文摘
子痫前期(PE)是一种常见的妊娠相关综合征的特点是慢性免疫激活。本研究旨在探索mir - 155的作用在体育的炎症发病机制。胎盘组织和外周血收集来自所有科目。BSP检测分析评价mir - 155甲基化水平。ELISA进行测量血清中炎性细胞因子的水平和MMP2和细胞上清液样本。HTR-8 / SVneo和JEG-3细胞转染mir - 155模拟和抑制剂建立中mir - 155和沉默mir - 155细胞模型,分别。治疗5-Aza进行改变的DNA甲基化水平mir - 155。体育大鼠模型建立了皮下注射后NG-nitro-L-arginine甲酯。CCK-8化验,TUNEL染色,Transwell试验进行。反向transcription-quantitative PCR,免疫印迹分析和免疫组织化学分析是用来分析相关基因表达水平。 The luciferase reporter assay was used to investigate the direct interaction between FOXO3 and miR-155. Results showed that miR-155 was remarkably upregulated and inversely correlated with the promoter methylation level in the placental tissue from PE patients. The在体外实验表明,mir - 155生存能力下降,移民,和入侵,但在滋养层细胞凋亡增加。FOXO3被确认为mir - 155的目标。转染mir - 155的抑制剂抑制炎症和氧化应激反应,但高增殖,迁移,和滋养层细胞的入侵,被5-Aza治疗或与si-FOXO3 cotransfection废除。总之,我们的数据表明methylation-mediated沉默mir - 155可以抑制细胞凋亡、炎症和氧化应激的滋养层细胞移植FOXO3。
1。介绍
子痫前期(PE)是最常发生的病理妊娠并发症2 - 8%的全球流行(1]。多元化的因素,包括受损氧气失调,胎盘氧化应激,慢性免疫激活和螺旋动脉重塑,参与体育的病理生理特点(2- - - - - -4]。在正常怀孕,收购入侵能力的滋养层中扮演一个重要的角色在螺旋动脉重塑和足够的血液灌注5]。即扩散、迁移和滋养层细胞侵入子宫有助于人类胎盘形成和胚胎植入(6]。因此,调查潜在的分子机制与受损的滋养层的扩散和入侵将有助于为体育提供更有效的治疗。
小分子核糖核酸(microrna)是一类小型非编码rna(研讨会核苷酸)的负调节基因的表达通过直接绑定3 - - - - - -翻译区(3 - - - - - -UTR)目标mrna的[7]。microrna经常表达异常胎盘组织和参与胎盘形成的不同方面,包括滋养细胞增殖、凋亡、分化、入侵、炎症反应、氧化应激(8- - - - - -12]。mir - 155的产品多基因保守区域的b细胞整合集群基因是由3个外显子和位于21号染色体(对方篮里13]。证据表明,mir - 155是调节胎盘中的大量孕妇患有PE (14]。杨et al。15)还表明,miR-15表达水平增加,积极与PE胎盘IL-17水平和血清,与正常组相比。尽管mir - 155失调广博的知识,对控制机制在PE mir - 155的表达。一种可能性是,DNA甲基化可能参与了这一过程,发生在网站的CpG二核苷酸和扮演一个重要角色在基因表达的调控16]。
功能,超表达mir - 155对体育发展的目标和表达下调血管生成调节因子CYR61 [13]。李等人的研究。17)透露,mir - 155负监管作用的迁徙行为HTR-8 / SVneo细胞通过调节以挪士。同样,戴et al。18]表明,mir - 155抑制增殖和入侵HTR-8 / SVneo通过下调细胞周期蛋白D1。这些数据都表明,mir - 155细胞增殖,减少移民和侵入性滋养层细胞。然而,知识的作用mir - 155 PE的炎症发病机制基本上仍不清楚。Forkhead-box类O转录因子3 (FOXO3) FOXO家族的重要成员,调节免疫细胞的增殖,如B淋巴细胞和T淋巴细胞(19]。先前的研究表明,mir - 155 / FOXO3轴不同疾病的发生和发展密切相关。例如,mir - 155导致耐药性通过瞄准FOXO3表达式在结肠癌20.和胰腺癌21]。重要的是,mir - 155似乎扮演一个角色在溃疡性结肠炎患者的肠道炎症的表达下调表达FOXO3 [22]。mir - 155 - 5 - p -调制促进成纤维细胞增殖的FOXO3在会阴部的地衣硬化症,一种慢性炎症性皮肤病(23]。最近的一项研究周et al。24)进一步表明,抑制mir - 155 / FOXO3轴是参与tanshinone花絮改善骨关节炎患者的炎症反应。考虑到炎症反应中起关键作用PE的发病机理,本研究旨在考察FOXO3是否mir - 155的直接下游调节器在PE的炎症发病机制。
