文摘

背景。前列腺癌(PCa)危害男性生殖系统,和lncRNA可能发挥重要作用。在这里,我们报告LINC01088 /微- microRNA / miR - 22 /细胞分裂周期6 (cdc 6)轴调节通过phosphatidylinositide 3-kinases - (PI3K)蛋白激酶B(一种蛋白激酶)信号通路控制PCa的发展。方法。lncRNA / microrna的信使rna与PCa被基因表达综合下载和分析。表达和相关LINC01088 / miR-22 / cdc 6在RT-qPCR PCa进行了分析和验证。Dual-luciferase被用来分析miR-22 LINC01088或cdc 6之间的绑定。细胞计数Kit-8 Transwell和用于分析的影响LINC01088 / miR-22 cdc 6交互PCa细胞生存能力或迁移/入侵的能力。本地化的LINC01088细胞被核胞质分离分析。LINC01088 / miR-22 / cdc 6交互的影响下游PI3K / AKT信号被免疫印迹分析。结果。LINC01088或cdc 6调节前列腺肿瘤组织或细胞,而miR-22表达下调,miR-22 LINC01088和cdc 6的直接目标。si-LINC01088抑制PCa过程通过抑制PI3K / AKT途径。cdc 6逆转si-linc01088-mediated细胞生长抑制和减少PI3K和AKT蛋白水平。结论。我们的研究结果表明,LINC01088 / miR-22 cdc 6轴函数PCa过程并提供一个有前途的诊断和治疗的目标。

1。介绍

前列腺癌(PCa)是一种癌症,在全世界影响男人和很常见。它占所有癌症新发病例的21%。不幸的是,它会导致严重疾病和死亡的影响(1,2]。早期系统的筛选有非常积极的影响前列腺癌的预防和治疗,和可用的一组电脑生物标记发展(3];还有一个重要的未满足的需要新的和更有效的治疗。

长非编码rna (lncRNAs),大于200个核苷酸,不编码蛋白质,显著影响癌症肿瘤发生和转移时表达式改变(4]。lncRNAs主要功能通过调节内源性rna(龙头)竞争,作为microrna的海绵,否则目标的特定基因。几个lncRNAs,包括MEG3 FOXP4-AS1,和段H19与前列腺癌(5- - - - - -7]。然而,LINC01088的分子机制,这被认为是一种癌基因在大多数癌症(8,9),在前列腺癌尚未阐明。

miR-22阻碍不同癌症的进展,包括膀胱、结直肠和胃癌症(10- - - - - -12]。同样,miR-22,雄激素受体(AR) cistrome成员,抑制癌细胞的过程如LNCaP或生物在PCa (13]。针对lncRNAs microrna的龙头作用或mRNA 3 翻译区(UTR)在主成分分析报告。例如,热空气和3 miR-22目标 UTR的HMGB1,影响预后PCa (14]。此外,miR-22已被证明在PCa细胞调节多个信号通路。具体来说,miR-22激活Wnt /β连环蛋白信号在癌15]。达等人发现MTA1-activated miR-22调节PCa侵袭性(16]。此外,miR-22调节PI3K / AKT通路在各种癌症,如卵巢癌、骨肉瘤(17,18]。然而,是否miR-22激活PCa的PI3K / AKT通路尚不清楚。

细胞分裂周期6 (cdc 6)是一种新型癌症目标调节DNA复制过程和被认为是恶性肿瘤的一个早期指标19]。cdc 6一直被认为是癌症诊断生物标记在各种癌症20.,21]。例如,Mahadevappa等人发现cdc 6在乳腺癌的预后意义22]。然而,只有很少有研究调查了PCa的cdc 6表达(23];因此,cdc 6需要进一步调查。

PI3K信号的AR和频繁的激活是关键因素的恶化PCa (24]。PI3K / AKT信号通路,cross-regulated通过与基于“增大化现实”技术的若干个相互抑制循环途径,是前列腺肿瘤发展的驱动程序25,26]。棕褐色等人的最近的研究显示,PI3K / AKT轴失活抑制前列腺肿瘤发生[27]。戴秉国等人证实,抑制PI3K / AKT信号通路促进PCa细胞自噬(28]。PI3K和AKT抑制剂将很快被引入作为抗肿瘤药物和目前在临床前和临床开发(29日- - - - - -31日]。

