调节加利福尼亚州^2＋/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II信号在海马谷氨酸乳渣期间的发信号延伸期间退出期间

摘要

停止每周一次口服苯并二氮杂哌拉齐泮（FZP）对大鼠的口服施用导致戒断后1天后的焦虑。FZP提取与含有均多Glua1的突触掺入相关αCA1神经元近端放射状体中的-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸受体(AMPARs)。2天后，/钙调素依赖的蛋白激酶II (CaMKII)磷酸化GluA1亚基，增加信道电导。继发于AMPAR增强，含有GLUN2B的N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARS），从突触密度（PSD）中选择性地除去CAMKII的已知结合伴侣。虽然已知突触CAMKII的激活涉及易位到PSD，但是可以从PSD中除去与NMDAR结合的CAMKII。为了区分这些可能性，使用Postembedded Immunogold电子显微镜的目前的研究在FZP戒断后2天后研究CA1层辐射瘤突脉冲中CAMKII信令的改变。这些研究表明，总量下降，但不是自磷酸化（) CaMKIIαCA1 PSD中的表达。在吸毒期间从PSD中除去Camkii-glun2b络合物可以作为极稳性机制，以限制Ampar介导的Ca1神经元过度兴奋性和苯二氮卓脱离焦虑。

1.介绍

加利福尼亚州^2＋/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（Camkii）是由四种酶同种型的组合组成的十二次全酶（α那β那γ,或δ）， 尽管α和β是神经元中表达的主要亚型[1]．全酶内的CaMKII分子在Thr处磷酸化相邻的酶²⁸⁶（或²⁸⁷非α在Ca的持续激活过程中^2＋/ cam [2，导致自治，加州^2＋-独立的CaMKII活动[3.]．这一特征允许CaMKII维持近期神经元活动的分子记忆，并且是活动依赖性长期增强(LTP)的关键组成部分，LTP是海马CA1神经元突触可塑性的一种形式，被认为是学习和记忆的基础[4.]．钙激活CaMKII后，CaMKII能从细胞内突触区转移到突触后密度(PSD)，从而赋予CaMKII分子记忆^2＋/凸轮及其随后的自磷酸化[5.那6.]．在LTP期间，CaMKII增强α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体[7.]通过Glua1亚基AMPAR磷酸化单通道电导[8.]．LTP过程中CaMKII的激活依赖于nmdar介导的Ca^2＋流入，而L型电压门控Ca^2＋慢性可卡因暴露后，通道(L-VGCCs)可能激活伏隔核中的CaMKII [9.那10]．此外，当L-VGCCs在停用苯二氮卓类药物后在CA1神经元中增强，并可能启动camkii介导的AMPARs增强[11-13]，苯二氮卓停药过程中CaMKII信号传导机制尚不清楚。

虽然苯二氮卓类是临床有用的抗焦虑，镇静剂 - 催眠和抗惊厥药，长期治疗可能导致物理依赖性的发展表现为焦虑，失眠，并且很少癫痫发作，限制了他们的临床益处[14]．苯二氮卓类药物的临床效应是通过抑制电流的变构增强介导的γ-氨基丁酸A型受体(GABA_一种Rs)，而目前的证据表明，苯二氮卓脱瘾症状与ampar介导的谷氨酸传递增强相关[11那15-18]．与CA1神经元的LTP机制类似，停用苯二氮卓(FZP)的大鼠也观察到AMPAR增强的颞叶模式。FZP停药1天后，由于GluA1同源性AMPARs突触后密度(PSD)的掺入，AMPAR电流振幅增加[13那18那33]．停用FZP后2天AMPAR电导增加^831.Camkii的Glua1亚基的磷酸化[13那19]．有趣的是，戒断后2天还观察到肿瘤电流的减少，通过从CA1 PSDS中除去含Glun1 / glum2b的Nmdars [20.]，将CA1神经元的总兴奋电流输出归一化，并阻止戒断焦虑的表达[16那19那21]．