这里,我们第一次使用BSP检测分析量化上游区域的甲基化水平mir - 155 PE患者,以确定他们是否甲基化在这个障碍。接下来,我们研究了mir - 155的功能作用在滋养层细胞RNA干扰或改变甲基化状态。此外,我们评估了mir - 155 / FOXO3信号在PE的炎症发病机制在体外和在活的有机体内。
2。材料和方法
2.1。临床样本
四十孕妇骨盆韧带(20例诊断为PE和20 non-PE)之间的郑州大学第三附属医院住院2017年8月和2019年11月参加这项研究后签署书面知情同意。PE的诊断是基于在妊娠高血压和子痫前期的诊断和治疗:在中国的临床实践指南(2020)(25]。胎盘传递时,立即组织是来自母亲的placent表面,然后snap-frozen液氮。同时,外周血(5毫升)在真空收集的脉管系统(试剂盒GmbH)从所有的病人。血清被离心收购在3000 g×10分钟37°C。研究伦理委员会批准的协议是郑州大学第三附属医院。
2.2。细胞培养
人类滋养层细胞系(HTR-8 / SVneo和JEG-3)和293 T细胞购自中国科学院细胞库。细胞系都RPMI 1640培养基培养(Gibco、上海、中国)补充10%的边后卫和1%的青霉素和链霉素孵化器有限公司为5%2在37°C。
2.3。寡核苷酸转染
mir - 155模拟,mir - 155抑制剂,负控制(数控),si-NC,由上海GenePharma和si-FOXO3合成有限公司(上海,中国)。然后转染HTR-8 / SVneo执行与上面的寡核苷酸和JEG-3细胞48 h使用Lipofectamine 2000(表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议。在救援的实验中,HTR-8 / SVneo和JEG-3细胞转染si-FOXO3,其次是转染mir - 155抑制剂。随后,细胞收获进行进一步分析。
2.4。治疗5-Aza
阻止DNA甲基化,HTR-8 / SVneo和JEG-3细胞治疗2.5μmol / l 5-aza-2 - - - - - -脱氧胞苷(5-Aza;Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)3天。然后,细胞转染和mir - 155抑制剂如前所述,在此期间培养基是每24小时更换一次。
2.5。细胞生存能力分析
人滋养层细胞的细胞生存能力是评估使用细胞计数Kit-8 (CCK-8;美国Dojindo分子技术,马里兰州)后,制造商的协议。简单地说,每组细胞被播种到96孔板的密度每24 h。3000个细胞然后,十毫升CCK-8解决方案添加到每个好,和细胞孵化了1,2,3 d在37°C。每个时间点的吸光度与微型板块阅读器阅读450海里(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。
2.6。末端Transferase-Mediated尼克结束标记测定(TUNEL)
TUNEL分析是用来检测DNA碎片在人类的滋养层细胞TUNEL试剂盒的指示。细胞核与DAPI染色溶解在PBS 20分钟在黑暗中在室温下。数字图像是通过荧光显微镜(德国徕卡)。
2.7。细胞迁移和入侵检测
Transwell化验了,陈等人描述(26]。细胞迁移试验,滋养层细胞( 细胞/)被播种在上层Transwell钱伯斯(8 -μ孔隙大小,配角,马萨诸塞州剑桥)和无血清培养基。下室挤满了中含有15%的边后卫。孵化24 h后,细胞迁移到低钱伯斯和4%多聚甲醛固定,沾0.1%结晶紫,持续15分钟。迁移细胞的数量统计在光学显微镜下三个随机选择的字段。入侵检测的过程是类似于迁移试验,除了Transwell插入预镀有基底膜基质(BD生物科学)。
