文摘

炎症性肠病(IBD),如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)是一个棘手的肠道炎症与肠粘膜的破坏有关。我们之前证明短乳派生的长链多磷酸盐(保利P) upregulation改善肠道屏障功能的细胞粘附和缓解肠道炎症,从而发挥结肠炎的治疗效果在体外,在活的有机体内,在加州大学的研究者发起的临床研究。然而,保利P如何改善粘膜缺陷引起的肠道炎症尚未阐明。在这项研究中,我们发现血小板的聚集引起的发炎组织聚在葡聚糖硫酸酯钠- P (DSS)诱导结肠炎小鼠模型。光传输aggregometry分析和扫描电镜显示,保利P促进血小板聚集。SRB的化验和ki - 67染色表明,上层清液聚P-treated富含血小板血浆(PRP)增加肠道上皮细胞生长。伤口愈合实验表明,聚P-treated PRP的上层清液,但不是保利P本身,加速伤口愈合。免疫印迹分析表明,增殖蛋白激酶激活诱导的保利P-treated人类PRP的浮在表面的上皮细胞,其伤口愈合效果显著下降了抑制ERK信号。这些数据表明,血小板源聚P改善肠道炎症引起的介质通过促进上皮细胞生长ERK信号通路的激活。机制是一种新型宿主相互作用通过哺乳动物细菌引起的血小板源介质分子。

1。介绍

各种细菌生活在宿主胃肠道和建立一个与哺乳动物宿主共生关系。已经表明,肠道微生物区系的破坏导致伤害宿主,如异常激活免疫系统,因此各种疾病的发展,包括胃肠道炎症、肿瘤、肝脏功能障碍,过敏性皮炎,大脑和神经系统疾病(1- - - - - -3]。

先前的研究已经表明,肠道条件的改善管理的有益的细菌,如乳酸杆菌和双歧杆菌属帮助解决这些疾病在体外和在活的有机体内动物实验模型(4- - - - - -6]。其他的研究中,包括我们自己的,已经表明,一些益生菌释放生物活性介质,导致肠道内稳态的维护和改善炎症。燕等人确定了p40和我的文化上层清液乳酸菌GG和显示他们的抗炎作用介导上皮EGFR-Akt信号通路(7]。同样地,我们发现能力和集落刺激因子(CSF)枯草芽孢杆菌和显示脑脊液被纳入通过OCTN2上皮细胞,从而激活细胞生存信号,包括一种蛋白激酶和p38增殖蛋白激酶(MAPK)通路,导致上皮屏障功能的增加(8]。凯利等人发现microbiota-derived短链脂肪酸稳定低氧诱导因子(HIF),加强肠道上皮屏障功能(9]。

我们还发现了长链多磷酸盐(保利P)作为一个有益的文化上层清液的物质l .短SBC8803支持哺乳动物的肠道屏障功能主机通过整合素β1-p38 MAPK信号通路(10]。此外,保利P调节肠道屏障功能和表达下调的巨噬细胞激活小鼠结肠炎模型,显著改善患者的症状和内窥镜发现难治性溃疡性结肠炎(UC)的研究者发起的临床试验(11,12]。综上所述,这些先前的发现支持宿主交互的概念由probiotic-derived分子通过上皮细胞和免疫细胞的调制。

多余的肠道炎症,如炎症性肠病,已经导致粘膜缺陷,包括上皮侵蚀和溃疡,导致细菌易位和/或有害的成分,从而加剧了肠道炎症(1,13,14]。因为一个研究者发起的临床试验表明,聚P常导致内镜粘膜愈合在耐火UC患者表现出多种侵蚀和溃疡,我们推测,保利P是有效治疗粘膜缺陷以及改善肠屏障功能(12]。然而,伤口愈合的机制促进聚P尚未阐明。在目前的研究中,我们发现,第一次血小板的聚集,这是众所周知的,促进伤口关闭(15),在粘膜表面DSS-induced结肠炎模型与保利P .因此,我们专注于治疗后的伤口愈合效果保利P之间通过crossinteraction保利和主机血小板源小分子介质在体外伤口愈合模型和鼠标肠炎模型。

