控制通路,神经性疼痛的条件下。磷酸化mTOR主要是表现在血清素激活的沿着脊骨投射神经元和显著增加了RVM幸免神经损伤后——(SNI)引起的神经性疼痛。此外,在SNI鼠大脑切片中,雷帕霉素灌注两种振幅下降而不是自发兴奋性突触后电流的频率和数量的减少在血清素激活的神经元动作电位。最后,intra-RVM显微镜下注射的雷帕霉素建立有效地缓解机械触诱发痛但未能影响神经性疼痛的发展。总之,我们的数据提供强有力的证据的作用mTOR RVM的神经创伤性神经性疼痛,指示一个新颖的机制mTOR inhibitor-induced镇痛。

1。介绍

延髓吻腹内侧(RVM)是一个重要的继电器,有助于降疼痛控制通路从中脑导水管周围灰质(PAG)表面的薄层(脊髓薄片I和II) (1,2]。众所周知,下行RVM持久的激活密切相关的控制电路,包括下行便利化,大大有助于持续发展的组织和神经损伤引起的疼痛(3]。尽管许多研究都集中在这一地区,下行便利化疼痛控制的细胞和分子机制仍知之甚少。

由于下行疼痛便利化通路的作用,几种类型的伤害,如组织和神经损伤,往往成为长期和持久的4),最终导致神经性疼痛。神经性疼痛会损害生活质量和征收高昂的社会成本。到目前为止,已经取得了显著的进展在基础和临床研究;然而,目前治疗神经性疼痛仍然不足,和搜索不仅持续改进治疗新靶点。

哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)守恒serine-threonine蛋白激酶抑制的有效临床免疫抑制剂雷帕霉素,在应对各种细胞外信号调节几个细胞内过程,从而调节信使核糖核酸的翻译。因此,mTOR中扮演着一个关键的角色在长期的可塑性和记忆过程的调制5- - - - - -7]。激活mTOR复杂的蛋白质猛禽(mTORC1)促进mTOR的磷酸化下游目标,包括真核起始因子4 e结合蛋白质(4 e-bp1/2)和S6激酶(S6K),这可以进一步导致当地的蛋白质合成。据报道,删除4 e-bp1/2或S6K基因在小鼠结果在突触可塑性的赤字和长期记忆8,9]。此外,磷酸化mTOR (p-mTOR)活化的形式,在周围神经系统调节以及在脊髓水平在几个疼痛模型(10- - - - - -15]。脊髓抑制mTOR囊内的政府已经被证明是有效地减轻疼痛条件下动物的疼痛的行为(10,11,16,17]。突触可塑性的变化在慢性疼痛不仅可以发生在脊髓水平也在脊椎上的层面,包括数位视讯。因此,考虑RVM下行痛苦便利化的重要作用,针对mTOR RVM的对抗疼痛可能是一种有前途的方法。

因为血清素激活的(5-HTergic)神经元的主要组成元素区,可以发送预测表面的脊髓背角(SDH) [18- - - - - -20.),我们因此假设5-HTergic沿着脊骨RVM包含mTOR投射神经元,激活又会增加5-HTergic神经元的兴奋性,从而可以有效地加强下行便利化疼痛控制通路和夸大神经性疼痛的条件。

因此,我们使用了神经损伤(SNI)模型来评估的角色mTOR RVM的神经性疼痛的老鼠。

2。材料和方法

2.1。动物

成年男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(重250 - 290克)被用于本研究。动物实验的伦理委员会第四军医大学(西安,中国)批准了动物实验(许可证号码:10071)。所有程序都同意IASP指南(21]。是努力减少实验用动物的数量,他们的痛苦。

2.2。SNI模型的建立

SNI行手术之前报道(22,23]。简单地说,老鼠与戊巴比妥麻醉(45毫克/公斤,i.p。),和三个分支的坐骨神经被直接暴露的切口的皮肤和一段左大腿股二头肌肌肉。胫骨和腓枝子被小心翼翼地tight-ligated以丝绸缝合线和分段远端结扎,删除2 - 4毫米远端神经的树桩。在两层肌肉和皮肤被关闭。sham-operated组的手术相同的SNI集团除了神经没有损伤。

