的miR-6869-5p抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭经由定位PGK1

抽象

积累的研究表明失调的微RNA（miRNA）在发挥脑肿瘤的重要角色，包括神经胶质瘤。的miR-6869-5p已被证明可以在多种癌症中被异常表达。然而，的miR-6869-5p胶质瘤遗骸的确切作用知之甚少。这项研究的目的是对神经胶质瘤评估其修改效果。显著降低的miR-6869-5p的表达在神经胶质瘤组织和细胞中发现。负相关在神经胶质瘤细胞的miR-6869-5p和PGK1之间记录，并且PGK1被证明是通过荧光素酶报道分子测定该miRNA的靶基因。通过靶向PGK1的miR-6869-5p调节神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭。此外，生存分析已表明，低miR-6869-5p表达预测胶质瘤患者的预后较差。这项研究表明的miR-6869-5p是一个有用的肿瘤抑制因子和预后标记在神经胶质瘤。

1.简介

神经胶质瘤是中枢神经系统高度侵略性和致命的恶性肿瘤。它的病因仍然知之甚少。它已经证明，遗传，环境致癌物质和感染性因素导致神经胶质瘤的发病[1,2]。增加暴露于电离辐射升高神经胶质瘤的风险，而过敏和过敏性疾病史降低神经胶质瘤风险[3.]。胶质瘤侵袭率高，预后差。因此，识别潜在的生物标记物对于探索新的神经胶质瘤治疗手段至关重要。

在过去的几十年里，越来越多的证据支持了microRNAs (miRNAs)在恶性疾病(包括胶质瘤)中的关键作用[4- - - - - -6]。mirna是靶向基因的转录后调节因子。许多有功能的microrna由于其在肿瘤发生、血管生成、增殖、凋亡和癌细胞侵袭等方面的关键作用，已被确定为胶质瘤的疾病标记物[7,8]。许多成熟的miRNA的被证明影响的临床结果，化疗抗性，和胶质瘤患者的放射治疗抗性[9]。特别是，一些miRNAs可以通过调节肿瘤干细胞来影响肿瘤的维持和进展[10,11]。此外，一些细胞外囊泡的递送的miRNA有助于在神经胶质瘤细胞 - 细胞通信，这将作为有效的治疗靶点神经胶质瘤[12]。因此，miRNA是关键调节和神经胶质瘤有希望的目标。的miR-6869-5p已经首先鉴定Yan等人是在结肠直肠癌的肿瘤抑制基因。[13,14]。在本研究中，我们发现miR-6869-5p在胶质瘤组织中表达差异。然而，miR-6869-5p在胶质瘤中的作用仍不清楚。本研究的目的是证明miR-6869-5p在胶质瘤细胞生长和侵袭中的作用。确定其靶向基因及其在肿瘤发生中的调控机制，将有助于为胶质瘤的诊断和治疗提供新的靶点。

2。材料和方法

2.1。胶质瘤病例及肿瘤组织收集

43例患者得到胶质瘤在潍坊医学院，山东日照整合医院附属医院接受2015年6月和2017年4月间手术切除脑胶质瘤组织。表1所有胶质瘤患者的礼物特性。由于第一手术切除，随访时间达28个月。脑样品（ )和相邻组织（ )保存于液氮中，用于RNA的提取。总生存率定义为手术切除和死亡之间的时间间隔或随访28个月。我们的研究是在医院伦理委员会的政府下进行的。所有参与者都签署了书面知情同意书。

2.2。细胞培养和细胞转染

使用10%胎牛血清(Gibco, USA)维持U87和U251胶质瘤细胞。从293T细胞培养上清中获得慢病毒质粒(PcDNA3.1)转染胶质瘤细胞。8μ克/ ml聚凝胺试剂涂敷了用于细胞转染。温育48小时后，神经胶质瘤细胞被温育48小时后收获，并在下面的试验中使用。miRNA的抑制剂，模拟物，和相应的对照（GeneChem，上海，中国）被用来治疗神经胶质瘤细胞。

2.3。实时聚合酶链反应（PCR）

使用TRIzol试剂(Invitrogen, USA)从组织和细胞中分离总rna。利用2进行cDNA合成μg总RNA利用宝RT试剂盒（中国天津）。PCR使用宝的SYBR Green预混试剂盒（中国天津）进行。甲的TaqMan miRNA的实时PCR测定试剂盒（赛默飞世尔科技，USA）被用于检测的miRNA表达。使用的引物如下：磷酸甘油酸激酶1（PGK1）：F：5CTGTGGGGGTATTTGAATGG3 ,R: 5CTTCCAGGAGCTCCAAACTG3 ;GAPDH: F: 5GAGTCAACGGATTTGGTCGT3 ,R: 5TTGATTTTGGAGGGATCTCG3 。