2。材料和方法

2.1。聚磷

200毫米磷酸丙酮酸的混合物(2 M Tris-HCl, pH值9.4),30毫米磷酸盐缓冲剂(pH值6.0),30毫米三磷酸腺苷(1 M Tris-HCl, pH值8.0),MgCl 30毫米₂,600毫米醋酸缓冲(pH值6.0),0.25毫升多边形P激酶和100 U /毫升丙酮酸激酶是16 h在37°C的环境。净化保利P,混合物是孵化同样体积的2 M醋酸缓冲在4°C 2 h,然后,这是在3000转离心5分钟。沉淀溶解在蒸馏水和孵化同样体积的2 M醋酸缓冲在4°C 2 h。另一轮的离心后沉淀溶解在蒸馏水和低分了重量组件,包括三磷酸腺苷和短链聚P,从解决方案中删除了透析使用管配备3 kDa分子量截止(MWCO)膜(热费希尔科学有限公司,沃尔瑟姆,妈,美国)。保利P是溶解在蒸馏水20毫克/毫升,调整pH值10。CaCl₂添加到聚在分子比率(P方案 )使用蠕动泵。不溶性聚P收集使用Amicon超3 k过滤设备(默克公司,达姆施塔特,德国)在3000 rpm,和乙醇添加和离心机在3000 rpm。保利P是使用真空干燥干泵。

2.2。短链多聚磷酸盐

六偏磷酸钠是购自和光纯化学公司,富士胶片kouichi日本大阪。六偏磷酸钠是溶解在蒸馏水20毫克/毫升,调整pH值10。CaCl₂添加到聚在分子比率(P方案 )使用蠕动泵。不溶性短链多磷酸盐收集使用Amicon超3 k过滤设备(默克公司)在3000 rpm,和乙醇添加和离心机在3000 rpm。短链多磷酸盐是使用真空干燥干泵。

2.3。动物

批准的研究机构旭川市医科大学动物保健和使用委员会(许可证编号为19027 - 2)。BALB / c小鼠和只Wistar鼠属从查尔斯河实验室购买日本公司(日本横滨)。

2.4。结肠炎的感应和评估

BALB / c小鼠接种2.5% (wt /卷)葡聚糖硫酸酯钠(DSS)(分子量,36-50 kDa)饮用水的5天,然后转向蒸馏水后管理。在测试组( ),5μ克l .短派生的保利P溶解在100μL(磷酸盐(PBS)口周围的管理在整个实验周期一天一次。在对照组( ),100年μL PBS的口周围的管理在整个实验周期一天一次。老鼠在第7天牺牲了,整个结肠切除盲肠的肛门。结肠长度测量标志的炎症。几件结肠粘膜收集评估mRNA表达使用实时逆转录聚合酶链反应(rt - pcr),另一块在10%缓冲福尔马林固定,切片在4μm,用于苏木精和伊红染色后光学显微镜分析。

2.5。组织病理学炎症评分

根据伯格组织学变化进行评估的分数16]。肠道炎症的分数是评估在三个代表的部分结肠在每个老鼠因为肠道病变是灶和肠道病变的严重程度不同。分数决定如下:年级0,从正常组织没有变化;1级,一个或几个多病灶的单核细胞浸润固有层伴随着最小上皮增生和轻微不枯竭的粘液从杯状细胞;二年级,病变往往涉及比1级的小肠病变或更频繁,典型的变化包括轻度炎症细胞浸润在固有层主要由单核细胞和中性粒细胞,偶尔小上皮侵蚀,和炎症很少涉及到黏膜下层;三年级,病变涉及的大面积比2级病变粘膜或更频繁,炎症是温和的,常常涉及到黏膜下层,但很少透壁的炎症细胞是单核细胞和中性粒细胞的混合物,隐窝脓肿和溃疡偶尔观察到;和4级,这种病变通常涉及大部分肠段和比三年级更严重的病变,严重的炎症,包括单核细胞和中性粒细胞,也就是说,有时候透壁的,隐窝脓肿和溃疡。

2.6。实时rt - pcr

结直肠组织的总RNA提取小鼠使用试剂盒(表达载体)和净化RNeasy迷你包(试剂盒、东京、日本)根据制造商的指示。的质量和数量总RNA被分光光度法验证。单链互补DNA合成(互补)使用高容量cDNA逆转录工具包(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。基因表达是使用特定的测量与实时PCR引物的TNF -α干扰素-γ、il - 6和il - 1β(热费希尔科学)。平均mRNA表达规范化18 s rRNA表达式。