本研究旨在了解的交互和机制LINC01088 / miR-22 cdc 6轴和探索其可能性作为系统的生物标志物筛选的PCa。

2。材料和方法

2.1。样品

十件新鲜冷冻的PCa和邻近组织得到从深圳龙岗区人民医院(中国深圳),以及病理信息。所有患者组织学证实前列腺肿瘤。试验机构伦理委员会批准的深圳龙岗区人民医院(中国深圳;没有批准。2022071),按照《赫尔辛基宣言》。

2.2。芯片原始数据分析

数据集来自基因表达综合。系列(GSE104749)数据集被用来分析lncRNA / mRNA表达谱主成分分析和分类如下:控制(4良性前列腺增生(BPH)细针穿刺活检组织),和PCa (4 PCa细针穿刺活检组织)。GEO系列(GSE45604)数据集被用来分析microrna的表达谱主成分分析和分类如下:正常(10正常前列腺组织)和PCa (10 PCa组织)。表达特异表达的RNA被满足 标准。GEPIA2用于癌症基因组图谱,TCGA生存分析。候选基因与癌症亚型被选为输入来生成生存曲线无病生存。被定义为统计意义 。

2.3。LINC01088和miR-22预测目标

LINC01088之间的交互和miR-22预测使用LncBase v。3 (https://diana.e-ce.uth.gr/lncbasev3/interactions)。假定的目标使用TargetScan miR-22的预测(http://www.targetscan.org/vert_72/)和TarBase v。8 (https://dianalab.e-ce.uth.gr/html/diana/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex)。

2.4。细胞培养和转染

人类PCa细胞系(C4-2 LNCAP,生物,22 rv1)和前列腺上皮细胞(RWPE-2)从美国购买类型文化集合(写明ATCC;美国弗吉尼亚州)。LNCAP、生物C4-2、22 rv1 RWPE-2细胞保持rpmi - 1640(美国UT HyClone) 10%胎牛血清(的边后卫;HyClone)。Lipofectamine 3000(表达载体;热费希尔科学,Inc .)转染到细胞48 h后,用于后续实验。

2.5。核质分离和RT-qPCR化验

细胞质和核RNA净化设备(bioWORLD;哦,美国)分离出细胞根据制造商的指示。从组织或细胞总RNA提取使用试剂盒试剂。在12000×g离心后(4°C, 10分钟),RNA是reverse-transcribed cDNA和分析使用一步SYBR绿色RT-qPCR工具包(生物标志物,北京)和执行条件:95°C 1分钟紧随其后40 95°C的周期为32 6年代和60°C。引物的序列如下:LINC01088向前,5 - - - - - -TAGGGTGCCTTCACCTGCTA-3 和LINC01088相反,5 - - - - - -TACACCCGGTGGAAAACTCC-3 ;cdc 6向前,5 - - - - - -GATCAACTGGACAGCAAAGG-3 和cdc 6相反,5 - - - - - -CTAGGTAGAATTCTATCTGT-3 ;miR-22向前,5 - - - - - -ACACTCCAGCTGGGAGTTCTTCAGTGGCAA-3 miR-22逆转,5 - - - - - -CTCAACTGGTGTCGTGGA-3 ;18 srna向前,5 - - - - - -CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3 和18 srna相反,5 - - - - - -GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3 ;和U6, 5 - - - - - -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 U6反向,5 - - - - - -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 。使用2 RNA水平计算−ΔΔCt方法(32]。

2.6。RNA拉试验

Biotin-labeledLINC01088和miR-22转染到PCa细胞。24小时后,细胞细胞溶解•瑞帕裂解缓冲然后孵化(12分钟)与Dynabeads m - 280链霉亲和素(表达载体),其次是RT-qPCR分析。生物素化的RNA从Sangon生物技术获得。

2.7。瞬态LINC01088沉默

核序列如下:si-LINC01088-1, 5 - - - - - -CCTTAAAGTAGCAATCTTAdTdT-3 ;si-LINC01088-2 5 - - - - - -GAGAAATTGGACCAGACAAdTdT-3 ;si-LINC01088-3 5 - - - - - -AGTCTGCATTGAAGATGTAdTdT;和si-NC 5 - - - - - -TTCTCCGAACGTGTCACGdTdT-3 。

2.8。细胞生存能力分析

细胞生存能力评估、生物和LNCAP细胞( )处理10μL (CCK-8试剂(Solarbio)在0、24、48和72小时。60分钟后孵化(在黑暗中)37°C,样品测定的吸光度在450 nm使用enzyme-labeled仪器(热费希尔科学)。

