文摘
缺血性中风是一个重要的治疗条件,仍然是很严重的问题。脑缺血后再灌注损伤变得明显事故当受灾地区的再氧化产生病态的副作用是不同的比最初的氧气和营养不足引起的侮辱。Pyroptosis是裂解细胞程序性死亡的一种形式,明显不同于细胞凋亡,这是由inflammasomes,取决于Caspase-1的激活。然后,Caspase-1动员N-domain gasdermin D (GSDMD),导致细胞因子的释放,比如interleukin-1β(il - 1β)和interleukin-18(地震)。x - box结合蛋白l (XBP-1)被激活内质网(ER)压力下形成的一个重要转录因子XBP-1拼接(XBP-1s)。脑缺血/再灌注(CI / R)引起细胞毒性,这与拼接XBP-1 mRNA的激活和NLRP3(点头、远程雷达,pyrin domain-containing 3) inflammasomes,连同增加的促炎细胞因子的表达和分泌和upregulation HT22 pyroptosis-related基因的细胞,在大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠模型。然而,XBP-1是否发挥作用在调节pyroptosis参与CI / R仍然是未知的。我们目前的研究表明,行为赤字,脑缺血性病变,从CI / R和神经元死亡了。CI / R XBP-1s的mRNA水平增加,NLRP3, il - 1β,地震和XBP-1s的表情,NLRP3, Caspase-1, GSDMD-N, il - 1β和地震。我们进一步HT22细胞和C8-B4细胞中重复这一过程,发现OGD / R细胞生存能力降低,增加LDH释放,XBP-1s, NLRP3, Caspase-1, GSDMD-N, il - 1β,地震,尤其是pyroptosis的比率,由Z-YVAD-FMK逆转和XBP-1使之抑制。我们的研究结果表明,表达下调XBP-1抑制pyroptosis通过古典NLRP3 / Caspase-1 GSDMD通路保护神经元。
1。介绍
中风是永久性残疾和死亡的主要原因,影响全世界约1500万人(1]。它的特点是高发病率,残疾,和复发。缺血性中风是由于脑血流量的干扰或妨碍大脑血管的血栓,所有这一切剥夺了当地脑组织的氧和葡萄糖2,3]。目前,药物、物理和现代机械再灌注疗法通常是第一行的护理在急性缺血患者。在缺血性中风治疗,再灌注损伤仍然是有问题的(4]。目前,再灌注可以引起其他威胁生命的续集,促使追求的研究涉及使用脑缺血/再灌注(CI / R)动物模型。这小说事业需要确定目标,减少神经炎症引起的复氧和葡萄糖补充恢复受损神经功能。神经炎症和神经细胞损伤的不可避免的后果是在梗塞区域局部脑缺血。研究表明,炎症反应不仅与CI / R的病态发展但也神经元死亡的主要原因5]。大脑中动脉的阻塞可以带来一个提示关闭氧气和葡萄糖的供应。有关分子模式(抑制)指缺氧细胞在缺血区域上调和分泌TNF -等因素α,interleukin-1β、interleukin-18高机动组框1 (HMGB1)和细胞外cold-inducible rna结合蛋白(eCIRP)。他们可以唤起危险信号炎症介质如Caspase-1 / Gasdermin, JAK / STAT-1, TLR4 MyD88 / NF -κB (6]。
inflammasome是是必要的组织损伤传感器类型的转换proform interleukin-1β(il - 1β)到成熟,活跃的形式,还涉及pyroptosis [7- - - - - -10]。Pyroptosis有别于细胞凋亡,这是第一次观察到巨噬细胞感染弗氏志贺菌细胞内的细菌(11使免疫原性细胞内容的发布,包括抑制;这些压力激活NLRP3(点头、远程雷达,pyrin domain-containing 3),然后,NLRP3激活Caspase-1通过适配器凋亡相关speck-like蛋白质包含一张卡片(ASC) [12]。Caspase-1流程和激活炎性细胞因子il - 1等β和interleukin-18(地震)和劈开gasdermin D (GSDMD)释放膜造孔n端GSDMD域(GSDMD-N)。引发炎症,GSDMD-N毛孔促进il - 1释放激活β和地震13]。NLR家族,包括NLRP3, il - 1βCaspase-1,据报道在动物模型中扮演关键角色的缺血性脑损伤(14),和中风与il - 1的单核苷酸多态性β(15]。