2.3。行为测试

机械触诱发痛行为SNI-induced神经性疼痛的迹象,通过测量评估50%爪子撤军阈值(佩恩表的编制者)如前所述24]。50%的佩恩表的编制者应对一系列提升·冯·弗雷丝(美国WI Stoelting,基尔)是由上下法(25]。冯·弗雷力是垂直的足底表面后爪2到3秒。突然撤军后的爪子在刺激被记录为一个积极的回应。佩恩表的编制者50%是使用以下公式计算:。机械触诱发痛评估通过测量50%佩恩表的编制者的身体的同侧的后爪在SNI或sham-operated老鼠。

后爪的热痛觉过敏测试中描述一个以前的报告26]。表面辐射热源集中在足底的后爪。测量爪撤军的延迟(PWL)获得使用一个计时器是由激活的热源和停止当撤军的爪子用光电探测器检测到。三个测量PWL后爪子和平均为每一个测试的结果。身体的同侧的后爪测试之间的间隔超过5分钟连续测试。

2.4。神经束跟踪

Fluoro-gold (FG)被用作逆行示踪标记区神经元SDH项目。FG注入程序本质上都是一样的在我们先前的研究[20.,27]。简而言之,暴露腰绳后,0.1μL FG的4%解决方案(美国丹佛市荧光染料)溶解在0.9%盐水stereotaxically注入的左侧腰背角微量调节注射器连接到一个玻璃微量吸液管的压力注入。由于交通的示踪剂,老鼠被允许恢复和存活7天。

灌注后,老鼠的脑部和脊髓切成块。的部分被用来评估SDH的FG注射部位的分布模式以及逆行FG-labeled RVM在数字化的显微镜下观察神经元(BX-60;奥林巴斯、东京、日本)使用一个合适的滤波器FG(励磁350 - 395海里;排放430海里)。

2.5。插管注入和显微镜下注射区

大鼠麻醉后与戊巴比妥(45毫克/公斤,i.p。),26-gauge不锈钢引导插管stereotaxically植入一个网站上面区(10.52毫米后,前囱0毫米从中线侧,和头骨的表面下10.20毫米)。老鼠有一个星期插管注入后恢复。Intra-RVM显微镜下注射是通过一个33-gauge注射器针插管降低0.5毫米深入脑干比引导插管。的显微镜下注射装置由汉密尔顿注射器(10μL)连接到一个注射器(33-gauge)一层薄薄的聚乙烯管和一个电动注射泵。雷帕霉素(250μ米/ 1μL,溶解在盐水/ DMSO溶液混合组成25% DMSO, Tocris生物科学、明尼阿波利斯、锰、美国),mTOR的特定抑制剂,被注入到0.1 RVM的速度μL /分钟;同等体积的25% DMSO作为车辆。注射后,显微镜下注射针替代了至少2分钟。注射部位是验证结束时所有的尼氏小染色实验,和注射部位RVM地区被排除在研究之外。老鼠的总数显示成功的植入目标是28。

这些老鼠被随机分为两组设计用于不同的目的,如图6 (c):组1:探讨雷帕霉素能否影响SNI-induced神经性疼痛的诱导阶段,行为测试之前执行第一个药物注射或车辆,其次是SNI (Pre-SNI)和30分钟后第二次注射后1天SNI (SNI-D1)(图6 (c),顶部)和组2:行为测试之前执行SNI (Pre-SNI), 6天后SNI (SNI-D6), 30分钟后药物或载体注射后7天SNI (SNI-D7)为目的的演示的雷帕霉素的作用在维护阶段SNI-induced神经性疼痛(图6 (c),底部)。

2.6。Immunofluorescent组织化学染色

150毫升的老鼠灌注transcardially 0.01磷酸盐(PBS, pH值7.4),其次是500毫升的4%多聚甲醛在0.1 M磷酸盐缓冲剂(铅、pH值7.4)。脑干和/或脊髓横着切成厚25毫米日冕部分使用冷冻切片机(CM1950,徕卡、海德堡、德国)。