2.9。迁移和入侵检测

生物迁移和LNCAP细胞验证了使用Transwell插入(BD生物科学)与多孔聚碳酸酯膜。细胞在无血清培养基(上院),和一个中等(10%的边后卫)添加到众议院,24 h。迁移的区别在于,入侵检测preincubates基底膜基质(BD生物科学)Transwell插入。然后,它是固定的无水酒精,与结晶紫染色,计算在内。

2.10。Dual-Luciferase记者分析

插入LINC01088或cdc 63 UTR psi-CHECK2和转染293 T细胞(写明ATCC) miR-22模仿使用lipofectamine 3000在37°C 4 h。荧光素酶活性测定使用dual-luciferase记者分析系统(Promega) 490海里后48 h的文化。萤火虫荧光素酶值规范化使用的比例对Renilla萤火虫荧光素酶的活动。

2.11。西方墨点法

从PCa细胞变性蛋白质解决10% sds - page (Beyotime)。乐队随后被转移到PVDF膜分离和孵化(12 h;4°C)和PI3K(1: 1200年,ab191606),一种蛋白激酶(1:500年,ab8805) p-PI3K(1: 500年,ab182651) p-AKT(1: 500年,ab38449), cdc 6(1: 1000年,ab109315)和GAPDH(1: 3000年,ab8245)主要抗体。然后他们被孵化(2 h, 25°C)与山羊anti-rabbit抗体(1:12000年,ab205718)。抗体是来自Abcam(英国剑桥)。

2.12。统计分析

值被用来显示数据和GraphPad棱镜9是用于统计分析。最初,单向方差分析进行,其次是Bonferroni事后测试建立整体存在统计上的显著变化。随后,一个学生的 - - - - - -测试是用来检查任何两组之间的差异。被定义为统计意义 。

3所示。结果

3.1。在PCa LINC01088是调节

我们进行了一次全面调查最近发现的潜在作用长非编码RNA (lncRNA)在前列腺癌(PCa)的发展。我们的调查主要涉及lncRNA芯片数据显示,45差异表达成绩单lncRNAs,确定了PCa标本与对照组相比。这些记录,LINC01088展出最重要log-fold改变(logFC)值,从而暗示其可能为进一步研究的目标(图1(一))。此外,我们验证了超表达的LINC01088 PCa组织(图1 (b)),与PCa的无病存活率降低患者,并与多样化的PCa临床病理特征(图1 (c))。在PCa LINC01088的表达明显增强细胞相比RWPE-2细胞(图1 (d)),特别是在生物和LNCAP细胞,强调在PCa LINC01088发展的重要作用。随后发现了siRNA-LINC01088-1是最强有力的抑制剂LINC01088三siRNAs生物和LNCAP细胞中,我们使用它作为进一步的拮抗剂分子机械的研究(图1 (e))。我们的发现表明LINC01088表达式的减少导致减少细胞生存能力,以及减少迁移和入侵能力的生物和LNCAP细胞系(如数据中描述1 (f)- - - - - -1(我))。此外,根据我们的观察,LINC01088优先局部细胞质地区的这些细胞(图1 (j)),这意味着它对前列腺癌病理生理学的影响可能是由一种内源性RNA(龙头)竞争机制。

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图1
LINC01088是主成分分析的一个新的潜在目标,促进发展。(一)分层聚类热图显示差异表达lncRNA包括LINC01088 PCa和对照组之间。(b)的相对表达水平之间的LINC01088 PCa肿瘤组织和邻近组织。(c)的无病生存率计算TCGA LINC01088-high或LINC01088-low群体的生存分析GEPIA2数据库。(d)相对表达LINC01088 RWPE-2和四个PCa细胞系(22 rv1 C4-2,生物和LNCaP)。(e) RT-qPCR 3 si-LINC01088生物的抑制效率分析和LNCAP细胞。CCK8 si-LINC01088效果的可行性分析(f)生物和(g) LNCAP细胞。Transwell si-LINC01088的影响分析(h)的迁移和入侵生物,(我)LNCAP细胞。(j) RT-qPCR LINC01088定位分析在生物和LNCAP细胞。 。
3.2。LINC01088直接针对miR-22

基于64年microrna的芯片数据分析结果,差异表达hsa-miRNAs被确定5调节和59个表达下调hsa-miRNAs使用10 PCa和正常前列腺样本(图2(一个)),LncBase v3的联合分析数据库和microrna的芯片数据显示miR-22衰减microrna(图中是唯一的交集2 (b))和miR-22 PCa是在组织和细胞中表达下调(数字2 (c)和2 (d))。此外,压抑的表达LINC01088 miR-22的表达增加(图2 (e))。随后的实验中证实,LINC01088直接目标miR-22(图2 (f))。这里,我们证实LINC01088可以吸附miR-22调节PCa的发展。