Glun2B亚基是Camkii的重要结合伴侣α[6.那22]，而含有glun2b的NMDARs的去除可能会在FZP退出过程中改变CaMKII信号通路。我们实验室之前的研究发现CaMKII总量增加α从2天的FZP - 取出的大鼠中表达富含PSD的CA1匀浆，没有伴随的自磷酸化THR²⁸⁶-CaMKII (pCaMKII) [13]．虽然富含分级匀浆在PSD中，但其他非PSD亚细胞室也存在于均质中[18];因此，这是突触内的总和自动磷酸化的CAMKII表达的缺点。

为了更准确地了解FZP停药过程中CaMKII信号的潜在变化，目前的研究使用定量包埋后免疫金电镜(EM)来评估总和苏氨酸的定位²⁸⁶CA1不对称突触内的自磷酸化CaMKII地层辐射(SR)。研究结果显示CaMKII总量显著减少，但未显示自磷酸化αfzp停用2天的大鼠CA1 psd内。CaMKII的损失α这与FZP停药2天后GluN2B NMDARs的清除一致，可能是一种稳态机制，以限制AMPAR增强和FZP停药症状。

2。材料和方法

2.1。长期FZP治疗

涉及使用动物的所有程序是符合托莱多医学院制度畜牧业和使用委员会（IACUC）和国家卫生机构的所有程序。用相对水溶性苯并二氮杂卓FZP对大鼠的一周口服处理如前所述[16]．简而言之，雄性Sprague-Dawley大鼠（P22-25，Harlan，Indianapolis，In）适应2-4天至0.02％的糖粉。然后将大鼠提供含有FZP（pH5.8）的糖精水作为唯一的饮用来源。基于大鼠的体重，基于大鼠的体重，消耗的体积为100mg / kg /天的体积，持续3天，0.50mg / kg /天，4天。最终平均每日FZP剂量总是大于100mg / kg，一般为125-130 mg / kg，目的是实现120 mg / kg的最小平均剂量[20.]．与FZP及其在大鼠中的主要生物活性代谢物的口服生物利用度和半衰期(<12小时)有关[23]这种治疗范例导致脑苯二氮卓潜水平约为1.2 μM通过辐射体测定在大鼠脑匀浆中测量的m [24]．FZP治疗1周后，给予大鼠糖精水1 ~ 2天。FZP戒断1天后会持续导致类似焦虑的行为[11那16]，可在停药第2天被掩盖或表达，作为NMDAR下调的出现或逆转的功能[16那21]．匹配的对照大鼠在相同的实验期内提供糖精水。

2.2。用于Postembedding免疫电解电子显微镜分析的抗体

单克隆anti-CaMKIIα克隆6G9-2, Millipore, Billerica, MA, Cat。不。MAB8699)α蛋白质 [25那26]．该抗体检测到约50 kDa的条带，与CaMKII的分子量一致α，而在敲除小鼠的海马裂解液中未观察到条带[27，证实了它的特异性。多克隆抗pcamkii抗体，识别表位MHRQET(PO_4.）Vdclkkfn来自Promega（麦迪逊，Wi;猫。不。：v1111）。该抗体识别磷酸化^286/287可能是所有Camkii同种型[28那29]．当使用Camkii的小鼠的视觉皮质免疫细胞化学研究时，使用该抗体的标记显着降低αthr²⁸⁶变成丙氨酸[30.]．使用该抗体的预包埋免疫金pCaMKII标记也显示暴露于NMDA的海马培养物突触后标记增加[31]．为了检测这两种抗体的特异性，目前研究中使用的对照包括省略一抗，显示单独标记金偶联的二抗。此外，通过将一抗替换为另一抗来检测二抗的交叉反应。