Double-immunofluorescence染色p-mTOR / NeuN p-mTOR / FG,或p-mTOR / 5。这里使用的所有抗血清如表所示1。部分的顺序与初级抗血清在室温下孵化0.01 PBS含有5%正常驴血清(NDS),南Triton x - 100 0.3%, 0.05%₃,0.25%角叉菜胶(PBS-NDS, pH值7.4)24小时。然后,部分是孵化fluorescein-labeled免疫球蛋白(二级抗血清)6 h。消极的控制实验,主要的抗血清被省略,肽试验都进行竞争。未发现immunopositive产品。

免疫荧光组织化学染色后,部分观察和图像捕获使用共焦激光扫描显微镜(样品形貌,FV1000,奥林巴斯)。数字图像捕获使用FLUOVIEW软件(奥林巴斯)。

显微图10 - 12节/老鼠,150年μ9.30米内分开前囱−−11.60毫米,p-mTOR表达进行了分析。使用ImageJ软件,RVM区域,包括中缝核马格纳斯(RMg)和原子核网状带gigantocellularis帕尔斯α概述了基于尼氏小染色。p-mTOR-positive细胞区域内被数由一个手动盲法治疗条件。相同的计算方法被用来评估coexpression 5 / p-mTOR以及p-mTOR / FG在区。细胞可见绿色细胞质染色代表5-HTergic或FG-labeled细胞,而红染色代表p-mTOR-positive细胞;因此,与5 -或FG双标记细胞p-mTOR出现黄色。

2.7。大脑切片制备

老鼠被斩首,大脑切片(400毫米)包含数位视讯被削减在0°C vibratome (VT1200s徕卡)蔗糖切削液包含以下(毫米):2.5氯化钾,不₂阿宝₄1.2,NaHCO₃252年26岁的蔗糖,MgSO₄h·7₂CaCl O 6日₂0.5、10和葡萄糖都洋溢着95% O₂/ 5%股份有限公司₂(pH值7.4)。电生理学的研究,大脑切片被转移到一个水下复苏室含氧人工脑脊液(ACSF)包含以下(毫米):124年氯化钠,氯化钾2.5,MgSO₄h·7₂O 2,不₂阿宝₄1,NaHCO₃25日,CaCl₂2,葡萄糖37在室温下2小时后记录。生化实验,片是缓慢带来的最终温度30°C ACSF加油O为95%₂/ 5%股份有限公司₂和孵化前至少1小时的实验。大脑与雷帕霉素(250片治疗μ米)和车辆30分钟。随后,RVM地区microdissected和snap-frozen干冰。

2.8。免疫印迹分析

标准的免疫印迹协议后,老鼠麻醉过量戊巴比妥(60毫克/公斤,i.p。),RVM地区为西方墨点法仔细解剖和收获。获得总蛋白提取,组织在300年被细胞溶解μL裂解缓冲包含10毫米三、150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 0.5% NP-40, 1毫米EDTA在pH值7.4。样品充分混合在100:1 (v / v)蛋白酶抑制剂比鸡尾酒和磷酸酶抑制剂(美国亚利桑那州图森市罗氏公司)。的程序在体外注入大脑切片组织的类似协议。样本储存在免疫印迹分析−80°C。然后,30μg细胞溶菌作用的材料(定量测量使用BCA蛋白质分析;美国热科学,罗克福德,IL)解决了钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到PVDF膜(Immobilon-P,微孔)。在脱脂牛奶1 h阻塞后,一夜之间,细胞膜被孵化在4°C以下主要抗体:兔子anti-mTOR(1: 1000年,细胞信号技术);兔子anti-p-mTOR(1: 1000年,细胞信号技术);兔子anti-S6K(1: 1000年,细胞信号技术);兔子anti-p-S6K(1: 1000年,细胞信号技术);和鼠标反β肌动蛋白(σ1:5000年,圣路易斯,密苏里州,美国)。免疫印迹被反应与相应的辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(anti-rabbit 1: 5000年,anti-mouse 1: 5000;美国新泽西Amersham法玛西亚生物技术,皮斯卡塔韦)。所有的反应都是增强化学发光检测到的(ECL)检测方法(Amersham)和暴露于电影。扫描图像与ImageJ量化和分析软件。靶蛋白水平正常化β肌动蛋白水平和表达为褶皱变化相对幼稚的对照组。