l x - box结合蛋白剪接(XBP-1s)作为重要的转录因子和内质网(ER)压力下被激活,从而积极调节细胞增殖和血管生成。之前的研究表明,短暂脑缺血可以激活XBP-1信使rna剪接保护细胞免受缺血/ reperfusion-induced细胞损伤和凋亡16,17]。XBP-1可以激活NLRP3炎性体(5]。XBP-1缺陷小鼠的增加容易细菌感染和损害他们的宿主防御(18]。
最近的一项研究表明,NLRP3 inflammasome不足或利用其选择性抑制剂(MCC950)可以改善脑损伤后缺血性中风(19]。的IRE-1α抑制剂31 - 083010或XBP-1可以选择性地抑制IRE-1的基因沉默α/ XBP-1s分支然后减弱Cd-induced NLRP3 inflammasome激活和pyroptosis HK-2细胞。Sirtuin-1可以改善cadmium-induced ER应激和pyroptosis XBP-1s脱乙酰作用[20.]。但是,明确的证据表明,XBP-1诱导表达和切片的增加pyroptosis存在于脑缺血/再灌注尚未被证实。因此,针对XBP-1和pyroptosis抑制异常炎症反应可能导致一种新的治疗策略CI / R损伤(21]。
在目前的研究中,我们探索的影响在pyroptosis XBP-1 HT22细胞,C8-B4细胞和大鼠治疗OGD / R或大脑中动脉阻塞(MCAO)。我们发现OGD / R细胞生存能力下降,而和pyroptosis增加,这可能是XBP-1大多被击倒。OGD / R或MCAO XBP-1s的水平增加,NLRP3, Caspase-1, GSDMD, il - 1β,而地震恢复表达下调XBP-1表达式。
2。材料和方法
2.1。材料
HT22细胞和C8-B4细胞是来自昆明动物研究所(中国昆明)。抗体NLRP3 GSDMD-N,地震,XBP-1从Abcam购买(美国Cambridge, MA)。抗体XBP-1s和裂解Caspase-1购买从细胞信号技术(麻萨诸塞州,美国)。抗体裂解il - 1β是购买的亲和力生物科学(江苏,中国)。抗体beta-actin购买形式Proteintech集团公司(美国)。从Selleckchem Z-YVAD-FMK购买(Selleck化工、中国)。Polyphyllin VI购买从多国评价(美国MedChemExpress)。
2.2。动物
男性Sprague-Dawley老鼠(重250 - 280克)是上海实验动物中心提供的,中国科学院和被安置在12:12 h光/暗周期 °C和随意获取食物和水。动物被分为四组:实验(我)虚假的集团(假的),老鼠没有颈动脉闭塞(年代);(2)I / R组颈动脉闭塞了60分钟紧随其后再灌注24小时(24小时);(3)I / R组颈动脉闭塞了60分钟紧随其后再灌注48小时(48小时);和(iv) I / R组颈动脉闭塞了60分钟紧随其后再灌注72小时(72 h)。
2.3。大脑中动脉闭塞模型
我们跟着邓的方法等。22]。老鼠和1.5%异氟烷麻醉(美国雅培,雅培公园,IL),和左大脑中动脉闭塞的管腔内的缝合技术如前所述在老鼠大脑中动脉闭塞(可逆没有颅骨切除术)。短暂,大脑中动脉闭塞的4 - 0尼龙单丝涂上硅胶小费。再灌注后,轻轻取出灯丝成立60分钟的闭塞。虚假的对照组,所有的手术都是包括除了MCA闭塞的。
2.4。行为测试
2.4.1。步态分析
步态测量使用足迹测试来评估肢体协调和步长。步态分析,老鼠习惯于实验者和行为空间从2到3天前测试。然后,老鼠习惯于直走自己的笼子。老鼠的爪子记录由软件(Bihaiwei软件技术、安徽,中国);老鼠被允许自由地走在跑道上。分析了平均步幅和平均步幅宽度通过测量爪印之间的距离。
2.4.2。神经系统评估
我们跟着李的方法等。23]。行为测试也很重要24小时后观察缺血的程度,48 h,和再灌注72 h。三个研究者盲评和记录大鼠的神经功能缺损,然后所有组的分数计算。5级4巴隆的方法是在本研究进行的评估每个大鼠的神经功能缺损。
评分标准如下:
等级0:不神经赤字
1级:侧前肢无法完全伸展当老鼠的尾巴
等级2:大鼠自发圈到麻痹走路时
