文摘

背景。子痫前期(PE)是孕产妇和围产期发病率和死亡率的主要原因。PE患者的肠道微生物群失衡伴随着升高血清脂多糖(LPS)的水平,但它是否影响PE的发生和发展,这种现象的潜在机制仍不清楚。本文打算研究之间的关系lncRNA BC030099,炎症,在PE和肠道微生物群。方法。收集病人的粪便和肠道微生物群变化评估16 s rRNA PICRUSt测序和路径分析。接下来,我们研究了有限合伙人和lncRNA BC030099水平粪便或PE患者的胎盘。然后,我们撞倒lncRNA BC030099 HTR-8 / SVneo细胞和NF -补充道κB通路抑制剂JSH-23。CCK-8和Transwell化验进行确定细胞增殖,迁移和入侵。免疫印迹是用来评估MMP2, MMP9,蜗牛,和钙粘蛋白,导出κBα,我κBα和核NF -κB p65水平。il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α水平被ELISA检测。结果。肠道微生物群改变PE患者,微生物与LPS生物合成相关的基因明显升高在体育组的肠道微生物群。有限合伙人在粪便和胎盘的PE组明显升高。体育组的胎盘lncRNA BC030099水平也明显提升。击倒的lncRNA BC030099提升HTR-8 / SVneo细胞增殖,迁移和入侵。击倒的lncRNA BC030099高架MMP2, MMP9,蜗牛水平和压抑的钙粘蛋白水平。此外,lncRNA BC030099 NF -的影响κB通路。此外,NF -κB抑制剂逆转HTR-8 / SVneo细胞增殖,入侵和LPS引起的迁移。结论。肠道微生物群失调在PE导致HTR-8 / SVneo细胞增殖,入侵和迁移通过lncRNA BC030099 / NF -κB通路。

1。介绍

子痫前期(PE)是妊娠高血压疾病参与全球2%到8%的妊娠相关并发症(1]。这是孕产妇和围产期发病率和死亡率的主要原因(2]。PE的病因和发病机理尚未完全阐明。目前,主要认为是子宫螺旋小动脉重塑不足、过度激活的炎症免疫,和血管内皮细胞受损3]。PE的临床治疗措施有限,关注急性高血压的控制,预防PE、交货及时,唯一有效的治疗方法是胎儿和胎盘的交付(4]。因此,深入理解体育的发病机理可以为临床预测和预防PE提供指导,避免严重并发症的孕妇,改善妊娠结局。

长非编码RNA的RNA分子(lncRNAs)是一个类 ,可以通过表观遗传调节目标基因表达的转录和转录后的调控。它是参与不同的生物过程包括细胞分化和增殖,细胞凋亡和坏死5,6]。此外,lncRNA表达异常与疾病进展(7]。因此,lncRNAs在PE发病机制的作用也吸引了很多注意力。罗等人筛选lncRNA表达谱在PE患者的胎盘,暗示lncRNA表达异常可能是体育的原因之一(8]。在此基础上,太阳等人发现5知道uterus-related lncRNAs的表达式在48 PE患者和24 non-PE健康受试者,发现lncRNA BC030099表达显著促进,表明等离子体水平的升高lncRNA BC030099加速体育风险有关,可以作为潜在的生物标志物预测PE的发生(9),但是否参与体育的疾病进展,其具体机制仍需进一步探讨。