2.9。电生理学

神经元RVM地区针对记录使用立式显微镜配备蔡司(从、德国)infrared-differential干涉对比(IR-DIC)光学、40×水浸的目标,和一个视频影像相机。补丁吸管充满了细胞内的解决方案包含以下(毫米):130年K-gluconate,氯化钠,氯化钾,EGTA 0.4,消息灵通的10,Mg-ATP 4和0.2 Tris-GTP, pH值7.25 - -7.35,290 - 300 mOsm / L的渗透压。吸管电阻,测量在浴缸里,是典型的MΩ。电压−举行60 mV,神经元有至少3分钟稳定之前收集的数据。自发放电和动作电位的数量被用来调查SNI-induced RVM的神经元兴奋性的变化。最初的访问阻力是15 - 30 MΩ监控在整个实验过程。数据被丢弃,如果访问阻力实验改变了> 15%。数据过滤1 kHz和数字化10 kHz。

2.9.1。自发放电

兴奋性突触后电流(EPSCs) RVM 5-HTergic神经元,AMPA受体介导的(28),在−voltage-clamped并记录60 mV b轴突700放大器(分子器件、桑尼维尔,美国)阻断gaba ergic传输后苦味毒(100毫米,σ),受体拮抗剂。

2.9.2。穗数

细胞膜的兴奋性神经元记录测量current-clamp模式通过确定动作电位的数量引起的细胞内注入0,10、20、30、40、50、60 pA去极化电流为400 ms。数量飙升决心估计雷帕霉素对记录的神经元的影响。

在所有情况下,生物胞素(0.5%)被引入细胞内解决识别记录神经元的形态学特性。立即记录后,大脑切片被固定在4%多聚甲醛在室温下0.1 PB 4 h。然后,部分与3%过氧化氢冲洗30分钟0.01 PBS。与PBS彻底清洗后,组织孵化了一只山羊anti-5-HT(1: 500年,Immunostar)抗体在PBS-NDS 24 h (pH值7.4),其次是孵化,Alexa 594卵白素D(1: 1000年,英杰公司)和Alexa 488驴抗体(1:500年,英杰公司)抗体在PBS 6 h在室温下。被观察到的部分,用共焦显微镜和图像捕获(奥林巴斯)。

2.10。统计分析

统计数据计算使用GraphPad棱镜5软件。表示为均值±SEM的结果。双向方差分析与Bonferroni多个测试或单向方差分析比较图基的事后多重比较测试被用于团体之间的比较(例如,免疫印迹数据与手术和药物管理局主要影响)。学生的搭配以及用于分析两组之间的差异(例如,p-mTOR-positive数量的细胞之间的差异SNI-induced神经性疼痛组和虚假的组)。值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。避免神经损伤产生显著机械触诱发痛而不是老鼠的热痛觉过敏

避免神经损伤(SNI)产生疼痛的反应增加无害的机械刺激(身体的同侧的后爪的机械触诱发痛)的老鼠从最早post-SNI操作第一天,这效果保持至少2周(图1(一))。然而,SNI没有影响延迟撤军的辐射热刺激(无热痛觉过敏)(图1 (b))。事实上,我们目前的数据是一致的与以前的报告证明低机械阈值由SNI甚至持续9周后手术,但是没有报道减少辐射热的后爪延迟撤军刺激(23]。