等级3:老鼠不自觉地侧一边走路时摔倒
4级:老鼠不能自动行走,失去了意识
2.4.3。评估梗塞体积
2、3、five-triphenyltetrazolium氯- (TTC)彩色大脑部分被用来评估脑梗死体积。24小时、48小时和七十二小时再灌注后,立即牺牲后,老鼠的大脑被移除,所以切成五个系列2毫米厚片。样本然后孵化15分钟2% TTC (Solarbio,北京)37°C和4%多聚甲醛中固定过夜。通过TTC梗死保持清白的。每个老鼠大脑的部分与TTC染色(无污点的领域被公认为梗死灶)和定量评估使用Image-Pro +软件计算梗死体积百分比。
2.4.4。Haematoxylin-Eosin(圆))染色
深麻醉老鼠transcardially与PBS其次是4%多聚甲醛灌注。大脑迅速被斩首,仔细后缀。然后,样本paraffinized和切片5μ米厚的部分。在2的变化二甲苯脱蜡的部分(10分钟)和水化2的变化绝对乙醇(5分钟),然后通过运行自来水冲洗有序。Haematoxylin-eosin(圆))染色进行组织形态学观察。组织学评估是由调查员蒙蔽了。
2.4.5。尼氏小染色
尼氏小染色,脑组织石蜡包埋部分(5μm)沉浸在二甲苯(5分钟,2次),患者在绝对乙醇(5分钟,2次)其次是95%,75%,和50%乙醇的解决方案在水中(5分钟),然后在蒸馏水冲洗2次,5分钟。幻灯片在FD甲酚紫染色解决方案(FD公司成员,巴尔的摩,医学博士,美国)10分钟,然后,简单冲洗在100%乙醇和100%乙醇含有0.1%冰醋酸分化为1分钟。幻灯片被脱水在绝对乙醇(2分钟,4次)其次是间隙在二甲苯(3分钟,2次)。盖玻片与树脂安装安装介质。染色的海马CA1区被蒙蔽研究员经常分析实验协议。
2.5。细胞培养用药物和治疗
HT22细胞(细胞线)在F12培养基培养(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)补充10%胎牛血清(penicillin-streptomycin Gibco)和0.5%(青霉素:100 U / ml,链霉素:100克/毫升;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),在湿润的气氛中在37°C下5%的股份有限公司2。C8-B4细胞(细胞线)在DMEM培养基培养,包含25毫米葡萄糖(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)与200毫米补充谷氨酰胺(GlutaMax Gibco), 10%胎牛血清(penicillin-streptomycin Gibco)和0.5%(青霉素:100 U / ml,链霉素:100克/毫升;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),在湿润的气氛中在37°C下5%的股份有限公司2。两个细胞被播种在6-well培养板的密度 每口井。这些细胞被使用Z-YVAD-FMK (20μ米)30分钟在刺激OGD / R。这些细胞被使用polyphyllin VI (4μ米)30分钟在刺激OGD / R。
2.6。转染
我们跟着白等的方法。24]。XBP-1核和消极控制核化学合成了上海GeneChem有限公司有限公司(上海,中国)。序列如下:XBP-1 siRNA,意义:5 - - - - - -CACCGGCTGCTCCAGCTCGCTCATC-3 ;反义:5 - - - - - -AAACGATGAGCGAGCTGGAGCAGCC-3核和消极的控制,意义:5 - - - - - -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ;反义:5 - - - - - -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3 。
在6-well HT22细胞和C8-B4细胞被播种密度板 每口井。0.33的内容μ小干扰rna和5克μl siTran转染试剂(Origene,医学博士,美国)分别被稀释在无血清Opti MEM最终成交量为250μl,轻轻混合,在室温下培养5分钟。然后,稀释核解决方案和稀释siTran转染试剂在室温下混合轻轻地和孵化20分钟。稀释siRNA / siTran转染试剂复杂添加到盘子。与siRNA 24 h,转染后的细胞暴露在OGD / R,然后收获试验。