２.３.包埋后免疫金电镜观察

目前研究中使用的超薄切片从相同的组织中切割，因为在CA1神经元不对称后突破的GLUN1和GLUN2A / B亚基研究中使用的组织中使用的组织[20.]．先前描述了对这些组织使用的转膜固定，低温和底层IMMUGOGold EM标记。简而言之，异氟醚麻醉大鼠与含氧血管漂洗的转套灌注，然后是4％多聚甲醛和0.5％戊二醛。海马切片（200或500 μm)被slam-frozen(−190°C, Leica EM CPC, Bannockburn, IL)， cryosubstitute，并平板嵌入低icryl树脂。超薄CA1切片(80 nm)在镍网格上收集，在0.1% Triton X-100 (TBST, pH 7.6)的tris缓冲盐水中平衡，在1% NaBH中淬火_4.和50毫米的甘氨酸，在10％正常的山羊血清（NGS）中堵塞，孵育在一抗抗体（1：20抗Camkiiα和/或1:10抗pcamkii与1%的NGS)在室温下2小时，然后在4°C过夜。组织转向pH值8.2 TBST,孵化0.5%聚(乙烯)乙二醇(挂钩),然后在二级抗体含有0.5%挂钩(1:25山羊anti-rabbit免疫球蛋白结合到10纳米金和/或1:25山羊anti-mouse免疫球蛋白结合15纳米金,BBInternational,英国)1.5人力资源。切片用5%醋酸铀酰和雷诺氏柠檬酸铅进行反染色。

采用Phillips CM10 PW6020透射电子显微镜扫描反应组织CA1近端SR区，随机识别不对称突触轮廓，这些突触被认为是谷氨酸突触，因为在CA1神经元中，包含谷氨酸的轴突突起比包含其他兴奋性神经递质的突起主要[32]．图像被放大了52,000倍。对阴性进行显像和扫描，然后使用Image Pro Plus软件(Media Cybernetics, Inc.， Bethesda, MD)测量免疫金标记，如前所述[20.]．在垂直于PSD的裂缝表面垂直于300nm的距离和后腹泻免疫树脂颗粒。Immunogold颗粒也被分配给PSD，有源区，蠕动，膜或细胞内隔室。如前所述，将PSD的20nm内（IMMunogold抗体复合物的近似尺寸的近似尺寸）计数为PSD标记[33];距突触前膜20 nm范围内的颗粒，而非距PSD膜20 nm范围内的颗粒，被认为属于活性区;距离膜20 nm以内的粒子被认为是膜结合的;突触后膜结合颗粒在PSD外侧100 nm内被认为是突触周[33]．所有的程序和测量都是在对实验组视而不见的情况下进行的。

2.4。统计分析

通过学生的对照和FZP撤出的群体比较各种突触隔室的各种突触隔室和免疫形颗粒的平均数量的百分比T.以及。通过双向重复测量(混合模型)方差分析对突触前和突触后的免疫金颗粒进行分析，并使用Bonferroni的多重比较检验对对照组和fzp退出组进行事后比较。Mann-Whitney比较了对照组和fzp退出组每PSD免疫金颗粒数(0 ~ 5)的相对频率你以及。使用Prism 4.0软件(GraphPad software Inc.， San Diego, CA)对数据进行统计分析和生成图表。报告的值为平均值±SEM，并认为有显著差异，如果值小于或等于0.05。