3.2。p-mTOR完全表达在神经元内区

通过使用double-immunofluorescence染色,我们发现mTOR的活化形式,p-mTOR, RVM表达,表达的是完全基于观察到神经元与NeuN p-mTOR几乎完全与神经元的标记,在老鼠的骗局(数字2(一个)- - - - - -2 (c)(数据)和post-SNI天7组2 (d)- - - - - -2 (f))。

3.3。RVM mTOR信号通路的SNI后明显激活

我们发现p-mTOR-positive神经元的数量显著增加了RVM SNI相比虚假的组后7天(数字2(一个),2 (d),2 (f)),这表明mTOR的激活区可能导致SNI-induced神经性疼痛。

据报道,S6K mTOR的主要下游底物,参与了几个细胞内过程,包括神经可塑性和长期记忆17]。因此,我们用免疫印迹分析来进一步评估mTOR信号通路,包括mTOR和S6K RVM SNI之后。与天真的控制老鼠相比,磷酸化mTOR和磷酸化的表达S6K (p-mTOR和p-S6K)虚假的老鼠没有明显改变(数字2 (h),2(我),2 (k))。显示在图2 (h),p-mTOR p-S6K明显升高SNI RVM 3天后,磷酸化是保持至少14天相比,对照组(数字2 (h)和2(我);p-mTOR: SNI D3:;SNI D7:;SNI D14:倍天真的控制,;p-S6K: SNI D3:;SNI D7:;SNI D14:倍天真的控制,,)。p-S6K的变化在p-mTOR相似,表明mTOR RVM的信号通路激活SNI手术后3天。与天真的对照组相比,p-mTOR和p-S6K表达略上升,但没有发现显著差异在SNI后1天(数字2 (h),2(我),2 (k),p-mTOR: SNI D1:倍天真的控制,;p-S6K: SNI D1:倍天真的控制,,)。总mTOR和S6K没有改变在任何团体在目前的研究数据2 (h),2 (j),2(左))。总之,这些数据表明,mTOR信号通路,包括mTOR和S6K区被激活,这可能表明新的蛋白质合成和可能导致神经可塑性的变化。

3.4。大多数沿着脊骨投射神经元RVM p-mTOR表示

注射FG腰椎SDH(图3(一)和3(b))导致许多逆行标记沿着脊骨投射神经元在区(图3(d))。虽然FG是单方面注入(左)腰椎SDH, 81.9%(203/248)的逆行标记沿着脊骨投射神经元包含p-mTOR-immunoreactive (IR)染色(数字3(c) -3(e)),这表明,超过四分之三的沿着脊骨投射区神经元表达p-mTOR。

3.5。调节与5-HTergic p-mTOR主要是与神经元在SNI老鼠

因为5-HTergic神经元曾被证明参与下行疼痛控制途径,特别是局部区,我们进一步研究了5 -和p-mTOR之间的关系。我们的免疫荧光染色结果表明,多数p-mTOR-IR神经元包含5 -(数字4(一)- - - - - -4 (f))。5-HTergic神经元的数量略增加在SNI RVM的老鼠,但没有统计学意义发现骗局相比对照组(每节SNI D7组与 虚假的对照组,老鼠/组,)。有趣的是,5-HT-positive p-mTOR-IR神经元在SNI RVM 7天后显著增加而虚假的老鼠(图4 (g))。相比之下,5-HT-negative p-mTOR-IR神经元没有显著改变SNI(图后7天4 (h))。这些结果表明,SNI-induced神经性疼痛引起大量upregulation p-mTOR,它们主要发生在5-HTergic RVM的神经元。