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图2
LINC01088海绵吸附miR-22。(一)分层聚类热图显示差异表达之间的microrna的PCa和对照组。(b) microrna的芯片和lncRNA数据库相结合来分析潜在的microrna LINC01088绑定。(c)的相对表达miR-22 PCa肿瘤组织和邻近组织。(d)相对表达miR-22 RWPE-2和四个PCa细胞系(22 rv1 C4-2,生物和LNCaP)。(e) RT-qPCR效应的分析si-LINC01088 miR-22的表达在生物和LNCAP细胞。(f) Dual-luciferase化验分析miR-22 LINC0108绑定的。 。
3.3。cdc 6直接针对miR-22

鉴于microrna具有调节转录和翻译的能力通过绑定到3 UTR mrna (33),我们分析了PCa-related差异表达mrna的地理数据集。信使rna芯片数据分析显示,1067年致癌基因调节(图3(一个))。的结合分析TargetScan数据库和TarBase V.8数据库显示,20个基因有重叠,其中2基因潜在的结合位点,即VASH1和cdc 6(图3 (b))。之前的调查显示,VASH1在PCa(表达下调34),而cdc 6的表达明显增强截断PCa患者的无病生存期(图3 (c))。因此,我们指定的cdc 6基因作为后续验证一个合理的目标。我们的发现证实,cdc 6 PCa组织和细胞内高表达(数字3 (d)和3 (e))。此外,我们dual-luciferase试验验证,cdc 6直接针对miR-22(图3 (f))。抑制LINC01088后,cdc 6的表达在生物和LNCAP细胞(图表达下调3 (g))。

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图3
cdc 6目标miR-22和逆转si-LINC01088在生物和LNCAP细胞的影响。(一)散点图显示PCa和对照组之间的差异表达mrna。(b) dual-luciferase记者分析显示的相对荧光素酶活性CDC6-WT或CDC6-MUT miR-NC和miR-22团体之间的质粒。(c)的无病生存率计算TCGA CDC6-high或CDC6-low群体的生存分析GEPIA2数据库。(d)之间的相对表达水平的LINC01088 PCa肿瘤组织和邻近组织。(e)相对表达LINC01088 RWPE-2和四个PCa细胞系(22 rv1 C4-2,生物和LNCaP)。(f) Dual-luciferase化验分析miR-22 cdc 6绑定的。(g) RT-qPCR效应的分析si-LINC01088 cdc 6的表达在生物和LNCAP细胞。(h) RT-qPCR overexpressing cdc 6质粒的有效性进行验证。(我)RT-qPCR逆转的分析通过overexpressing cdc 6 si-LINC01088 LINC01088表达式。 。
3.4。与cdc 6 LINC01088呈正相关

LINC01088之间的关系和cdc 6验证了通过构建的超表达质粒cdc 6 (ov-CDC6)。结果表明,cdc 6在ov-CDC6-transfected生物和LNCAP细胞调节,确认cdc 6过表达质粒(图的有效性3 (h))。此外,cotransfection后,生物和LNCAP细胞ov-CDC6和si-LINC01088过度cdc 6逆转si-LINC01088 LINC01088表达的抑制作用。(图3(我))。因此,miR-22直接目标LINC01088和cdc 6和LINC01088与cdc 6呈正相关。

3.5。LINC01088 / miR-22 / cdc 6轴通过PI3K / AKT信号影响PCa发展

接下来,识别关键调控信号通路,我们分析了丰富信号通路相关的差异表达基因数据库使用大卫。前十名的强化途径,PI3K / AKT通路与45参与相关差异基因,基因的数量最多,被选中(图4(一))。基于西方墨点法,击倒的LINC01088生物和LNCAP细胞导致减少cdc 6, p-PI3K, p-AKT蛋白质水平(图4 (b))。ov-CDC6逆转LINC01088的影响(图4 (c))。此外,si-LINC01088可以抑制率(数据的可行性4 (d)和4 (e))和迁移/入侵生物和LNCAP细胞(图4 (f))。综上所述,LINC01088影响PI3K-AKT信号通过海绵吸附miR-22和调节cdc 6,从而调节PCa的发展。