2.8。荧光素酶报告实验
潜在的野生型(WT)序列的3 - - - - - -未翻译区(3 - - - - - -utr)人类FOXO3和突变mir - 155(傻瓜)序列的目标站点插入pmiR-RB-Report控制向量(Promega公司)生成重组向量,pmiR-WT和pmiR-MUT分别。接下来,构建重组向量(0.8μg)和mir - 155 cotransfected模仿或数控(100海里)到293 T细胞( )在37°C。进一步培养48 h后,细胞是细胞溶解,Dual-Luciferase记者的荧光素酶活性进行了分析化验设备(Promega公司)根据制造商的指示。
2.9。建立大鼠模型,体育
成人Sprague-Dawley老鼠(14 - 16周),50名男性和50名女性老鼠,购自南京Junke生物有限公司,有限公司的比率1:2,雄性和雌性老鼠笼在一起在发情期间的温度18-28°C和相对湿度40 - 70%。然后,怀孕的SD大鼠随机分为三组:虚假的集团体育集团和mir - 155抑制剂组(每组10只老鼠)。PE鼠模型建立了NG-nitro-L-arginine甲基酯的皮下注射剂量为200毫克/公斤/天七天。mir - 155抑制剂组与PE模型大鼠静脉注射了mir - 155抑制剂静脉注射。老鼠在虚假的组皮下管理同样体积的生理盐水。怀孕20天,老鼠被杀,和样本的血液和胎盘获得进行进一步分析。动物实验的动物保健和使用委员会批准郑州大学第三附属医院按照使用指南和照顾动物。
2.10。酶联免疫吸附试验(ELISA)
血清或细胞上清液炎性细胞因子的水平,包括炎性细胞因子白细胞介素- 6 (il - 6)、interleukin-8(引发)和肿瘤坏死因子-α(TNF -α),以及分析了MMP2使用商用高灵敏度ELISA试剂盒(欧洲研发系统有限公司)。他们的浓度测量按照相应的标准曲线。实验独立执行一式三份。
2.11。逆转录定量PCR (RT-qPCR)
总RNA分离组织样本或细胞系试剂盒试剂(美国表达载体)。反转录成RNA cDNA使用miScript逆转录II工具包或PrimeScript RT主混合装备(试剂盒、希尔登,德国)。与SYBR绿色qPCR RT-qPCR分析进行了分析(美国马萨诸塞州热费希尔科学)和gene-specific引物。相对基因表达水平计算使用2——∆∆Ct方法与U6 (microrna)或GAPDH (mRNA)内部控制。
2.12。BSP化验
BSP进行评估mir - 155甲基化水平。总之,基因组DNA是孤立的组织样本使用PureLink™基因组DNA迷你包(美国热费希尔)根据制造商的指示。亚硫酸氢钠修饰的DNA进行了使用EZ DNA Methylation-Gold工具包(美国Zymo研究)。pcr(引物序列:转发:GGTTGTGTTTGAGAATAAAGGGG;相反:CCAACCAATATAACTCGCCCT)进行ZymoTaq™预混料(Zymo研究、美国)在下列条件:10分钟90°C;50周期95°C的30年代,54°C 35 s, 30年代和72°C;和72°C的伸长步骤5分钟。PCR产品被绑定到T-vectors随后被蓝白色筛选。选择单克隆克隆后测序,序列的甲基化水平进行了分析。
2.13。免疫印迹分析
总蛋白的提取样本进行与里帕裂解缓冲(Beyotime生物科技、上海、中国),蛋白质浓度检测用BCA化验设备(Beyotime生物技术)根据制造商的指示。然后蛋白质样品(30μg)分离10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到PVDF膜。阻塞与5%脱脂牛奶2 h后在室温下,一夜之间,细胞膜被孵化在4°C主要抗体CytC, MMP2, SOD1, FOXO3, GAPDH (Abcam、剑桥、马),然后与辣根过氧化物酶,(合)共轭二次抗体(Abcam)在室温下2 h。发现了特定的免疫反应性的乐队和可视化Chemiluminesce ECL试剂(珀金埃尔默,沃尔瑟姆,MA)。
2.14。免疫组织化学分析