2.7。免疫组织化学

Formalin-fixed,石蜡包埋组织样本准备按照一个标准协议。CD61被染色的细胞表面标记血小板。免疫组织化学分析,石蜡切片前按顺序处理应用程序的主要抗体在以下方式:deparaffinization,补液,淬火内源性过氧化物酶、抗原检索。部分被孵化与主要抗体anti-CD61(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),其次是与辣根peroxidase-conjugated二级抗体检测老鼠或兔子(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)。CD61-positive区域在结肠内被量化。7代表结肠的图像从每个鼠标×40下被放大。在获得每个CD61-positive区域使用ImageJ软件程序(17),每个区域的比例控制老鼠的平均面积计算。

2.8。富含血小板血浆(PRP)准备

postcaval静脉的血液样本收集大鼠周围静脉或健康志愿者。研究伦理委员会批准的旭川市医科大学(号码,19015 - 2),以及每个志愿者的知情同意。血液样本被吸引到样品管含有缓冲3.2%柠檬酸钠和离心10分钟,800克和PRP上层清液的收集。

2.9。制备聚P-Treated PRP的上层清液

保利P是稀释在汉克斯平衡盐溶液(HBBS) 10毫克/毫升,加入PRP(最后保利P浓度:1毫克/毫升),后在室温下旋转20分钟。血小板聚集是颗粒状的离心10分钟在2400克,微型离心机和保利P-treated等离子体得到使用的酶联免疫吸附试验(ELISA)。消除凝血因子,等离子体是由一个100 kDa分子截止(MWCO)列(美国通用电气医疗集团,芝加哥,IL)。

2.10。光透射Aggregometry

哈佛商学院的聚合反应,聚P(0.5毫克/毫升),ADP (40μ米)(和光纯化学富士胶片kouichi)测定( )使用一个EnSpire (PerkinElmer日本神奈川、日本)。

2.11。扫描电子显微镜

扫描电子显微镜是用来研究血小板聚集形成的形态响应保利P(0.1毫克/毫升)或ADP (40μ米)。孵化了20分钟后,血小板聚集颗粒状的离心10分钟在2400克的微型离心机。等离子体被固定在4%多聚甲醛,紧随其后的是1%四氧化锇PBS进一步固定。标本检查使用日立s - 4100(日立高科技公司,日本东京)中心的高级研究和教育,旭川市医科大学,日本旭川市。

2.12。细胞培养

IEC-18细胞生长在high-glucose杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)和光纯化学(富士胶片kouichi)补充(卷/卷)为10%胎牛血清的边后卫,2毫米谷酰胺,50 U /毫升青霉素,链霉素50毫克/毫升(热费希尔)。HCEC-1CT细胞生长在ColoUp介质(Evercyte,维也纳,奥地利)。细胞系都孵化在湿润的气氛中5%的有限公司₂。

2.13。一个伤口愈合试验

细胞被播种在12-well微型板块在10⁵每口井的细胞培养24小时。划痕是无菌200创建的μL吸管,然后,哈佛商学院的上层清液或多边形P或者ADP-treated PRP稀释双重的培养基是添加到细胞中。伤口区域记录使用的数码相机系统。划痕的距离测量使用ImageJ软件程序。

2.14。免疫荧光共聚焦显微镜

镀HCEC-1CT细胞室的幻灯片和允许在哈佛商学院的上层清液或保利文化P-treated PRP 6 h。幻灯片在4%多聚甲醛,然后固定15分钟洗广泛与PBS permeabilized Triton x - 100为30分钟,0.2%和屏蔽超块阻塞缓冲区(PBS)(热费希尔)1 h在室温下。幻灯片顺序被孵化主要抗体ki - 67(细胞信号技术)24小时在4°C,用PBS洗净,然后孵化与anti-rabbit抗体共轭Alexa萤石488(热费希尔)1 h。细胞核与Hoechest33342复染色(热费希尔)为3分钟。不变色的细胞被安装安装介质,使用共焦显微镜和免疫荧光可视化。ki - 67阳性检出率(%)的比例计算基于ki - 67阳性区域Hoechst-positive区域,测量使用ImageJ软件程序。