肠道微生物群是一种栖息在人类肠道微生物种群,用一个大的数量和种类,参与人体的新陈代谢和保持人体的内稳态10]。最近,肠道微生物群的变化之间的关系和妊娠疾病已经收到了广泛的关注。研究发现,免疫耐受,炎症反应,葡萄糖,异常和脂质代谢,氧化应激引起的肠道微生物群失衡可能参与体育发病机理(11,12]。肠道微生物群的研究提供新的预防和治疗PE的目标和想法。脂多糖(LPS),作为一个产品的肠道微生物群,可以导致身体和炎症与各种疾病发生和发展。研究揭示了PE患者的肠道微生物群失衡是伴随着增加血清LPS水平(12),但它是否影响PE的发生和发展,这种现象的潜在机制仍不清楚。此外,累积证据表明lncRNAs可能影响LPS-induced PE动物或细胞模型通过各种信号通路。黄等人构建体育鼠模型有限合伙人和显示,过度的lncRNA Uc.187可能怀孕的老鼠模型中诱导PE-like症状影响的分布β连环蛋白在细胞质和细胞核(13]。有限合伙人陈等人用于治疗HTR-8 / SVneo细胞,发现lncRNA KCNQ1OT1可能目标的规定mir - 146 - a - 3 - p通过CXCL12 / CXCR4在扩散途径,入侵和HTR-8迁移/ SVneo细胞(14]。然而,机制lncRNA BC030099 PE尚不清楚。

因此,基于上述背景,本研究拟探索lncRNA BC030099,炎症和肠道微生物群在体育的关系。我们的研究可能为诊断和治疗提供新的目标PE、以及新思想研究PE的病理机制。

2。材料和方法

2.1。收集临床样本

我们收集了PE患者的粪便和胎盘组织在中南大学湘雅医院PE组( )。健康受试者在同一时期被选为对照组(C组, )。本研究的入选标准如下:在批准岁;孕周从32到39;单;没有胎儿流产和死胎;没有不良妊娠和分娩的历史;和辅助生殖的历史;无吸烟史、饮酒和其他药物。排除标准是多个怀孕;糖尿病、慢性高血压和肾脏疾病或其他妊娠并发症在怀孕前;抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂前1月内粪便收集和其他药物(12]。粪便样本中收集的粪便收集管和储存在-80°C,直到进一步的处理。

2.2。16 s rRNA测序和PICRUSt途径分析

健康受试者的粪便样本( )和PE患者( )收集检测微生物多样性的变化。Illumina公司NovaSeq PE250是申请16 s扩增子测序获得的原始数据。序列数据分析主要用于Qiime 2 (qiime2 - 2020.2)和R软件(4.0.2)。此外,是由PICRUSt KEGG途径分析。

2.3。酶联免疫吸附测定(ELISA)

根据有限合伙人(CUSABIO CSB-E09945h,中国),il - 1β(中国CUSABIO CSB-E08053h)、肿瘤坏死因子-α(中国CUSABIO CSB-E04740h)和il - 6(中国CUSABIO CSB-E04638h) ELISA指令,我们发现有限合伙人在粪便和胎盘组织和il - 6水平,il - 1β和肿瘤坏死因子-α在细胞水平。20毫克的粪便和胎盘组织拍摄,分别和血迹洗 。粪便和胎盘组织被切成小块,放入组织磨床(匀浆管),200年μl 添加了匀浆,然后将在一夜之间在-20°C。经过反复冻融治疗两次破坏细胞膜,组织匀浆离心机在5000 g (2 - 8°C) 5分钟取上层清液,这应该被检测到。细胞,进行离心1000 g (2 - 8°C) 15分钟,和上层清液应立即检测到。

2.4。细胞治疗

人类滋养层细胞HTR-8 / SVneo从Tongpai购买(上海)生物技术有限公司,有限公司,和文化条件如下:rpmi - 1640中型和10%胎牛血清的边后卫。应用LPS诱导细胞炎症(15,此外,lncRNA BC030099撞倒,被分组到si-control, si-con + LPS, si-BC030099, si-BC030099 + LPS组。此外,我们添加了10μM NF -κB-specific抑制剂JSH-23(默克公司、德国)16),分组控制、有限合伙人JSH-23,有限合伙人+ JSH-23组。lncRNA BC030099表达式被撞倒了。si-BC030099和消极控制si-control被Sangon合成生物技术有限公司(上海,中国)。

2.5。实时定量PCR(存在)