2.7。Oxygen-Glucose剥夺和复氧(OGD / R)模型
体外模拟CI / R条件,OGD / R的造型方法,和HT22细胞和C8-B4细胞培养在正常情况下24 h,然后搬到glucose-free DMEM (Gibco),并放置在缺血条件下(3%啊2,92% N2,5%的公司2)在37°C 2 h。之后,媒介被丢弃,在正常培养基培养细胞在常氧条件下24小时再灌注。
2.8。细胞生存能力分析
我们跟着白等的方法。24]。HT22细胞和C8-B4细胞在一夜之间被播种到96孔板,然后是使用XBP-1 siRNA 24 h和Z-YVAD-FMK (20μM)和polyphyllin VI (4μ米)前30分钟OGD / R,然后是孵化24 h后接触OGD / R。细胞的生存能力是衡量使用细胞计数Kit-8 (CCK-8)根据制造商的指示。24小时后,10μl CCK-8是添加到每一个,其次是2 h 37°C孵化。吸光度在450 nm / 630纳米检测使用一个enzyme-labeled乐器。结果从三个独立的实验,每个实验进行了一式三份。一组的平均OD / OD的控制是用来计算的可行性。
2.9。乳酸脱氢酶(LDH)测定
细胞死亡是由量化评价的质膜损伤导致乳酸脱氢酶(LDH)的释放。LDH水平细胞培养上清液中检测到LDH释放细胞毒性试验检测设备(Beyotime,中国)后,制造商的指示。
2.10。流式细胞术(FCM)
HT22细胞和C8-B4细胞用PBS (C0221A;Beyotime,中国上海),然后用胰酶消化(C0203;Beyotime,中国上海)和下一个离心机 5分钟后OGD / R。浮在表面的被丢弃的然后在PBS resuspended收集细胞。悬浮的细胞数和贴上膜联蛋白V (AV)和propidium碘(PI),之后,流式细胞术(番石榴easyCyte™8,微孔,美国)来定量确定和精心分析pyroptosis细胞。
2.11。免疫印迹分析
蛋白溶解产物(鼠海马组织,HT22细胞,C8-B4细胞)是准备使用增溶的解决方案(20毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值(7.4),150毫米氯化钠,NP-40 1%, 1毫米EDTA, PMSF 1毫米,1毫米EGTA, 1% tritonx - 100, 2.5毫米焦磷酸钠,1毫米Na3签证官41毫米beta-glycerolphosphate 1毫克/毫升leupeptinglycerolphosphate,和1毫克/毫升亮抑酶肽)。蛋白质浓度测定采用Bio-Rad蛋白质测定试剂(美国大力神,CA)。同等数量的蛋白质是由10%的sds - page分离NLRP3 GSDMD-N(1: 1000)和12% (1:1000),il - 1分开β(1:500),地震- (1:1000),XBP-1s (1: 1000), XBP-1(1: 2000),裂解Caspase-1 (1: 1000)β肌动蛋白(1:10000),然后转移到PVDF膜(美国密理博公司,Billerica的)。膜浸泡在5%脱脂奶(在PBS, pH值7.2,包含0.1% Tween-20)一夜之间在4°C,然后孵化主要抗体后过氧化物酶共轭anti-mouse或anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 10000) (KPL,盖瑟斯堡,医学博士,美国)。抗原决定基的可视化是一种ECL免疫印迹检测设备(美国密理博公司,Billerica的)。其他步骤遵循每个抗体的指令。所有抗体的详细目录数据表中列出1。微分析使用ImageJ执行软件。
2.12。定量实时聚合酶链反应(q-PCR)