结果

３．１．CaMKIIα表达，但不是thr²⁸⁶自动磷酸化，在FZP撤回CA1不对称后炔诺斯中减少

现有证据表明，在从FZP中取出的大鼠2天，Camkii可以通过CA激活^2＋通过L-VGCC将L-VGCC流入SER的L-VGCC磷酸盐^831.增加安培指导[11那13那19那34]．为了进一步评估Camkii活化的性质及其后突触定位，Ca1区的超薄部分与抗Camkii共粘贴α和抗自磷酸化的thr^286/287CaMKIIα/β(抗pcamkii)抗体，并分别使用与15或10 nm金偶联的二抗进行区分。在近端树突状SR区域的不对称突触中评估了双重标记，该区域之前检测到GluA1 AMPAR亚基PSD表达增加[33]．降低Glun1和Glun2b NMDAR亚基的PSD表达也发现在当前研究中使用的相同组织中[20.]．在单独与CaMKII或pCaMKII抗体反应的组织中观察到类似水平的标记(数据未显示)，与作为鸡尾酒的抗体组合相比，表明抗体在双重反应中没有空间干扰彼此。反camkii的省略α抗体在69个不对称突触轮廓中产生0.01 15nm免疫颗粒/ Bouton，0.10颗粒/脊柱，0.01颗粒/ psd。粒子/小结,粒子/脊柱,对照组织平均颗粒/ PSD。通过替代单克隆抗Camkii来测试与相反（兔抗PCAMKII）伯爵缀合至15nm金的山羊抗小鼠二抗的交叉反应α在60个随机选择的不对称突触谱图中，均未发现突触前或突触后15nm的免疫金颗粒。在63个不对称突触图谱中，多克隆抗pcamkii抗体的缺失产生0.30 10 nm免疫金颗粒/bouton, 0.24颗粒/spine, 0.06颗粒/PSD粒子/小结,粒子/脊柱,对照组织平均颗粒/ PSD。山羊抗兔二抗与相反的10nm金（小鼠抗Camkii）的交叉反应α)用单克隆抗camkii替换pcamkii多克隆抗体进行一级反应α抗体在随机选择的不对称突触型材中没有在60中产生或后突触前的10nm免疫颗粒。总之，这些结果支持每个初生抗体的特异性标记，并且副抗体与相对的原代抗体的交叉反应。

数字1说明了在对照组(A)和fzp退出(B)大鼠组织中观察到的不对称突触的双重标记。免疫金颗粒在突触前和突触后距PSD裂隙表面300 nm范围内计数。使用CaMKII或pCaMKII抗体标记的钮扣、棘或psd的百分比没有显著变化(图)1(c),表1和2、职责)。有趣的是，在脊柱中观察到CaMKII免疫金颗粒平均数量减少的非显著趋势(减少39%，)和psd(下降62%，,图1(d)、表1），在Boutons，刺或PSDS中的PCAMKII免疫颗粒的平均数量没有明显变化（图1(d)、表2)．当分析仅被标记的（≥1免疫粒子）隔室时，以刺（30％降低30％，测量Camkii免疫颗粒数量的显着降低（30％，）和PSD（30％减少，）但不是boutons（图1(e)、表1)．在免疫阳性突触隔室中观察到PCAMKII标记没有改变（图1(e)、表2)．Camkii的显着减少α在pCaMKII未发生变化的情况下，pCaMKII/CaMKII表达明显但不显著增加(33%，,图1（e），右侧小组）。在非PSD隔室内，在来自FZP取出的大鼠的组织中观察到Camkii免疫形颗粒的平均数量和标记的有源区百分比的显着降低，但在预先或中没有观察到CAMKII或PCAMKII免疫形状标记的显着改变后腹膜膜或细胞内隔室（表3.)．

图1

α μ μ μ μ μ 抗camkii标记的对照组(a)和fzp退出2天(b)大鼠CA1 SR的不对称突触图像(1:20，用15 nm金识别，箭头)和抗pcamkii抗体(1:10，用10 nm金识别，箭头)。CaMKII和pCaMKII免疫金颗粒分别在突触前和突触后，细胞内和与膜和PSD相关。比例尺= 0.2m. (c) CaMKII或pCaMKII标记的钮扣、棘或psd的百分比没有显著变化(在每种情况下)。(d)脊柱中CaMKII标记无显著下降(CON:粒子,；FZP:粒子,；)， CaMKII免疫金颗粒/PSD长度降低(CON:粒子/米，；FZP:粒子/米，；)．但是，在PCAMKII标记中没有改变，PSDS在2天FZP撤出大鼠的PSDS中的PCAMKII / Camkii比没有变化（CON：那；FZP:那；)．（e）免疫阳性隔室的分析（≥1免疫树脂颗粒）揭示了免疫阳性镰刀上的Camkii标记显着降低（CON：粒子,；FZP:粒子,；)和psd (CON:粒子/M;FZP:粒子/M;）来自2天的FZP撤回大鼠。但是，PSD内的PCAMKII / CAMKII的比例没有显着改变（CON：那；FZP:那；)．