2.4。荧光素酶报告实验

野生型（WT）和突变型（MT）结合PGK1 3的位点将UTR亚克隆到慢病毒质粒载体(pmir-GLO)中。采用荧光素酶报告系统(Promega, WI, USA)证实miR-6869-5p与潜在靶向基因PGK1的关系。293T细胞转染48h。实验按方案进行三次。

2.5。细胞增殖和侵袭

按照协议使用CCK-8 (Dojindo, Japan)评估胶质瘤细胞的增殖情况，数据采用单因素方差分析方法进行分析。用transwell和scratch检测肿瘤浸润情况。 每孔中的细胞上，下transwell小室（Corning公司，MA，USA），分别进行培养。48小时后，将细胞用低聚甲醛固定（4％），然后用结晶紫（0.1％）染色。划痕试验还进行了，在显微镜下，其中细胞被扫描。

2.6。统计分析

胶质瘤患者的总生存期是由数秩的Kaplan-Meier分析加检验评估。进行估计胶质瘤患者的死亡率的相对危险性通过用95％CI计算风险比（HR）Cox回归分析。我们用于数据分析STATA，的GraphPad和SPSS软件程序利用学生的 -检验或单因素方差分析。两尾 是重要的。

3.结果

3.1。在脑胶质瘤的miR-6869-5p表达

的miR-6869-5p表达在神经胶质瘤组织（图下降1(一))。在胶质瘤中，miR-6869-5p表达与肿瘤大小和WHO级别呈负相关(图)1 (b)和1 (c))，而在不同年龄和性别的患者中未观察到显著相关性(图)1 (d)和1 (e))。综上所述，miR-6869-5p在胶质瘤中异常表达，可能影响胶质瘤的发生发展。

3.2。miR-6869-5p影响胶质瘤细胞的增殖和侵袭

Real-time PCR显示，当胶质瘤细胞被miRNA模拟物处理时，miR-6869-5p的表达被促进(图)2(一个)和2 (b))。miR-6869-5p was capable of inhibiting glioma cell proliferation at 48 h and 72 h (Figures图2（c）和图2（d）)。模拟物处理的神经胶质瘤细胞侵袭被抑制，与对照细胞相比，通过划痕试验和Transwell小室法（图证明图2（e）和图2（f）)。提示miR-6869-5p具有抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭的作用。

3.3。PGK1针对性地调控的miR-6869-5p

我们在TargetScanHuman数据库(http://www.targetscan.org/发现miR-6869-5p可能通过识别3在转录后水平调控PGK1PGK1的UTR(图)图3（a）)。负相关在神经胶质瘤细胞（图中图3（b）和图3（c）)。荧光素酶报告基因实验表明，PGK1可以被miR-6869-5p靶向调控(图)3（d）)。此外，miR-6869-5p可通过靶向PGK1抑制胶质瘤细胞增殖(图)图3（e）)。此外，在细胞中过表达PGK1时，U87细胞的侵袭能力明显增强，而miR-6869-5p模拟物可以通过在转录后水平调控PGK1的表达来挽救其作用(图)图3（f）和图3（g）)。总之，的miR-6869-5p可以通过体外靶向PGK1防止神经胶质瘤细胞增殖和侵袭。

3.4。低miR-6869-5p表达与胶质瘤预后不良相关

Kaplan-Meier分析显示，神经胶质瘤患者的miR-6869-5p胶质瘤组织较低水平有显著总生存期（ ）这表明低miR-6869-5p表达与神经胶质瘤预后不良相关（图4)。Cox单因素和多因素回归分析提示低miR-6869-5p表达胶质瘤患者预后不良(表)2)。miR-6869-5p低表达是胶质瘤的危险因素，与WHO级别和肿瘤大小无关(表)2)。因此，降低的miR-6869-5p表达预测胶质瘤预后不良。

4。讨论

在过去十年中，非编码RNA已经牵涉到多种恶性肿瘤，包括神经胶质瘤[15- - - - - -17]。miRNA是参与肿瘤发生和癌症进展公知的非编码RNA。miRNA在神经胶质瘤的新作用已经得到了广泛的关注。到目前为止，还没有以前的研究调查的miR-6869-5p对胶质瘤细胞和胶质瘤患者预后的影响。我们的研究表明了miR-6869-5p可以通过靶向PGK1调节神经胶质瘤细胞增殖和侵袭。的miR-6869-5p的低表达预示胶质瘤患者的预后较差。因此，的miR-6869-5p是神经胶质瘤病例预后因素。