使用试剂盒法提取总RNA, RNA是反向转录成互补利用cDNA逆转录工具包(# CW2569,北京ComWin生物技术,中国),和超SYBR荧光定量应用混合物(# CW2601、北京ComWin生物科技、中国)。基因的相对表达是研究在一个PCR仪(美国热QuantStudio1)。使用GAPDH作为内部参考,2- - - - - -ΔΔCt方法进行计算lncRNA BC030099水平。引物如下:lncRNA BC030099-F: GCCTCCATCCTTTCAGACCC和lncRNA BC030099-R: GCCCTTGGAAAGTGTCAGGA;GAPDH-F: ACAGCCTCAAGATCATCAGC和GAPDH-R: GGTCATGAGTCCTTCCACGAT。

2.6。免疫印迹

总蛋白从细胞中提取了里帕裂解缓冲(Beyotime P0013B,中国),其次是蛋白质量化,与sds - page混合加载缓冲区,和蛋白质吸附在PVDF膜凝胶电泳。MMP2 (10373 - 2 - ap, 1: 500年,Proteintech,美国),MMP9 (Abcam ab76003, 1: 5000年,英国),蜗牛(13099 - 1 - ap 1: 500年,Proteintech,美国),和钙粘蛋白(20874 - 1 - ap 1: 1000年,Proteintech,美国),我κBαAbcam (ab32518 1: 500年,英国),导出κBαAbcam (ab133462 1: 10000年,英国),和核NF -κB p65 (10745 - 1 - ap, 1: 1000年,Proteintech,美国主要的抗体β肌动蛋白(66009 - 1 -搞笑,1:1000年,Proteintech,美国)在4°C孵化过夜。合二次抗体被孵化。可视化进行了使用ECL发光液(美国k - 12045 d50 advansta)。β肌动蛋白作为内部参考检查蛋白质含量。

2.7。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定

细胞分组上面有消化和清点,播种在96孔板( 细胞/),100年μL /。培养贴壁细胞后,我们跟着上面的方法,相应的时间,然后添加10μ信用证的CCK-8每个。孵化后37°C和5%的公司24 h,分析了吸光度(450海里)的Bio-Tek标(mb - 530、头脑、中国)。

2.8。Transwell化验

/毫升细胞在无血清培养基resuspended, 100μL细胞悬液加入Transwell室(美国康宁# 33318035)上,和10%的边后卫添加到众议院和培养48 h。室培养基被丢弃。细胞上心室与湿棉签擦拭。4%多聚甲醛固定的。细胞染色用水0.5%结晶紫和筛选了。细胞的外表面上气室在显微镜下观察(奥林巴斯、日本)和拍照。检测细胞入侵使用Transwell执行室(美国康宁3428)与基底膜基质基底膜矩阵(美国BD Biocoat 354262)。其他步骤如上所述。

2.9。统计分析

统计分析了使用Graphpad Prism8.0统计软件。测量数据表示为 。一个未配对 - - - - - -测试组间使用,单向方差分析被用于比较在多个组。有限合伙人的相关性和lncRNA BC030099 PE胎盘组织中被枪兵的相关分析计算。 表示一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。PE患者的肠道微生物群是改变,关键路径目标(LPS)筛选

首先,我们分析了改变肠道微生物群的16 s rRNA PICRUSt测序和路径分析。图1(一)曲线显示丰富的排名。维恩图解显示之间的共享和独特的asv组(图1 (b))。其中,有314 asv的对照组,184 asv独特的PE患者,213 asv共享的两组。的相对丰度直方图top20 asv在属水平进一步建议每组微生物群落的丰度和组成是不同的(图1 (c))。如图1 (d),前20名占统治地位的肠道微生物群的相对丰度在门级显示。此外,KEGG显示对LPS生物合成相关基因的微生物在肠道微生物群在PE组显著升高(图1 (e))。