2.15。SRB化验

HCEC-1CT被播种在96孔酶标细胞 细胞/好,培养24小时。这些细胞被固定在5%三氯乙酸(TCA)在4°C和1 h在蒸馏水洗4次。微型板块被脱水在室温下,彩色100毫升每口井的0.057% (wt /卷)SRB粉/蒸馏水、0.1%醋酸洗4次,在室温下redehydrated。染色细胞在10毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液,细胞溶解和光学密度(OD)以510海里(18]。

2.16。西方墨点法

IEC-18细胞被播种12-well微型板块 每口井的细胞培养24小时。细胞治疗与哈佛商学院的上层清液或聚P-treated PRP稀释双重介质。孵化后30分钟,细胞在NP-40细胞溶解细胞溶菌作用缓冲(热费希尔)包含磷酸酶抑制剂(热费希尔)和一个完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏分子生化药剂,印第安纳波利斯,美国)。蛋白质(20μg)在每个样本解决使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)(12%)和立即转移到硝酸纤维素使用传输缓冲区(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。硝化纤维膜在超级块阻塞孵化缓冲区(TBS)(热费希尔)1 h在室温下阻止任何非特异性结合。一夜之间,这些墨迹被孵化在4°C anti-phospho-AKT抗体(细胞信号),anti-phospho-ERK抗体(细胞信号),antiphospho-p38抗体(细胞信号),anti-phospho-JNK抗体(细胞信号),anti-phospho-Raf抗体(细胞信号),和anti-phospho-MEK抗体(细胞信号)作为主要的抗体。

第二天,很快被洇在蒸馏水冲洗5次,然后用T-TBS洗一次5分钟在室温下,孵化为60分钟species-appropriate辣根peroxidase-conjugated二级抗体(研发系统,明尼阿波利斯,美国)在T-TBS,迅速在蒸馏水冲洗5次,然后用T-TBS[5分钟洗一次19]。这些墨迹开发使用SuperSignal西方Pico增强化学发光系统(热费希尔)根据制造商的协议。肌动蛋白表达的平均蛋白表达规范化(美国肯塔基州列克星敦BD转导实验室)。

2.17。一个ELISA

使用鼠标的等离子测定肺动脉栓塞水平纤维蛋白降解产物肺动脉栓塞(EIA)竞争酶联免疫试剂盒(寿命生物科学公司,西雅图,佤邦,美国)根据制造商的指示。

生长因子在等离子体的内容决定使用PDGF-BB,表皮生长因子,VEGF和TGF -βQuantikine ELISA试剂盒(研究和诊断系统公司、明尼阿波利斯、锰、美国)根据制造商的指示。

2.18。抑制剂

ERK1/2抑制剂FR180204 (Sigma-Aldrich有限公司LLC,圣路易斯,密苏里州,美国)是在一个终端使用浓度为1μm . p38抑制剂SB203580 (Sigma-Aldrich有限公司LLC)是在一个终端使用浓度为1μm . PI3K抑制剂LY294002 (Sigma-Aldrich有限公司LLC)是在一个终端使用的浓度20μm .物抑制剂SP600125 (Sigma-Aldrich有限公司LLC)是在一个终端使用的浓度20μM。

2.19。统计分析

使用学生的未配对试验数据进行了分析 - - - - - -测试两群比较,单向方差分析(方差分析)以及Fisher保护至少事后测试三组比较,和一个方差分析其次是Tukey-Kramer方法事后考验四组比较。生长因子ELISA数据使用配对进行了分析 - - - - - -测试。SRB试验的结果分析了使用双因素重复测量方差分析。伤口愈合化验使用MAPK抑制剂使用双因素析因方差分析进行了分析。 被认为是表明一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。保利P改善小鼠的肠道损伤处理DSS和增强血小板的积累在肠道上皮细胞