数字2说明了对照和FZP - 取出了大鼠的PSD膜预先和后腹侧腹部距离和后腹部距离的平均数量和PCAMKII免疫颗粒。Binned Camkii表达的分析显示了实验组和咬合距离之间的显着相互作用，其标记为60nm突触后的显着的62％延迟至PSD膜（图2（a）)．实验组与预先或pcamkii之间的实验组和箱距离之间没有显着的相互作用。因为先前在这些相同组织中测量的CA1神经元PSD的平均厚度约为40nm [20.]，认为在PSD 20 nm范围内的颗粒代表PSD标记，在60 nm范围内的突触后bin CaMKII表达减少对应于PSD标记的减少，特别是在PSD细胞内表面附近。此外，如图中含有不同数量CaMKII或pCaMKII免疫金颗粒的突触分布图所示3.，在FZP - 撤销组织中含有2个Camkii免疫元颗粒的突触突变的频率显着降低了87％（)．总的来说，这些数据支持降低了CaMKIIαpCaMKII在fzp停止2天大鼠CA1近端SR区psd中的表达不明显。

(一)

(b)

(一)
(b)

图2

μ μ CaMKII和pCaMKII免疫金颗粒在对照组和fzp退出大鼠CA1不对称突触中的分布(a) CaMKII突触后标记分析显示实验组与binned距离之间存在显著的交互作用(那相对于对照突触(CON:粒子/米，；FZP:粒子/米，；那Bonferroni期末测验)。相比之下，对于突触前CaMKII，治疗与binned距离之间没有显著的交互作用(那(双向重复测量方差分析)。(b)实验组与装箱距离之间无显著交互作用(那）或Postynaptic PCAMKII标签（那(双向重复测量方差分析)。

(一)

(b)

(一)
(b)

图3

你 PSD中含有不同数量CaMKII (a)和pCaMKII (b)免疫金颗粒的突触后分布直方图。直方图表示缺乏(0颗粒)CaMKII或pCaMKII免疫金颗粒或含有1 - 5免疫金颗粒的突触的平均相对频率。含有两个CaMKII免疫金颗粒(CON:那；FZP:那；那Mann-Whitney- 最低），而在PCAMKII免疫颗粒的分布中没有检测到显着差异。

4.讨论

4.1。在FZP撤离期间减少Camkii突触定位

增强L-VGCC Ca^2＋苯二氮卓停药过程中电流密度可能诱发camkii介导的AMPAR增强[11那13那34]，停用过程中CaMKII信号传导机制尚不清楚。目前研究的目标是评估CaMKII的突触前和突触后定位α和刺^286/287autophosphorylated CaMKII。主要的发现是CaMKII缺失α来自PSD，通过显着较低的Camkii证明了α阳性标记（≥1免疫组成粒子）刺和PSDS的免疫元颗粒，并用2 Camkii标记的PSD的相对频率显着降低αimmunogold粒子。CaMKII也显著下降α在PSD的裂缝表面的突出距离40至60nm内的免疫元颗粒。该距离对应于PSD的细胞质表面，因为这些组织中PSD的平均厚度约为40nm [20.]．40至60nm的距离也与最高密度相对应的Camkiiαimmunogold粒子。CaMKII的优势定位α在PSD的细胞质面，CaMKII全酶在PSD的细胞质面形成堆积的“塔”，高度在20 - 60 nm，其中20 nm代表一个单独的十二聚体全酶[35]．Camkii的较小峰α在对PSD的裂缝表面的突触距离40至60nm的夹住距离中也观察到免疫树脂颗粒密度。有趣的是，这种双峰分布对于PCAMKII夸大了，这对于在40至60nm箱中具有几乎等效的免疫粒子密度，两者在40至60nm箱中，两者都是预先和突出的。后一种发现表明CAMKII分子自动磷酸化的相对数量^286/287对照和FZP撤出的大鼠突突前较高。