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图4
si-LINC01088抑制PCa通过PI3K / AKT通路细胞生长。(一)十大KEGG通路富集分析。(b)的免疫印迹分析si-LINC01088-mediated蛋白质水平的cdc 6, PI3K, p-PI3K, AKT, p-AKT。(c)免疫印迹分析si-LINC01088 / ov-CDC6-mediated蛋白质水平的cdc 6, PI3K, p-PI3K, AKT, p-AKT。CCK8 si-LINC01088 / ov-CDC6合作宣言的影响分析的可行性(d)生物和(e) LNCAP细胞。Transwell效应的分析si-LINC01088 / ov-CDC6强制迁移和入侵(f)的生物。 。

4所示。讨论

我们的目的是确定一个小说lncRNA在PCa的治疗有潜在的治疗价值。起初,我们调查的致癌作用LINC01088 cdc 6和PCa miR-22的肿瘤抑制作用。LINC01088和cdc 6表达都是调节在PCa的组织和细胞,不像miR-22,促进PCa体外细胞生长。我们发现LINC01088海绵miR-22, cdc 6 miR-22的目标,LINC01088与cdc 6在PCa过程协调调节。此外,LINC01088激活PI3K / AKT通路。

LINC01088是一个有影响力的调节因子在各种癌症8,9]。例如,彭等人发现LINC01088促进神经胶质瘤进展(35,刘等人发现LINC01088促进增殖和迁移的非小细胞肺癌8]。同样,我们的研究表明LINC01088调节在PCa,及其超表达显著降低了PCa患者的无病生存。LINC01088促进PCa细胞生存能力率和迁移/入侵通过PI3K / AKT信号,表明在促进PCa发展LINC01088有致癌的作用。LINC01088镇压时,主成分分析细胞的生长受到限制。此外,LINC01088扮演了一个角色,电抗器,microrna的骗取因素,癌症。例如,藏等人发现LINC01088能抑制卵巢上皮细胞的肿瘤发生骗取miR-24-1-5p [36),和李等人发现LINC01088起着龙头作用,骗取miR-22在大肠癌的发展9]。在我们的研究中,我们表明,LINC01088海绵miR-22和负调节miR-22 PCa。此外,抑制LINC01088提拔的表达在PCa miR-22细胞的表达。

miR-22调节目标基因影响posttranscription或翻译PCa过程(13,14]。生物信息学预测miR-22目标cdc 6和目标机制被dual-luciferase记者试验证明。此外,cdc 6表达是负相关,miR-22 PCa组织和细胞中表达。值得注意的是,cdc 6促进PCa过程(37,38]。此外,LINC01088协调调节电抗器的microrna的目标基因的轴。在我们的研究中,LINC01088与cdc 6协调调节,si-LINC01088 cdc 6表达PCa细胞减少,cdc 6逆转si-LINC01088-mediated PI3K和AKT蛋白表达减少PCa细胞。此外,主成分分析细胞的增长缓慢造成的抑制LINC01088表达显著缓解过度的cdc 6。这些结果表明,LINC01088产生致癌效应通过miR-22 / cdc 6轴。

PI3K / AKT通路直接控制主成分分析(39,40]。剪等人发现PI3K-AKT十字路口的信号和PCa AR-MAPK-Wnt [41]。在目前的研究中,在抑制细胞生存能力,促进细胞凋亡,并抑制迁移/入侵,PI3K / AKT磷酸化水平降低。LINC01088 miR-22, cdc 6控制PI3K / AKT通路调节PCa进展。si-LINC01088或miR-22抑制PCa细胞生长和减少PI3K / AKT磷酸化水平。cdc 6促进癌细胞的生长和增强PI3K / AKT信号和逆转si-LINC01088于主成分分析细胞的影响。

多个实验室的变化也会影响治疗策略的发展目标LINC01088 / miR-22 / cdc 6轴。尽管潜在的局限性,本研究为进一步的研究提供了一个基础LINC01088 / miR-22 cdc 6轴作为PCa处理潜在的治疗目标。未来的研究可以建立这些发现和调查背后的分子机制监管LINC01088之间的交互,在PCa miR-22, cdc 6。因此,重要的是要进行验证研究来证实这个轴的治疗潜力跨多个实验室和临床试验启动前患者群体。

总之,这项研究证实了LINC01088 / miR-22 cdc 6轴作为一个潜在的治疗目标,提供更多治疗PCa的方向和理论依据。

数据可用性

作者声明,所有其他数据支持我们的研究结果都包含在这篇文章,作者从相应的合理要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

李健胃和兴华黄了同样工作和co-first作者。