BALB / c小鼠被允许免费饮用水含2.5% DSS 5天。PBS或5μg的多边形P是口服接种小鼠每天一次从0到7天,之后小鼠安乐死(图1(一))。接受pbs小鼠的结肠长度显著缩短2.5% DSS治疗控制老鼠相比,长度在5μg保利P-treated老鼠明显(图中恢复过来1 (b))。Hematoxylin-eosin(圆))染色的结肠部分显示,组织病理学炎症的恶化引起的分数DSS治疗治疗后显著提高多边形P(图1 (c))。rt - pcr的增加表明,促炎细胞因子il - 1β、TNF和il - 6的显著降低 P组比 (数据1 (d)- - - - - -1 (g))。有趣的是,血小板的积累检测表面的表皮脱落的粘膜上皮细胞CD61)染色和免疫组织化学染色,这是一个已知的血小板表面抗原。的CD61-positive区域 P组明显比的 组(图1 (h)),这表明聚P诱导血小板的聚集受损上皮表面由于肠道炎症。

评估系统性血栓性趋势,DSS-induced模型小鼠的血浆肺动脉栓塞水平测量。虽然DSS治疗增加了肺动脉栓塞的水平,没有显著差异 组和DSS保利P组(图1(我))。

3.2。聚磷诱导血小板聚集

评估是否聚P直接诱导血小板的聚集,保利P是添加到PRP从收集血液样本,获得和血小板聚集实验进行。吸收在405 nm暂停血小板明显减少了保利P(比的治疗在1000秒: )以及ADP(的比例在1000秒: ),促进血小板的聚集,这表明聚P直接诱导血小板聚集。

之前报道,短链多磷酸盐的链长是60岁以下,从内部存在血小板和血小板聚集有关20.- - - - - -22]。短链多磷酸盐也诱导血小板的聚集(的比例在1000秒: ),但是,短链的聚合度多磷酸盐治疗组低于保利P治疗组(图2(一个))。

确认血小板的聚集,一个电子显微镜分析。治疗后血小板聚合聚P ADP和不溶性微粒,这似乎对应多边形P纳米颗粒,在血小板表面(图2 (b))。这些数据表明,聚P直接与和天真的血小板激活,导致血小板的聚集。

3.3。保利P改善肠道上皮细胞细胞的伤口愈合调解血小板激活

评估是否聚P对伤口愈合的影响通过激活血小板,保利P-treated人类PRP的上层清液收集和细胞划痕试验。人类的上层清液聚P-treated PRP相比大大提高了挠伤口的上层清液HBSS-treated人类PRP在人类正常上皮HCEC-1CT细胞(图3(a))。同样,伤口愈合效果确认当老鼠正常上皮细胞(IEC-18细胞)治疗的上层清液聚P-treated老鼠PRP(图3(b))。相比之下,保利P没有直接改善HCEC-1CT上皮伤口的细胞(补充图1一)也没有40的上层清液μM ADP-treated PRP(补充图有任何这样的影响1B)。

评估是否聚P-treated血小板源分子促进细胞生长,SRB进行测定。HCEC-1CT细胞的细胞生长的上层清液治疗后显著增加聚P-treated人类PRP治疗相比的上层清液HBSS-treated人类PRP(图4(一))。免疫细胞化学表明,ki - 67阳性细胞明显增多与保利P-treated PRP治疗后(图4 (b))。这些数据表明,聚磷诱导刺激分子的分泌血小板,从而促进肠道伤口愈合。

3.4。聚磷诱导小介质的释放血小板和加速细胞生长调节ERK信号

之前的调查表明,MAPK-associated分子在许多细胞系与伤口愈合密切相关,包括上皮细胞、角化细胞和肿瘤细胞23- - - - - -28]。澄清上皮细胞的促生长机制,MAPK信号的状态评估。

西方墨点法表明MAPK signaling-related分子(ERK, p38、物和一种蛋白激酶),尤其是那些关于ERK信号通路,治疗显著激活的保利P-treated鼠PRP的上层清液IEC-18细胞(图5(一个))。上皮愈合的上层清液聚P-treated鼠PRP减毒的治疗ERK抑制剂(FR180204),但不是p38(某人203580)的抑制剂,PI3K / Akt (LY294002),或物(SP600125)(数据5 (b)- - - - - -5 (e)),这表明ERK信号负责促进伤口愈合。同样,西方墨点法还显示,保利的上层清液P-treated鼠PRP激活ERK的上游信号,raf mek信号(图5 (f)),这表明聚P-induced分子从上皮Raf-MEK-ERK血小板激活的信号通路,从而促进伤口愈合。