4．2．在FZP退出过程中CA1 psd中CaMKII移除的影响

CaMKII总量的减少α在免疫角质标记的组织中令人惊讶的是，鉴于先前的研究检测到增加CamkiiαFZP停药2天后psd富集亚细胞部分的表达[13]．然而，富含氚核 - 不溶性的PSD馏分含有其他亚细胞室，其中Camkiiα表达可能会增加。例如,CaMKIIα在0.5% Triton X-100不溶的重微粒体细胞骨架室中表达[36]．免疫印迹分析显示CaMKII表达增加可能是由于转位到这个细胞骨架隔间，而不是PSD。CaMKII的直接量化α与免疫印迹分析富含PSD的亚细胞部分相比，在盲法中使用定量免疫金电镜技术是评估PSD定位的更可靠的方法。

先前的研究证实，停服FZP 2天后，CA1 psd中GluN1和GluN2B亚基的表达降低[20.那21]．CaMKII的损失α来自CA1的非对称突触后对应于先前EM研究中观察到的GluN1/GluN2B NMDARs的缺失，这些研究使用的组织切片来自于当前研究中使用的相同实验组[20.]．因为GluN2B亚基被证明与CAMKII结合α[22那37]，含有Glum2B的NMDAR的后突触后去除可以促进从突触后膜中去除Camkii。在撤离2天后去除Camkii-glun2b络合物可以衰减由于Ser的Glua1亚基磷酸化而增强的Ampar电导^831.[13]，导致恢复FZP戒断的第4天正常的Ca1神经元兴奋[16]．CA1 PSD中的CAMKII的还原可能涉及除了GLUN2B之外的突触后蛋白质的解离或丧失，因为CAMKII在PSD中具有其他结合伴侣[1]．然而，Camkii分子结合形成碳乳聚酰胺酶，其可以堆叠成2〜3的塔[335];因此，可以想象，PSD中每一个含有glun2b的NMDAR实际上可以移除12到36个CaMKIIα分子。

4.3。在FZP提取期间Camkii活动：自动磷酸化和绑定伙伴的作用

结果还提出了pcamkii与camkii的比例增加α在FZP戒断2天后CA1神经元PSD中的免疫元颗粒。然而，这种结果并不重要，并且表观变化主要从Camkii的显着降低导致α定位于PSD, pCaMKII PSD表达无变化。这可能表明，在FZP停药过程中，Thr位点磷酸化的CaMKII分子比例确实增加了^286/287，但也可能表明非磷酸化CaMKIIα在FZP戒断期间，或相反，在FZP撤离期间选择性地损失PSD，或者相反，含有PCAMKII分子的全酶保持与PSD结合伴侣的选择性结合，与先前的研究一致[6.那22]．CaMKII也有可能通过与NMDARs的GluN2B亚基结合进行自主激活[22那37]但是在FZP撤回期间，是否在FZP提取期间改变了CaMKII与含Glum2B的NMDAR的相互作用。

需要注意的是苏氨酸周围的氨基酸序列^286/287每个CaMKII亚型的自磷酸化位点几乎相同;因此，用于检测苏氨酸的磷特异性抗体^286/287将识别所有同种型的表位。特别是Camkiiβ在大脑中以第二高水平表达，与CaMKIIα来β前脑的比例约为3:1 [38那39]．不像CaMKIIα，Camkii.β包含一个肌动蛋白结合片段，将全酶定位于肌动蛋白细胞骨架[1]．CaMKII的自身磷酸化β使异质低聚体从肌动蛋白分离，增强向PSD的易位[5.]．尽管CaMKII没有变化βfzp消失2天大鼠CA1 psd富集部位的表达[13，自磷酸化CaMKII表达的改变β不能排除。