胎盘组织固定在4%多聚甲醛(σ,密苏里州,美国)和嵌入石蜡。石蜡包埋组织切成5μ米厚片。然后,组织切片常规脱蜡,用PBS洗净,浸泡在0.01 M柠檬酸缓冲液( )。与微波抗原复苏后,切片用PBS和维护有3%过氧化氢为20分钟。接下来,片与anticytokeratin 7 (CK7)和孵化anti-MMP2 (Abcam、剑桥、马、美国)在一夜之间在4°C。随后,孵化了片山羊anti-rabbit免疫球蛋白G二级抗体(Abcam) 37°C为30分钟。染色结果一个倒置荧光显微镜下观察。
2.15。统计分析
SPSS统计软件包(SPSS Inc .)、芝加哥,美国)是用于所有统计分析。数据表示为 三个独立的测试。单向方差分析(方差分析),紧随其后的是土耳其的事后测试,用于在多个组值的比较结果统计上显著的小于0.05。
3所示。结果
3.1。PE的发生与高架mir - 155的表达有关
我们最初调查血清样本来自PE患者的炎症反应。ELISA数据表明,il - 6的水平,引发,TNF -α体育组与对照组相比明显高(图1(一))。更好地理解mir - 155的作用在PE、RT-qPCR被用来分析它的表达水平,这表明,mir - 155的表达相比PE患者的胎盘组织中显著提高正常胎盘组织(图1 (b))。通过使用BSP, mir - 155的启动子DNA甲基化在胎盘组织学习。甲基化水平的代表性结果CpG网站mir - 155基因位点图所示1 (c)。此外,DNA甲基化的水平呈负相关,mir - 155胎盘组织中的表达水平(图1 (d))。这些数据表明,mir - 155表达与特异表达启动子DNA甲基化可能PE的发病机制中发挥重要作用。
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3.2。mir - 155调节细胞生存能力,细胞凋亡,移动性和滋养层细胞的氧化应激
调查mir - 155的功能作用在滋养层细胞,滋养层两个细胞系(HTR-8 / SVneo和JEG-3)转染mir - 155模拟或抑制剂的功能或功能丧失化验,分别。转染结果表明,mir - 155表达显著增加mir - 155模拟转染后,虽然是说减少mir - 155抑制剂转染后HTR-8 / SVneo和JEG-3细胞(图2(一个))。CCK-8试验的结果表明,中mir - 155抑制细胞生存能力,而沉默mir - 155提升细胞活力HTR-8 / SVneo(图2 (b))和JEG-3(图2 (c))细胞。一致,TUNEL染色表明,mir - 155模拟可以显著提高大量的凋亡细胞,而转染mir - 155抑制剂减少凋亡细胞的数量(图2 (d))。根据Transwell化验,过表达mir - 155下降导致可衡量的迁移(图2 (e))和入侵(图2 (f))HTR8 / SVneo和JEG-3细胞,而差的影响,表达了HTR8 mir - 155 / SVneo JEG-3细胞有一个相反的趋势。此外,免疫印迹分析(图2 (g))显示,调节mir - 155的表达水平增加apoptotic-related CytC,虽然压抑的表达水平antioxidant-related SOD1和invasion-related MMP2。这是指出,mir - 155缓蚀剂的影响HTR8 / SVneo JEG-3细胞有一个相反的趋势与过表达mir - 155的影响。此外,RT-qPCR(图2 (h))和ELISA试验(图2(我))进一步验证下MMP2的表达水平mir - 155模拟或抑制剂转染。
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3.3。5-Aza治疗减毒的影响mir - 155击倒在体外滋养层障碍
基于mir - 155的结果由DNA甲基化在胎盘组织中沉默,我们推测,mir - 155 -介导的监管可能会参与DNA甲基转移酶抑制剂,5-Aza-induced mir - 155 upregulation在滋养层细胞。我们转染5-Aza-treated HTR8 / SVneo mir - 155抑制剂和JEG-3细胞。起初,它是发现mir - 155 mir - 155表达的差别inhibitor-induced对这些被5-Aza强烈逆转治疗HTR8 / SVneo和JEG-3细胞(图3(一个))。BSP的结果显示,没有显著差异mir - 155启动子区域的甲基化水平在对照组和抑制剂治疗组之间,但是,甲基化水平显著降低5-Aza治疗后(图3 (b))。随后,一系列的功能实验表明,mir - 155缓蚀剂转染细胞生存能力升高(图3 (c))和抑制细胞凋亡(图3 (d)),而它增强细胞迁移(图3 (e))和入侵(图3 (f))HTR8 / SVneo JEG-3细胞,都显著逆转cotreatment 5-Aza。此外,5-Aza治疗废除的规定mir - 155缓蚀剂MMP2蛋白表达水平,CytC, SOD1 HTR8 / SVneo和JEG-3细胞(图3 (g))。