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图1
肠道微生物群在PE患者改变,筛选关键路径目标(有限合伙人)。(一)排名丰度曲线。(b)文氏图。(c)排名前20位的相对丰度直方图asv在属水平。(d)前20名占主导地位的肠道微生物群的相对丰度在门级。(e) PICRUSt KEGG途径分析。答:对照组;B: PE组。
3.2。有限合伙人呈正相关,lncRNA BC030099

接下来,我们检查了LPS水平粪便和PE患者的胎盘。有限合伙人级别的粪便和胎盘PE组比对照组显著升高(图2(一个))。此外,我们使用中存在评估lncRNA BC030099水平PE患者的胎盘。体育组的胎盘lncRNA BC030099水平也比对照组明显升高(图2 (b))。斯皮尔曼相关分析显示有限合伙人之间有显著的正相关,lncRNA BC030099表达式在胎盘组织(图2 (c))。

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图2
有限合伙人呈正相关,lncRNA BC030099。(一)有限合伙人级别在粪便和胎盘组织体育和对照组。(b) lncRNA BC030099水平在PE和对照组胎盘组织。(c)有限合伙人的相关性和lncRNA BC030099 PE胎盘组织中被斯皮尔曼相关分析的评估。 与C(控制)。
3.3。击倒的lncRNA BC030099促进滋养层细胞增殖,入侵和迁移

接下来,我们撞倒lncRNA BC030099。我们发现lncRNA BC030099表达被压抑si-BC030099组相比si-control组。这表明我们成功推倒lncRNA BC030099。与si-BC030099组相比,lncRNA BC030099表达si-BC030099 + LPS组(图3(一个))。细胞功能实验显示与si-control组;si-BC030099组增强细胞增殖、迁移和入侵的能力。然而,si-BC030099 + LPS组显示减少细胞增殖,迁移和入侵比si-BC030099集团(数字3 (b)- - - - - -3 (d))。上述结果表明击倒lncRNA BC030099促进滋养层细胞增殖,入侵和迁移。

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图3
击倒的lncRNA BC030099促进滋养层细胞增殖,入侵和迁移。(一)lncRNA BC030099在滋养层细胞表达。(b) CCK-8分析是用来衡量HTR-8 / SVneo细胞增殖。(c, d) Transwell化验进行监控HTR-8 / SVneo细胞迁移和入侵。 ; 与si-control,# 与si-con + LPS,@ 与si-BC030099。
3.4。击倒的lncRNA BC030099高架MMP2、MMP9和蜗牛水平和压抑的钙粘蛋白水平

此外,免疫印迹分析表明,MMP2, MMP9,蜗牛表达式中增加si-BC030099组相比si-control组。但si-BC030099 + LPS组显示减少的表达MMP2, MMP9,和蜗牛比si-BC030099组。钙粘蛋白的趋势是相反的蜗牛(图4)。集体,击倒lncRNA BC030099高架MMP2, MMP9,和蜗牛水平和压抑的钙粘蛋白水平。


图4
击倒的lncRNA BC030099高架MMP2、MMP9和蜗牛水平和压抑的钙粘蛋白水平。免疫印迹是用来评估MMP2, MMP9,蜗牛,HTR-8 / SVneo细胞钙粘蛋白的水平。 与si-control,# 与si-con + LPS,@ 与si-BC030099。
3.5。lncRNA BC030099 NF -的影响κB通路

接下来,我们检查了NF -κB pathway-related蛋白质表达。与si-control组相比,si-con + LPS组我也呈现出一定的下降κBα表达式,导出的增加κBα和p65表达式;我κBαsi-BC030099组被提拔的表达式,并导出κBα和p65表达被抑制了。然而,si-BC030099 + LPS组有压抑的我κBα表达式,导出了电κBα和p65表情比si-BC030099组(图5(一个))。此外,我们研究炎症相关的标记表达式。与那些si-control组相比,il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α水平si-con + LPS组促进;il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α水平si-BC030099组被压抑。si-BC030099 + LPS组升高il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α水平比si-BC030099组(图5 (b))。总之,lncRNA BC030099 NF -的影响κB通路。