我们跟着白等的方法。24]。大鼠海马组织的收获是在前面描述的方法。从组织总RNA提取使用RNAiso +试剂(豆类、日本、猫。没有。108-95-2)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸合成使用恢复援助的第一站互补脱氧核糖核酸合成装备(ThermoFisher科学、UAB K1622)。量化的表达Xbp1拼接,Xbp1 unspliced, NLRP3, il - 1β地震,q-PCR进行CFX96触摸thermocycler(应用生物系统公司)使用SYBR®预混料交货Taq™II(应用生物系统公司/ ThermoFisher科学,UAB A25742)。引物序列Xbp1拼接,Xbp1 unspliced, NLRP3, il - 1β、地震和GAPDH (Sangon生物科技、上海、中国)如下表2。
PCR扩增在95°C进行了30年代,紧随其后的是45周期95°C的5 s和55°C 30年代。GAPDH是作为内生控制规范化的差异。荧光数据都是由PCR postdata分析软件处理程序。基因表达水平的差异分析2- - - - - -ΔΔCT方法。
2.13。统计分析
数据表示为 。通过使用SPSS软件进行统计分析。单向方差分析之后,事后Bonferroni多重比较测试是用来比较控制和治疗组。被认为具有统计显著性值小于0.05。屁股都代表实验,进行至少三次。
3所示。结果
3.1。CI / R行为引起的赤字,脑缺血性损伤和神经元死亡大鼠MCAO模型
证实大鼠MCAO模型能否成功导致CI / R损伤、步态分析、神经功能缺损评分,并破坏卷在虚假的评价组,24 h组,48 h组和72 h组。虚假的组相比,24 h组,48 h组和72 h组表现出异常步态(图1(一)),其步长显著降低(图1 (b))( , )。同时,24小时组的神经功能缺损评分,48 h组和72 h组显著高于假组(图1 (c))( , )。TTC染色(图被用来评估侧卷1 (d))。虚假的组相比,24 h组,48 h集团和72 h组表现出42.3%,38.3%,和32.6%的梗塞率(图1 (e))( , )。调查的CI / R-induced脑损伤,苏木精和伊红())染色和尼氏小染色观察模型的变化。的形式的海马CA1区神经元死亡发生在24 h组,48 h集团和72 h组记录,包括凋亡细胞(膜起泡、萎缩soma和集中核)和pyroptotic细胞(肿胀,表现出白菜或fried-egg-like外观与分离核的中心),而虚假的群体表现出正常的外观(图1 (f))。虚假的组相比,一个明显的减少在CA1区神经元密度在24 h集团指出,48 h组和72 h组(图1 (g))。这些结果表明,大鼠MCAO模型能够诱导行为赤字和神经元死亡。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.2。CI / R激活XBP-1切片、神经炎症和神经元Pyroptosis大鼠MCAO模型
以前的研究证实,XBP-1与CI / R有关,和Xbp-1s信使rna表达水平测定。虚假的组相比,信使rna表达水平Xbp-1s在24小时组显著增加,48 h组和72 h组(图2(一个))( , ),XBP-1s的表达也显著增加24小时组48 h组和72 h组(数字2 (e)和2 (f))( , )。XBP-1s可以激活NLRP3炎性体(20.),信号NLRP3 inflammasomes在CI / R是一个基本机制。虚假的组相比,mRNA的表达水平NLRP3在24小时组显著增加,48 h组和72 h组(图2 (b))( , ),和NLRP3的表达水平也显著增加24小时组48 h集团和72 h集团(数字2 (e)和2 (g))( , )。的NLRP3 inflammasomes组装和触发pro-Caspase-1的autocleavage Caspase-1 [25]。虚假的组相比,表达水平劈裂Caspase-1显著增加在24 h组和48 h组(数字2 (e)和2 (h))( , )。然后,活跃Caspase-1生成一个氨基端GSDMD片段(GSDMD-N)裂开GSDMD,这是公认的重要执行者pyroptosis诱导膜孔隙的形成(26]。虚假的组相比,GSDMD-N的表达水平显著增加24小时组48 h组和72 h组(数字2 (e)和2(我))( , )。il - 1β和地震也评估并确定与之前的研究相一致的信使rna表达水平IL-1β( , )和地震-( , ),在24小时组显著增加,48 h组和72 h组(数据吗2 (c)和2 (d))。虚假的组相比,il - 1的表达β( , )和地震( , )显著增加的24 h组48 h组(数据吗2 (e),2 (j),2 (k))。这些结果表明,CI / R损伤会导致XBP-1切片,神经炎症,神经元pyroptosis在大鼠MCAO模型中。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