血小板激活是众所周知的释放与生长有关的分子支持伤口愈合15,29日]。识别的分子释放血小板聚P治疗,保利的上层清液中生长因子P-treated人类PRP评估。ELISA表明PDGF的表达,表皮生长因子,VEGF, TGF -β已知的组件包含血小板颗粒(30.- - - - - -33),没有明显增加的上层清液中聚P-treated人类PRP(补充图2)。阐明血小板源分子的分子大小的上层清液聚P-treated PRP被MWCO膜分离。伤口愈合效果检测是基于3 kDa的flowthrough MWCO膜(图6),这表明低分了重介质支持肠道伤口愈合。

4所示。讨论

目前的研究表明,probiotic-derived保利P改善粘膜损伤通过诱导血小板的聚集在炎症粘膜DSS结肠炎小鼠模型。保利P与天真的血小板,宣传他们的聚合没有系统性血栓性倾向,并诱导低分了重量分子从血小板的释放,导致结肠上皮伤口愈合。这份报告首次证明细菌组件可以激活血小板和诱导血小板源生物活性分子的释放,从而对其宿主施加有益的影响。

值得注意的是,DSS结肠炎模型分析和血小板聚集试验清楚地表明,bacteria-derived保利P目标不仅宿主上皮细胞和免疫细胞,而且主机血小板。我们之前的研究表明,聚P增强肠道屏障功能通过与整合素结合β1宿主上皮细胞(10]。整合素β1被认为是位于表面的血小板和发挥关键作用的激活和颗粒分泌血小板(34]。我们的扫描电子显微镜(SEM)分析表明,颗粒,这被认为是保利P粒子,血小板,这表明血小板整合素β1信号介导的保利P效应诱导血小板源分子的释放,这对伤口愈合的影响受损组织,包括上皮粘膜。整合素的β1催化剂,包括保利P,可用于治疗粘膜缺陷由于炎性疾病通过诱导血小板受伤的组织。

CD61 DSS-poly P组小鼠的免疫组织化学染色显示,血小板积聚在受伤的肠上皮细胞的表面。之前的调查显示,在IBD患者积极的炎症,血小板与中性粒细胞从血管到肠道内腔通过间质组织(35,36),这表明口头管理多边形P激活宿主血小板表面的受伤的肠上皮和上皮伤口愈合的过程加速。

伤口愈合试验显示,保利P-treated PRP的上层清液,但不是保利P本身,促进伤口愈合,这表明血小板活化是必不可少的多边形P诱导效应。此外,ADP-treated PRP没有产生同样的效果。SEM分析表明,血小板聚集的形态变化引起聚ADP引起的P是截然不同,这表明聚P和ADP引起的血小板活化机制并不相同。因此我们寻找诱导的血小板源生物活性分子聚p .血小板已知包含无数的生物活性介质α颗粒和致密颗粒,加速肠胃伤口愈合。最知名的分子生长因子,包括血小板源生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子-β(TGF -β)。然而,目前的研究表明,PDGF的释放,表皮生长因子,VEGF, TGF -β没有明显不同与保利P-treated PRP治疗后。加速伤口愈合也证实在使用3 kDa MWCO-treated上层清液的聚P-treated PRP,表明聚P诱导释放小型介质不被认为是生长因子,因为其分子大小(超过3 kDa)。还需要进一步的分析来识别血小板源分子介导的伤口愈合效果保利P。

MAPK和Akt信号,包括p38、物的兵,和一种蛋白激酶,是众所周知的参与伤口愈合。免疫印迹显示的伤口愈合效果的上层清液聚P-treated PRP减毒的抑制ERK信号通路,但不是p38物,或Akt通路,而p38的激活物和一种蛋白激酶ERK检测。保利P-treated鼠PRP的上层清液也激活皇家空军和MEK上游分子ERK,说明伤口愈合效果的上层清液诱导聚P-treated PRP Raf-MEK-ERK介导的信号通路。我们先前的研究显示,保利P直接激活p38 MAPK在上皮细胞。这些发现表明,聚P促进伤口愈合通过ERK信号通路的激活血小板激活和增强肠道粘膜屏障功能,通过直接p38 MAPK信号通路的激活。