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3.4。mir - 155结合和负调节FOXO3表达式
目标基因的识别是一个重要的一步研究microrna与疾病之间的关系。先前的研究表明,mir - 155调节FOXO3表达式在各种癌症。验证mir - 155和FOXO3是否有类似的绑定在滋养层细胞中,我们第一次证实,mir - 155之间存在互补的结合位点和FOXO3使用TargetScan人类(图7.2版本4(一))。然后,荧光素酶报告实验被用来进一步研究交互。结果表明,荧光素酶的活动293 T细胞转染mir - 155模拟显著低于细胞转染数控(图4 (b))。此外,mir - 155对FOXO3表达式也使用RT-qPCR分析决定的。我们第一次证实,mir - 155表达下调是在HTR8 mir - 155抑制剂转染后/ SVneo和JEG-3细胞(图4 (c))。然后,观察到si-FOXO3转染FOXO3 mRNA水平下降引起的。此外,si-FOXO3转染逆转FOXO3表达的抑制mir - 155 inhibitor-transfected HTR8 / SVneo和JEG-3细胞(图4 (d))。目前的结果表明,mir - 155直接结合,抑制FOXO3在滋养层细胞表达。
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3.5。mir - 155可拆卸的滋养层障碍改善体外通过上调FOXO3
进一步调查的角色mir - 155 / PE FOXO3信号,我们一起与si-FOXO3转染滋养层细胞有或没有mir - 155抑制剂和评估其对细胞功能的影响。CCK-8试验的结果表明,击倒FOXO3减少细胞的可行性HTR8 / SVneo和JEG-3细胞,而mir - 155缓蚀剂获救si-FOXO3的效果(图5(一个))。TUNEL染色进一步证实了细胞凋亡的促进FOXO3击倒,相反的mir - 155抑制剂(图5 (b))。另外,我们观察到低迁移(图5 (c))和入侵(图5 (d))能力HTR8 / SVneo JEG-3细胞转染si-FOXO3相比之下,细胞转染si-NC,而mir - 155抑制剂逆转FOXO3击倒的影响。通过收集细胞滋养层的上层清液不同的团体,我们分析了影响mir - 155 / FOXO3信号在炎性细胞因子的水平。ELISA试验的结果表明,FOXO3击倒单独增加释放il - 6(图6(一)),引发(图6 (b))和肿瘤坏死因子-α(图6 (c)),而mir - 155缓蚀剂救了抑制FOXO3击倒这些炎性细胞因子的影响。此外,RT-qPCR(图6 (d))和ELISA试验(图6 (e))一致表明,mir - 155抑制剂逆转MMP2的表达水平下降引起FOXO3击倒HTR8 / SVneo和JEG-3细胞。此外,免疫印迹分析进一步支持的监管角色FOXO3击倒FOXO3蛋白质表达水平,MMP2, CytC, SOD1尤其是逆转mir - 155抑制剂(图6 (f))。
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3.6。mir - 155抑制剂的疗效PE大鼠模型
ELISA试验(图7(一))显示il - 6的浓度更高,引发,TNF -α胎盘,MMP2的PE老鼠比虚假的大鼠的胎盘。mir - 155的注入抑制剂明显阻止il - 6的浓度的增加,引发,TNF -α,MMP2 PE大鼠的胎盘。符合在体外数据,mir - 155抑制剂引起的减少mir - 155表达在PE老鼠(图7 (b)),它可以解释为更高的PE老鼠的DNA甲基化水平,相比之下,mir - 155抑制剂组(图7 (c))。免疫印迹分析表明,mir - 155的注入抑制剂减少FOXO3和MMP2蛋白水平的降低PE老鼠(图7 (d))。免疫组织化学分析结果也表明了,有大量的布朗粒子mir - 155抑制剂组,代表积极CK7和MMP2(图的表达7 (e))。