3.3。OGD / R细胞生存能力降低,增加细胞毒性,XBP-1切片,在HT22细胞和炎症
HT22是一个广泛使用的海马神经元细胞线。调查的影响OGD / R HT22细胞,细胞生存能力和细胞毒性验证通过使用CCK-8化验和LDH释放,分别。如数据所示3(一个)和3 (b),OGD / R细胞生存能力下降( , )和显示明显的毒性作用 , )。调查哪种类型的细胞死亡是由OGD / R, Z-YVAD-FMK (Caspase-1的抑制剂,20μM)和polyphyllin VI(诱导物的Caspase-1-mediated pyroptosis, 4μ米)被用作一个积极的控制。在先前的研究涉及OGD / R和polyphyllin VI,诱导细胞死亡,而Caspase-1抑制剂抑制这种反应。OGD / R有类似polyphyllin VI(数据的影响3(一个)和3 (b))。OGD / R的表达增加切片XBP-1 ( , ),NLRP3 ( , ),Caspase-1 ( , ),GSDMD-N ( , ),il - 1β( , ),和地震( , ),主要可能是被Z-YVAD-FMK和类似于polyphyllin VI的影响(数据吗3 (c)- - - - - -3(我))。这些结果表明,OGD / R细胞生存能力下降,增加细胞毒性和诱导XBP-1切片,炎症,pyroptosis HT22细胞。因此XBP-1可能与pyroptosis HT22细胞后OGD / R。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
3.4。OGD / R细胞生存能力降低,增加细胞毒性,XBP-1切片,在C8-B4细胞和炎症
确认上面的结果在不同的细胞系,用小鼠C8-B4小胶质细胞细胞系。如图S1一个和S1B, OGD / R细胞生存能力下降( , )和LDH的释放增加( , )。OGD / R的表达增加切片XBP-1 ( , ),NLRP3 ( , ),Caspase-1 ( , ),GSDMD-N ( , ),il - 1β( , ),和地震( , ),主要可能是被Z-YVAD-FMK和类似于polyphyllin VI的影响(图S1C -S1我)。这些结果表明,OGD / R细胞生存能力,减少LDH释放增加,诱导XBP-1切片,炎症,pyroptosis C8-B4细胞。因此,XBP-1在C8-B4细胞可能参与pyroptosis OGD / R。
3.5。表达下调XBP-1恢复细胞活力和抑制细胞毒性和Pyroptosis引起OGD / R HT22细胞
进一步检查是否XBP-1表达式可以调节Caspase-1-mediated pyroptosis, XBP-1使用XBP-1 siRNA表达下调。如数据所示4(一)和4 (b),OGD / R细胞生存能力下降( , )和LDH释放增加( , ),这可能大多被下调XBP-1 Z-YVAD-FMK在类似的方式的影响。在这个实验中,π和膜联蛋白V双染色法被用来展示pyroptotic细胞。OGD / R组有较高Annv /πdouble-positive细胞群(pyroptosis率)比对照组(数字4 (c)和4 (d))( , )和polyphyllin六世集团是一样的;然而,表达下调XBP-1可以减少类似Z-YVAD-FMK的影响。表达下调XBP-1也减少切片XBP-1的表达( , ),NLRP3 ( , ),Caspase-1 ( , ),GSDMD-N ( , ),il - 1β( , ),和地震( , ),像Z-YVAD-FMK(数据的影响4 (e)- - - - - -4 (k))。这些结果表明,增加差别XBP-1对这些细胞生存能力,减少LDH释放,和减少XBP-1切片,炎症,pyroptosis HT22细胞。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