自磷酸化导致自主CaMKII活性[3.]和CaM捕获(CaM亲和力增加1000倍)[40]．对于诸如Glua1亚基的许多底物，自主Camkii活性仅是大约20％的最大活动，并且CACKII可以通过CA进一步刺激^2＋/CaM，防止CaMKII激活从神经元活动完全解耦[3.]．因此，也可以通过CA持续增加来维持增加的CAMKII活性。^2＋由于增强的CA，PSD附近的浓度^2＋L-VGCCs内流[34)和Ca^2＋-ermerable glua1均匀Ampars [13那16那18]．鉴于Camkii还结合L-VGCC，这种可能性是有趣的亚基，加利福尼亚州_V.1.2 [41)和Ca_V.1.3通过densin-180相互作用[42]．虽然Ca_V.1.2，加利福尼亚州_V.1.3，或者在fzp退出大鼠的psd富集匀浆中，L-VGCC亚基未发生改变[43[Camkii与L-VGCC的相互作用可以用作用于调制Camkii活动的替代基因座，而不是通过与Nmdars的关系。磷酸酶活性也可以在FZP - 撤回组织中降低，因此在LTP在CA1突触中发生相应量的磷酸酶活性，相同水平的激酶活性未逐渐增加[44]．在FZP撤回期间是否改变特异性磷酸酶的活性水平仍有直接测试。

4.4。结论和含义

目前的研究表明Camkii显着减少α免疫金颗粒在CA1 psd中没有改变CaMKII在Thr处的自磷酸化量²⁸⁶停用FZP 2天后。CaMKII的损失α从CA1 PSD在FZP退出后2天后与先前在同一组织中先前观察到的CA1 PSD中的GLUN1和GLUN2B免疫标记的显着降低相关[20.]．尽管可能涉及其他机制，但CaMKII和含glun2b的nmdar复合物可能作为一种代偿机制从CA1神经元psd中去除，以抵消观察到的ampar介导的CA1神经元超兴奋性增强[16那18那21]．除去含有突触GLUN2B的NMDARS标准化总CA1神经元电流输出，防止进一步的CAMKI介导的GLUA1均匀ampars的增强，并停止了FZP戒断诱导的焦虑[13那19那21]．这些发现与观察到的NMDAR配体结合和功能的增加形成对比，在长期使用选择性较低的正变构GABA治疗后_一种R调制器、巴比妥酸盐和乙醇[45-47]．相反，在苯二氮卓停药期间观察到的NMDAR功能减少和突触后CaMKII的相关损失可以解释为什么苯二氮卓停药综合征远比停药巴比妥酸盐和乙醇严重[14那48那49]．

缩写

致谢

作者要感谢Francisco J. Alvarez博士在海马切片冷冻替代和EM分析方面的专家协助。作者还感谢Yana Fedotova和Paula Kramer在电磁图像捕获和负处理方面的技术援助，以及Krista Pettee和Nikki Wenzlaff在剂量程序和免疫印迹实验方面的帮助。这项工作得到了美国国立卫生研究院国家药物滥用研究所赠款R01-DA184342和F30-DA026675(分别发给E. I. Tietz和D. E. Earl)的支持。这项工作的部分内容已在以下会议上提出:D. E. Earl, P. Das, W. T. Gunning III和E. I. Tietz。(2011);加利福尼亚州^2＋/氟西泮停药期间海马CA1兴奋性突触后钙调素依赖性蛋白激酶II定位和自磷酸化68.02。2011年神经科学会议规划师2011年11月12-16日，华盛顿:神经科学学会。

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