血小板被认为是炎症细胞因为促炎的分子,包括platelet-activating因素和巨噬细胞炎性蛋白1α发布了血小板的激活,导致炎症的恶化37- - - - - -39]。相反,我们的结果表明,分子来自保利P-activated血小板促进上皮伤口关闭没有增强肠道炎症。我们以前的研究表明,聚P直接抑制细胞因子释放的肠上皮细胞和巨噬细胞(11),这表明肠道炎症增强血小板源促炎直接抗炎效应分子被取消的保利P .否则,保利P可能诱发特定分子具有伤口愈合效果没有函数与炎症状态。进一步分析确定伤口healing-associated分子特别是来自保利P-activated血小板需要说明详细的伤口愈合的机制。

系统性血栓栓塞的风险在炎症性肠病(IBD)是高(40- - - - - -44]。应用聚P作为IBD的医药代理,我们必须确定系统血栓性趋势,光透射aggregometry在目前的研究表明,聚P高血小板聚集活动。在这方面,一个ELISA显示没有明显的差异之间的等离子体肺动脉栓塞水平DSS模型小鼠DSS-PBS组和DSS-poly P组。同样,正如我们以前的报告所示,UC患者的血栓形成中没有观察到first-in-human研究聚p .此外,评估药物动力学的多磷酸盐在老鼠身上透露,每日口服10毫克的多磷酸盐没有增加血清磷水平,和啮齿动物nonrodent毒性研究发现没有证据表明血栓栓塞(12]。此外,免疫组织化学分析表明,CD 61积极性是局部表面的肠道。这些发现表明,口服胃肠道保利P没有交通管理由于其高分子量和激活血小板位于胃肠道粘膜发炎。

5。结论

我们证明probiotic-derived多边形P加速伤口愈合上皮提高ERK磷酸化后主机血小板激活,表明聚P是一个可行的候选药物诱导粘膜炎症性肠病的治疗。哺乳动物血小板的激活bacteria-derived主机微生物相互作用的分子是一种新型的机制,这是一个潜在的目标治疗胃肠疾病。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

Shotaro矶和总裁中西宏明Konishi应该考虑共同第一作者。

的利益冲突

Fujiya博士获得多磷酸盐用于钠钙多磷酸盐的生产从决心消散制药公司在这项研究。

作者的贡献

S.I.,M。F., and H.K. provided major input regarding the conceptual development of the studies, wrote the manuscript, and supervised all of the investigations. S.I. and H.K. performed the biochemical experiments. H.T. performed the histopathological assessment. Y.M., S.K., K.A, N.U., K.M., and T.O. helped design the studies, interpret the data, and prepare/review the manuscript. All of the authors read and approved the final manuscript. Shotaro Isozaki and Hiroaki Konishi contributed equally to this work.

确认

本研究部分支持的补助金Ishidsu避开纪念奖学金(s .矶),为科学Research-no补助金。26460956 (m . Fujiya)和没有。19 k16484 (h . Konishi)和转化研究网络计划的日本医学研究和发展机构。C40 (m . Fujiya)和非金融支持从开发和难治的疾病健康和劳动力科学研究经费来自卫生部、劳动和福利。在研究的开展,赠款和益力多的个人费用提供Honsha有限公司和非金融支持来自札幌啤酒公司以及赠款和非金融决心消散制药公司的支持。外的公司,提交工作,得到。我们感谢Chikage Yamamura, Nobue Tamamura,厉害北城的技术支持。

补充材料

补充1。补充图1。保利P直接添加和上层清液ADP-treated PRP没有促进上皮细胞生长。细胞划痕实验表明,直接的最终浓度为1,10,100μg / mL保利P没有改善上皮伤口HCEC-1CT细胞(A),上层的40μM ADP-treated PRP也没有改善这种伤口(B)。

补充2。补充图2。血小板源生长因子的组件并没有改变在保利P-treated PRP的上层清液。PDGF的ELISA, EGF、VEGF和TGF -β表明没有检测到显著变化的上层清液中聚P-treated PRP。