3.6。表达下调XBP-1恢复细胞活力和抑制细胞毒性和Pyroptosis OGD / R C8-B4细胞
我们确认上述结果在C8-B4细胞,如图S2一个和S2B;OGD / R细胞生存能力降低,增加LDH的释放,这很大程度上抑制了表达下调XBP-1,类似于Z-YVAD-FMK的影响。OGD / R组表现出pyroptosis率高于对照组(图S2C,S2D) ( , )和polyphyllin六世集团是一样的;表达下调XBP-1可能降低利率,以类似的方式Z-YVAD-FMK的影响。表达下调XBP-1也减少切片XBP-1的表达( , ),NLRP3 ( , ),Caspase-1 ( , ),GSDMD-N ( , ),il - 1β( , ),和地震( , )类似于Z-YVAD-FMK(图S2E -S2通过差别K)。这些结果表明,对这些XBP-1增加细胞活力,减少LDH释放,和减少XBP-1切片,炎症,pyroptosis C8-B4细胞。
4所示。讨论
缺血性中风已经成为一个主要的人类威胁,脑缺血再灌注损伤的组织的潜力引起了科学家的注意27]。研究表明,炎症反应是一个主要组件的病态发展CI / R和也是神经元死亡的主要原因之一(5]。在这项研究中,我们使用了一个体内大鼠模型和体外细胞培养模型研究CI / R创伤性神经毒性的潜在机制。我们的结果表明,pyroptosis介导OGD / R-induced HT22细胞和C8-B4细胞毒性。我们也证明了通过基因手段减少XBP-1 mRNA获救OGD / R-induced激活NLRP3 inflammasome和pyroptosis NLRP3 / Caspase-1 / GSDMD通路(图5)。
与细胞凋亡,pyroptosis取决于Caspase-1的激活(28),不太理解在CI / R损伤。Caspase-1的激活可导致GSDMD的乳沟29日)生成N-domain GSDMD,进而形成膜毛孔,调节细胞因子的释放,由于水流入细胞肿胀,膜破裂,最后溶解细胞(23,30.- - - - - -32]。Pyroptosis特点是孔隙的形成,早期渗透肿胀,膜完整性的损失。通过扮演一个关键的pyroptotic执行人,GSDMD n端片段能够诱导膜孔隙的形成(26]。在这项研究中,炎症反应在大鼠MCAO模型和pyroptosis OGD / R细胞模型详细描述(数据1- - - - - -4和图S1- - - - - -2)。(图)染色大鼠MCAO模型1 (f))透露pyroptotic变化的特点。这些结果表明,pyroptosis可能包含在由CI / R的响应。
在小胶质细胞,活跃Caspase-1可以带来pyroptosis通过膜内的孔(33]。由inflammasome激活,pyroptotic细胞死亡在缺血性中风(脑损伤小胶质细胞恶化34,35]。因此,HT22细胞和C8-B4细胞被照亮pyroptosis XBP-1机制的影响。的NLRP3 inflammasome信号的最初反应是介导炎症反应过程中缺血性中风(21]。根据先前的研究,我们的研究结果证实了NLRP3 inflammasome信号被激活在CI / R损伤,和NLRP3 mRNA水平和表达的增加大鼠MCAO模型(图2)。此外,NLRP3增加了OGD / R的表达(数字3和4),由Z-YVAD-FMK逆转。
装配NLRP3 inflammasome触发pro-Caspase-1 autocleavage活跃Caspase-1 (25),这被认为是调节pyroptosis。与之前的研究一致,本研究表明pro-Caspase-1被激活在CI / R损伤;Caspase-1的表达增加大鼠MCAO模型(图2)。Caspase-1增加了OGD / R的表达(数字3和4),由Z-YVAD-FMK逆转。Caspase-1劈开GSDMD释放GSDMD-N域和激活il - 1β和地震13]。我们的研究结果表明,GSDMD-N的表达水平,il - 1β,和地震增加老鼠在CI / R损伤(图2),这是符合上涨mRNA表达il - 1的含量β和地震。此外,GSDMD-N的表达水平,il - 1β,地震也增加了OGD / R(数字3和4)和被Z-YVAD-FMK逆转。这些结果表明,pyroptosis可能防止神经元损伤的抑制CI / R损伤。