3.6。雷帕霉素注入迅速减少Upregulation p-mTOR和p-S6K RVM的大脑切片在体外

此前报道,雷帕霉素是一种特定和mTOR的有效抑制剂。探讨雷帕霉素的抑制作用在体外,我们孵化大脑切片包含与雷帕霉素(250区μ米)30分钟。此后,RVM地区被西方墨点法收集和评估。我们发现SNI显著增加的表达p-mTOR及其下游底物p-S6K(图5(一),p-mTOR: SNI D7 +车辆:倍的假+车辆,;p-S6K: SNI D7 +车辆:倍的假+车辆,,),这是与我们的组织免疫印迹数据不一致。此外,雷帕霉素(250μ米)显著逆转upregulation p-mTOR以及p-S6K 30分钟后药物输注(p-mTOR: SNI D7 +雷帕霉素:倍天真的控制与SNI D7 +车辆:倍天真的控制,;p-S6K: SNI 7 d +雷帕霉素:倍天真的控制与SNI D7 +车辆倍天真的控制,,),这表明雷帕霉素SNI后能迅速抑制mTOR的激活在体外。

3.7。5-HTergic区神经元的兴奋性大大增加在SNI老鼠,它可以有效地削弱雷帕霉素通过突触后机制

进一步调查5的神经元兴奋性和雷帕霉素在RVM 5-HTergic神经元的影响,我们进行了全细胞膜片箝记录。共有60 5-HT-positive神经元()从12老鼠被引入生物胞素结合5 -免疫荧光染色(图5(b))。此外,5-HTergic神经元的膜的特点是完全不同的。他们表现出相对较高的膜电容(Cm)和一个较小的膜电阻(Rm)与其他小神经元RVM相比,表明他们有一个更大的膜表面和小电阻。

我们首先研究了自发兴奋性突触后电流的频率和振幅(sEPSCs) RVM神经元。大部分的神经元5-HTergic记录区对雷帕霉素的活动就会增加。与先前的报道[不一致29日),的频率和振幅sEPSCs SNI后显著增加(数据5(c) -5(f)),这表明突触前释放发射机的概率和突触后神经元的兴奋性,分别是升高的。随后,我们使用雷帕霉素(250μ米)来评估是否增强突触前和突触后兴奋性可能会逆转。我们发现振幅(基线,pA;雷帕霉素,pA。,,配对以及),而不是频率(基线,赫兹;雷帕霉素,,,,配对以及),sEPSCs被雷帕霉素抑制应用在老鼠SNI而不是虚假的控制老鼠(频率:基线,赫兹;雷帕霉素,赫兹。,,配对以及;振幅:基线,pA;雷帕霉素,pA。,,配对以及)(数据5(c) -5(f))。这些结果表明,雷帕霉素可以减少5-HTergic神经元的突触后兴奋性在SNI后区。

我们下一个雷帕霉素的影响相比5-HTergic神经元的动作电位和确定的SNI后记录的神经元数量明显增加(数据5(g)和5(h))。雷帕霉素(250μ米)并没有改变的数字记录神经元的虚假的集团(,,,双向重复测量方差分析(图)5(g))。然而,在雷帕霉素,5-HTergic神经元数量的飙升SNI组显著降低(,,,双向重复测量方差分析(图)5(h))。这些结果表明,雷帕霉素抑制5-HTergic神经元的兴奋性神经性疼痛条件下区。

3.8。显微镜下注射的雷帕霉素RVM强有力地减轻机械触诱发痛在维修但不SNI-Induced神经性疼痛的感应

我们初步研究了上述SNI老鼠疼痛的行为。与之前的报道相一致(22),重大机械触诱发痛而不是热痛觉过敏是目前的研究(图中观察到1)。在此基础上观察,我们下一个使用机械佩恩表的编制者,而不是热PWL评估疼痛的行为。

确定雷帕霉素可以防止机械触诱发痛的感应阶段的发展,我们通过套管microinjected雷帕霉素植入区(数据6(一)和6 (b))立即SNI手术前和在SNI后第一天,由行为测试后30分钟后(图6 (c))。与雷帕霉素治疗后,佩恩表的编制者在SNI +雷帕霉素组相比没有明显的变化,在SNI +车辆对照组在SNI(图后第一天6 (d)),这表明雷帕霉素不能缓解神经性疼痛引起的SNI在感应阶段。随后,我们研究雷帕霉素能否扭转既定的神经性疼痛。SNI后6天,老鼠表现出典型的疼痛的反应增加nonnoxious机械刺激(图6 (e))。与车辆对照组相比,机械触诱发痛后显著降低显微注射的雷帕霉素RVM SNI(图后7天6 (e))。因为我们的生化结果表明p-mTOR和p-S6K量增加后SNI(数字2 (h),2(我),2 (k)),因为雷帕霉素灌注进入大脑切片可以有效地扭转p-mTOR的调节水平和p-S6K(图5(一)),我们得出的结论是,雷帕霉素的作用在部分扭转机械触诱发痛施加通过mTOR信号通路的失活,从而减少兴奋性的5-HTergic沿着脊骨RVM投射神经元。