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图5
lncRNA BC030099 NF -的影响κB通路。(一)免疫印迹进行确定》κBα,我κBα和核NF -κB HTR-8 p65水平/ SVneo细胞。(b) il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-αELISA测定水平。 与si-control,# 与si-con + LPS,@ 与si-BC030099。
3.6。NF -κB抑制剂逆转滋养层细胞增殖、入侵和迁移引起的有限合伙人

最后,我们使用了NF -κB通路抑制剂JSH-23。我κBα表达式被镇压,导出κBα并促进p65表情LPS组比对照组。然而,与LPS组相比,有限合伙人+ JSH-23组显示我的增加κBα表达式,导出下降κBα和p65表情(图6(一))。细胞功能实验显示,与对照组相比,LPS组降低了细胞增殖、迁移和入侵能力。添加JSH-23之后,有限合伙人+ JSH-23组增强细胞增殖,迁移和入侵的能力(数据6 (b)- - - - - -6 (d))。然后,我们用免疫印迹检测MMP2, MMP9,蜗牛,钙粘蛋白的水平。MMP2, MMP9,蜗牛表情抑制LPS组比对照组。添加JSH-23之后,MMP2、MMP9和蜗牛表达式也压抑的有限合伙人+ JSH-23组。钙粘蛋白的趋势是相反的蜗牛(图6 (e))。上述结果表明,NF -κB抑制剂逆转滋养层细胞增殖、入侵和迁移引起的有限合伙人。

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图6
NF -κB抑制剂逆转滋养层细胞增殖、入侵和迁移引起的有限合伙人。(一)我κBα导出,κBα,核NF -κB p65滋养层细胞中表达。(b)细胞活性由CCK-8分析决定。(c, d)细胞迁移和入侵被Transwell化验检查。(e)免疫印迹进行确定MMP2, MMP9,蜗牛和滋养层细胞的钙粘蛋白水平。 。 与控制;# 与有限合伙人。

4所示。讨论

体育是一种严重的妊娠并发症,导致严重的孕产妇和胎儿的发病率和死亡率(17]。体育使孕产妇和儿童健康管理和导致不良妊娠结局的多数,但体育发展的机制仍不清楚。研究表明PE患者的肠道微生物群的结构已经发生了重大的变化,这可能与疾病的发生和发展有关(18]。然而,还需要进一步的研究来理解底层机制。在这个研究中,我们试图探索lncRNA BC030099,炎症和肠道微生物群在体育的关系。我们的研究可能有助于体育的早期诊断和针对性的监测。

殖民的新生儿肠道有益菌是必不可少的粘膜屏障的建立和维护,从而防止新生儿肠道病原体和局部和全身炎症19]。最近的进展显示异常微生物成分可能发挥作用在各种疾病发病机理包括体育20.]。改变肠道微生物群组成可以改变细菌和发布的短链脂肪酸概要文件导致高血压和代谢综合症(21]。陈等人发现PE患者压抑的细菌多样性和显著的生态失调(22]。我们的研究与之前的研究一致显示PE患者的肠道微生物群的变化。据报道产妇血il - 6水平与Bilophila和Oribacterium PE呈正相关,而与Akkermansia LPS水平负相关23]。张等人发现了大量的有限合伙人合成途径预测PE患者明显升高,而大量的G protein-coupled受体通路是显著地压抑11]。我们还发现肠道微生物群与有限合伙人生物合成是在体育组的肠道微生物群显著升高。