通过NLRP3 Polyphyllin VI可以诱导Caspase-1-mediated pyroptosis / GSDMD信号轴(36]。在这项研究中,polyphyllin六世被选为一个积极的控制。OGD / R的证明能力一样polyphyllin VI引发pyroptosis HT22细胞和C8-B4细胞(数字3- - - - - -4和图S1- - - - - -2)。
增加体外和体内的证据证明CI / R损伤激活ER应激。在展开的蛋白质反应(UPR)激活,inositol-requiring跨膜激酶/ endonuclease-1 (IRE1)激活它的内切核糖核酸酶(核糖核酸酶)活性通过二聚和自身磷酸化37]。的IRE1核糖核酸酶去除亮氨酸拉链的26个核苷酸基因内区转录因子XBP-1并产生一个转移的XBP-1 mRNA转录(XBP-1拼接mRNA的)。然后,拼接XBP-1 (XBP-1s) mRNA转录翻译成一个强有力的因素,负责upregulation基因编码ER陪伴和促炎基因生产(38]。激活XBP-1用来重建ER的体内平衡和分泌途径。此外,除了它的重要性在蛋白质分泌和脂质代谢,XBP-1s也调节免疫反应(37]。转录因子XBP-1代表ER应激反应的重要组成部分,需要保持一代的促炎细胞因子在炎症反应。之前的研究没有澄清XBP-1和pyroptosis之间的关系。此外,以往的研究表明,缺乏XBP-1增加老鼠对细菌感染的易感性和受损宿主防御39]。因此,XBP-1与NLRP3-associated炎症关系密切,Caspase-1-mediated pyroptosis。重要的是,抑制Caspase-1激活使用Z-YVAD-FMK或XBP-1击倒的siRNA大大减轻OGD / R-induced激活NLRP3 inflammasome和产生的细胞死亡。同样,IRE1 / XBP-1分支的UPR信号可以调节巨噬细胞的炎症反应。使用IRE-1α抑制剂,31 - 083010或XBP-1可以选择性地抑制IRE-1的基因沉默α/ XBP-1s分支然后减弱cadmium-induced NLRP3 inflammasome激活和pyroptosis HK-2细胞(20.]。我们的研究结果表明,XBP-1s增加在CI / R损伤鼠模型和细胞模型(图2),因此XBP-1可能是一个关键因素。表达下调XBP-1可以减少NLRP3的表情,Caspase-1, GSDMD-N, il - 1β和地震(图4和图S2)。表达下调XBP-1 Z-YVAD-FMK一样的效果。的减少地震-特别是对CI / R(有一个有意义的影响40),因为它减少了巨噬细胞和中性粒细胞的聚集,减少炎性分子的表达地震的下游。
我们的研究结果表明,XBP-1可能参与pyroptosis并可能发挥重要的作用在调节pyroptosis CI / R损伤。表达下调XBP-1可以抑制NLRP3 inflammasome激活和可能引起的pyroptosis OGD / R或MCAO。这些影响可以保护神经元通过NLRP3 / Caspase-1 / GSDMD通路(图5)。这些发现可能会提供一个更好的理解和CI / R损伤的新治疗策略。
5。结论
本研究表明,表达下调XBP-1可以通过抑制抑制pyroptosis NLRP3 / Caspase-1 GSDMD通路在海马体救脑缺血/再灌注损伤。
数据可用性
所有数据集提出了在本研究中都包含在这篇文章。所有的数据都是真实的,保证实验结果的有效性。
伦理批准
本研究遵循的传统要求当地委员会批准的实验操作和动物使用和保护云南省(没有。LA2008305)。
的利益冲突
作者声明没有金融和非金融利益冲突。
作者的贡献
嘉鑫刘设计和监督。肖Zhihui姚明和严执行的行为实验,导致部分动物数据的采集。Zhihui姚明和小玲张协助让小鼠组织。本张进行生化分析、免疫印迹,PCR分析。Yueting张和嘉鑫刘分析数据和写论文。所有作者都阅读和批准的最终版本。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(81860338和81860338 at070115号)和云南省的基础人才培养(KKSY201960025)。
补充材料
图S1和S2图可以补充文件中找到。(补充材料)