4所示。讨论

在当前的研究中,我们提供的第一个示范如下:(1)RVM地区mTOR表示,可以激活神经创伤性神经性疼痛;(2)该mTOR主要表达5-HTergic神经元,它主要包括下行疼痛控制通路;(3)激活的抑制mTOR恢复overexcitability 5-HTergic神经元正常;和(4)失活mTOR intra-RVM雷帕霉素显微镜下注射建立减轻痛觉过敏(神经性疼痛的废除在维护阶段),而不是影响开始启动(感应阶段)的神经性疼痛。这些发现表明,RVM的mTOR信号通路参与维护神经创伤性神经性疼痛,抑制mTOR RVM能有效地缓解神经性疼痛在SNI老鼠。

由于下行疼痛控制通路的重要性在哺乳动物2),许多研究已经阐明了机制这一重要途径。已经证明的封锁区活动与利多卡因产生条件性位置偏爱(CPP),与缓解疼痛,神经损伤模型,表明下行疼痛便利途径调节创伤性自发紧张性疼痛(30.]。魏et al。3)报道,选择性地消耗功能5 -表型RVM神经元shRNA干扰(RNAi)色氨酸hydroxylase-2 (Tph-2,病原反应酶的合成神经元5 -)减毒组织或神经创伤性触诱发痛和痛觉过敏。这一发现提供了强有力的证据,从RVM降5 -是一个重要的贡献者疼痛便利的开发过程中持续的疼痛。最近,利用optogenetic方法,optogenetic刺激Tph2-channelrhodopsin 2 (ChR2)转基因小鼠中减少机械和热痛阈值(31日]。然而,相比之下,一些研究显示相反的结果(32- - - - - -35),从区5 -对下行抑制通路很重要。这些有争议的观点关于是否RVM 5 facilitatory或抑制作用可能解释为5的不同亚型受体位于SDH,据报告。例如,5₃受体报告调解下行便利化和贡献对疼痛的敏感36),而五的激活₂受体可以加强甘氨酸释放抑制疼痛的SDH传输(35]。此外,一项研究也提供了证据表明,实验条件下疼痛,激活5 -₇受体导致脊髓antinociceptive效应(37]。在目前的研究中,我们发现5-HTergic神经元略,虽然不明显,神经损伤后增加。然而,这些5-HTergic神经元的兴奋性升高后SNI(图5)。雷帕霉素能有效地抑制5 - overexcitability从而减弱痛觉过敏(图6),这表明5区可能是参与下行神经创伤性神经性疼痛条件下疼痛便利途径。

在肿瘤(mTOR一直得到广泛的研究38),心血管疾病(39),和神经退行性疾病40,41]。最近,新兴证据表明,mTOR疼痛处理中扮演一个角色,它变得明显,mTOR是重要伤害感受的规定,在外围和脊髓水平(10- - - - - -17]。然而,到目前为止,还没有报告调查mTOR在脊椎上的水平及其在痛觉调制中的作用。在这里,我们提供了强有力的证据表明mTOR导致神经性疼痛增加RVM 5-HTergic神经元的神经兴奋性,因此更容易降疼痛便利化。