lncRNAs非编码记录,通常长度超过200元,最近成为一个最大的和显著不同的RNA的家庭(24]。lncRNAs现在已经成为重要的球员在几乎所有基因功能和监管水平(25]。研究显示循环lncRNA BC030099 PE患者的血浆水平显著高于健康受试者含量。升高血浆lncRNA BC030099水平与体育的风险升高,可能被认为是一种新型生物标志物(9]。通过验证,我们发现lncRNA BC030099水平体育组的胎盘也明显升高。此外,肠道微生物群对主机的影响脂质代谢可能是介导通过肠道microbiota-produced代谢物包括短链脂肪酸、二次胆汁酸、三甲胺,以及促炎bacterial-derived因素有限合伙人(26]。王等人的研究表明,PE患者肠道微生物群不平衡和高血浆LPS水平(12]。我们发现LPS水平的粪便和胎盘PE组显著促进有限合伙人和lncRNA BC030099表情明显呈正相关。这是我们第一次报告有限合伙人和lncRNA BC030099在体育中的作用。

lncRNAs已被证明参与不同的生物过程包括细胞生长,antiapoptosis,迁移和入侵27]。陈等人报道lncRNA KCNQ1OT1可以调节mir - 146 - a - 3 - p在HTR8 / SVneo细胞增殖,入侵,通过CXCL12 / CXCR4通路和迁移,这可能参与体育发病机理(14]。我们的研究也显示,击倒的lncRNA BC030099提升HTR-8 / SVneo细胞增殖,迁移和入侵。研究表明,血管基质金属蛋白酶是至关重要的介质和子宫重构和减少MMP2和MMP9表达被认为是参与高血压妊娠和PE (28,29日]。胎盘extravillous细胞入侵涉及到细胞EMT,几个EMT监管机构(包括蜗牛和钙粘蛋白)被发现在体育发展中起到至关重要的作用[30.]。击倒的lncRNA CRNDE已经报告给抑制增殖,迁移和入侵HTR-8 / SVneo细胞,抑制EMT的形成,减少蛋白质MMP2和MMP9的表达31日]。周等人报道,lncRNA SNHG12促进滋养层细胞迁移和入侵诱导EMT的发展(32]。符合他们的研究中,我们发现击倒lncRNA BC030099高架MMP2, MMP9,蜗牛水平和压抑的钙粘蛋白水平。

NF -κB是一个至关重要的转录因子,炎症相关蛋白表达(33]。NF -κB p65通路与体育有关,抑制NF -κB p65途径可以改善PE (34]。NF -κB和促炎细胞因子与滋养层功能障碍[已报告35),但潜在的机制尚不清楚。沃恩和沃尔什称,胎盘NF -κB在PE激活近10倍。氧化应激导致NF -κB在trophoblast-like激活细胞,增强TNF -α(36]。通过细胞实验,我们发现NF - LPS诱导细胞核过渡κB通过lncRNA BC030099。此外,NF -κB抑制剂逆转滋养层细胞增殖、入侵和迁移引起的有限合伙人。这也是我们第一次报告的作用机制有限合伙人,lncRNA BC030099和NF -κB p65体育。

总之,我们探索了有限合伙人的进化,lncRNA BC030099,和NF -κB p65参与体育发展及其机制。我们报告首次肠道微生物群失调在PE导致滋养层细胞增殖,入侵,和迁移通过lncRNA BC030099 / NF -κB通路。这项研究提供了一个参考探索lncRNA和肠道微生物群在体育机制。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

这项研究是通过中南大学湘雅医院的伦理委员会。这项研究是根据世界医学协会赫尔辛基宣言。关于这项研究的所有信息将完全由研究者向受试者解释。

所有的参与者提供知情同意在抽样之前。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

荣唐,龚小,王伟(音译)Qiongjing元,导致研究的概念和设计。荣唐和江Chun收集信息。荣唐写了初稿的手稿。玉剑被分配给贡献的数据聚合,验证,分析实验结果,手稿编辑。龚小,Qiongjing元,春江,魏王写的手稿。所有作者修改、读和批准了最终版本的手稿。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(81401227)和湖南省自然科学基金(2019 jj20035和2020 jj5942)。