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4所示。讨论
PE的确切发病机理尚未完全清楚,和强烈的研究工作的重点是体育阐明诸多病理生理学机制中,microrna的监管网络不同的病理过程中发挥重要作用[27]。在这里,这是表明,mir - 155显著调节胎盘组织从PE患者与对照组相比。的upregulation mir - 155,血清il - 6的水平,引发,TNF -α在PE组明显高于与对照组相比,这可以解释,体育是一种系统性炎症性疾病(28]。一致,mir - 155表达表现出显著增加反血管增生,炎症和凋亡功能在母亲的血浆严重时PE相比time-matched控制(29日]。NF -κB-induced mir - 155诱导血管平滑肌细胞功能障碍,导致体育高血压(30.]。接下来,我们使用功能和功能丧失分析进一步验证mir - 155在滋养层的作用。mir - 155的数据显示,超表达显著抑制细胞生存能力、迁移和入侵,同时促进细胞凋亡、炎症和氧化应激。可拆卸的mir - 155得到相反的结果。符合我们的数据,抑制mir - 155增加了刺猬的生产配体声波刺猬(嘘)和改进的主要滋养层PE患者的表型(31日]。mir - 155抑制细胞入侵和滋养层细胞表达以挪士(17]。此外,mir - 155抑制增殖和入侵HTR-8 / SVneo通过下调细胞周期蛋白D1 (18]。在这项研究中,我们进一步证实,mir - 155调节CytC表达式,虽然表达下调MMP2和SOD1的表达水平。这些数据支持,mir - 155在滋养层细胞促进细胞凋亡和氧化应激。
表观遗传机制,如DNA甲基化和组蛋白修饰扮演主要角色的microrna的表达(32]。畸变的DNA甲基化和microrna的表达都是非常具体的根据细胞分化和组织类型。使用BSP,我们的研究结果显示,mir - 155的表达与DNA甲基化水平呈负相关,表明mir - 155表达下降归因于较高的启动子DNA甲基化水平地区体育组织。与突变,DNA甲基化能够逆转,这是类似于其他生理生化的修改(33]。接下来,我们使用了一个批准的脱甲基代理5-Aza治疗滋养层细胞,mir - 155抑制剂转染紧随其后。正如所料,5-Aza治疗减毒的影响mir - 155击倒MMP2的滋养层细胞功能和蛋白质含量,CytC, SOD1在体外。基于这些事实,我们因此推测,甲基化介导的沉默mir - 155可能是导致细胞凋亡的一个重要机制,炎症和氧化应激在PE。
此外,我们的研究结果还表明,mir - 155目标3 - - - - - -UTR FOXO3 mRNA,会使其在滋养层细胞表达。事实上,FOXO家族被报道参与体育的发病机制。例如,FOXO1异常表达可能在一定程度上有助于异常滋养层分化在温和的体育34]。低氧诱导因子- 1的表达升高α(HIF-1αFOXO3a()增加滋养层细胞凋亡的调节35]。此外,mir - 155的相关性和FOXO3以前在肿瘤报告如下:mir - 155的表达在肿瘤和调节作为癌基因在癌症(36,37),而表达FOXO3表达下调,可以抑制肿瘤的发展38,39]。最近的一项研究Cai et al。40]不仅表明FOXO3超表达促进滋养层细胞增殖,迁移,入侵,抑制细胞凋亡,但也证明了mir - 155 / FOXO3轴是参与镇压的黄芩苷对体育的发展的影响。这些证据的基础上,我们进一步证实了mir - 155抑制剂的治疗效果在滋养层功能障碍,包括细胞凋亡、炎症和氧化应激在体外和体育大鼠模型在活的有机体内通过上调FOXO3。
5。结论
我们的研究显示,mir - 155的DNA methylation-mediated衰减导致FOXO3过度,最终减轻细胞凋亡增加,炎症,氧化应激,以及提高细胞生存能力,在PE迁移和入侵在体外和在活的有机体内。这些发现可能为PE治疗提供有前途的新目标。
数据可用性
所有生成的数据或分析在这项研究发表的文章中是可用的。
的利益冲突
作者声明没有潜在的利益冲突。
确认
本研究支持的关键专业研究和河南省发展计划(没有:212102310473)。谢谢爱德华博士将c等,山东大学,语言的建议。