mTOR调节蛋白质翻译通过多种因素。4 e-bp1/2 S6K参与细胞生理学的规定通过蛋白质合成的调制(42]。4 e-bp1/2抑制cap-binding翻译起始因子之间的相互作用与其他伸长eIF4E因素,在翻译中是一个关键的管理过程。mTOR-mediated磷酸化4 e-bp1/2释放的抑制,使翻译起始继续。S6K-mediated磷酸化S6促进解除和翻译的起始子群mrna的5′末端oligopyrimidine束(上)mrna。前信使rna编码核糖体蛋白质和伸长因素1和2,在转化的重要控制(43]。在目前的研究中,我们发现p-mTOR和p-S6K水平明显升高后的数位视讯SNI(图2),这表明mTOR-mediated蛋白质翻译和合成增加。的调节p-mTOR主要是coexpressed 5(图4)。相比之下,5-HTergic神经元的数量略增加在SNI RVM的老鼠,但是没有发现统计学意义比虚假的对照组。因此,合成的5区可能不会明显增加。然而,通过使用补丁全细胞记录,我们发现5-HTergic神经元都兴奋异常,其振幅和频率明显增加,sEPSCs以及动作电位(图的数量5)。此外,雷帕霉素抑制只有振幅的频率,而不是sEPSCs(图5);我们因此建议5-HTergic神经元的突触后overexcitability,这主要取决于谷氨酸受体的增加,主要是由于mTOR的激活。据报道,mTOR信号可以加强AMPA的插入(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic酸)受体的突触后膜,导致长期势差(LTP) [44,45]。因此,收集到的数据从我们的免疫荧光染色和电生理学与先前的报道是一致的,表明mTOR的激活可能会导致增加AMPA受体及其插入到突触后膜,导致的神经元兴奋性升高5-HTergic RVM的神经元。

作为一种有效的免疫抑制剂,雷帕霉素广泛用于预防移植排斥反应。慢性治疗患者mTOR与疼痛的发病率增加相关(46,47),包括可能的开发复杂区域疼痛综合征(crp) [48,49]。其他动物研究也报告了类似的结果(50,51]。这些相互矛盾的结果可能是由于以下原因:(1)雷帕霉素或其类似物的药物浓度是不一样的在其他报告的抑制mTOR产生镇痛效应;(2)长期治疗可能会导致蛋白质或其他pronociceptive激活反馈信号分子;和雷帕霉素(3)鞘内政府(在脊髓水平)可能会扮演一个非常复杂的角色在痛苦中传播与未知的机制。

本研究使用intra-RVM,鞘内,雷帕霉素(250μM,行为测试前30分钟),这种治疗显著减弱疼痛的行为引起的SNI(图6)。此外,intra-RVM雷帕霉素治疗是有效的在7天之后SNI(神经性疼痛的维护阶段),但不是第一天在SNI(感应阶段)。行为药理数据表明,抑制mTOR RVM的后期阶段(维护阶段)神经性疼痛可能是有效的,即使疼痛已经建立。相比之下,抑制mTOR的区没有影响的发展(感应阶段)神经性疼痛。所有这些结果都符合我们生化数据显示,RVM p-mTOR不是第一天大大增强,但显示在SNI(图7天后显著增加2)。

结合我们当前的结果与先前的研究结果,我们得出结论,具体由雷帕霉素抑制mTOR区是一个很有前景的神经性疼痛的管理方式。这种效应可能通过失活发生5-HTergic沿着脊骨RVM投射神经元,这是需要降疼痛便利化。尽管如此,目前的研究也有一些局限性。由于缺少一个特定mTOR活化剂,扭转实验中mTOR的激活区,应产生或加强伤害感受,难以实现。此外,optogenetic方法以及转基因动物应该进一步介绍了RVM确认mTOR的作用,不仅在神经性疼痛还在炎症性疼痛。

5。结论

通过失活5-HTergic沿着脊骨投射区神经元,从而削弱下行疼痛便利,具体针对mTOR的激活区是一个很有前景的神经性疼痛的管理方式。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突的存在。

作者的贡献

李Zhi-Hua,剑王,Da-Yun冯,冯,禁止了同样工作。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(批准号81371239 Yun-Qing Li)和中国陕西省自然科学基础研究计划(批准号张2012 jm4040 Ting)。

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