miRNA是一种具有18-25个核苷酸的单链非编码RNA。许多mirna在癌症中存在差异表达，它们通过在转录后水平调控靶基因的表达，参与各种细胞事件，如细胞生长、凋亡、分化、免疫监控和免疫逃逸[18- - - - - -20.]。此外，一些miRNAs可通过胞外囊泡(如外泌体)封装并传递到癌细胞的外周循环或局部免疫微环境中，从而影响肿瘤发生、微环境平衡和肿瘤进展[21,22]。最近，传递脐带间充质干细胞miRNAs的细胞外囊泡被认为是一种潜在的治疗策略，因为它们在下调与胶质瘤存活相关的多个重要通路上发挥了关键作用[10]。此外，一些的miRNA通过竞争内源RNA（CERNA）机制与其他的非编码RNA相互作用调节脑肿瘤的命运[23,24]。特别地，lncRNA-miRNA和circRNA-miRNA的网络已经被证明在神经胶质瘤的癌变[24- - - - - -26]。此外，有报道称许多miRNAs对胶质瘤的预后有修改作用，如miR-193b和miR-622 [27,28]。其结果是，miRNA的发挥在启动和神经胶质瘤的进展中起关键作用。尽管如此，它的miRNA调节神经胶质瘤的发生和发展的分子机制尚不完全清楚。在目前的研究中，的miR-6869-5p在胶质瘤下调。它可以阻止脑胶质瘤细胞增殖和侵袭。就证明了荧光素酶报告测定中，的miR-6869-5p能够抑制胶质瘤细胞生长和侵袭的体外。此外，胶质瘤患者，低的miR-6869-5p表达者预后不良。因此，的miR-6869-5p是胶质瘤良好的诊断和预后标志物。然而，更多的功能性实验和体内实验是必要完全阐明的miR-6869-5p对肿瘤发生和神经胶质瘤的进展的影响。

PGK1是一种参与癌变的糖酵解酶，可由癌细胞产生，通过减少丝氨酸蛋白酶和纤溶酶中的二硫键，参与调控血管生成[29,30.]。PGK1的磷酸化增加促进肿瘤发生[29]。PGK1被证明是一种肿瘤促进剂，其也可影响癌细胞的敏感性和耐药性对放疗和化疗[31]。由丁等人的研究。显示的证据表明，PGK1增强了神经胶质瘤细胞抗辐射[32]。此外，PGK1作为一种蛋白激酶，在肿瘤发生过程中调节癌细胞的糖酵解代谢已被证实[29,33]。但是，有没有研究调查的miRNA-PGK1网络的神经胶质瘤细胞中的作用。在这项研究中，我们首次发现PGK1可以针对性地受miR-6869-5p神经胶质瘤细胞中调控。PGK1增强神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭，而的miR-6869-5p防止神经胶质瘤细胞生长和侵袭通过下调PGK1。然而，我们没有调查的miR-6869-5p / PGK1对癌细胞代谢胶质瘤的效果。鼓励未来的研究通过调节癌细胞代谢和靶向PGK1或其他关键酶来演示的miR-6869-5p抑制的肿瘤发生的一种新的机制。

总之，这项研究支持了miR-6869-5p是一个肿瘤抑制胶质瘤，其中通过靶向PGK1调节神经胶质瘤细胞增殖和侵袭。的miR-6869-5p的低表达预示在胶质瘤患者预后不佳。的miR-6869-5p可以作为一个很好的生物标志物为神经胶质瘤。

数据可用性

用于支持该研究结果的数据包括在项目之内。

利益冲突

所有的作者都声明他们没有竞争利益。

致谢

本研究获得山东省医疗卫生科技发展计划(2017WS578、2014WS0474)资助。

参考

1. H. Ohgaki和P. Kleihues，“神经胶质瘤的流行病学和病因学，”ACTA Neuropathologica卷。109，没有。1，第93-108，2005年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 姚l.， Zhou l, Deng Y.等，“中国患者脑胶质瘤风险与遗传多态性的关系:病例对照研究”OncoTargets和治疗卷。第12卷，第8241-8247，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
3. Q. T.奥斯特罗姆，L. Bauchet，F. G. Davis等人。等人，“在成人脑胶质瘤流行病学：一个‘科学的状态’检讨”神经肿瘤第16卷，no。7，第896-913页，2014。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
4. G. E. D.佩特雷斯库，A.A Sabo的，L. I. Torsin，G. A.克林，和M. P.德拉戈米尔，“脑癌基于微RNA治疗诊断学：基本原则，”实验与临床癌症研究杂志第38卷第2期1,2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
5. L.鹏，傅J.和Y明，“与miR-200系列：对神经胶质瘤多重影响，”癌症管理与研究，第10卷，1987-1992,2018年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
6. D.燕，郝C.，L.霄峰，L.宇晨，F.宇斌和Z.雷，“缺口的分子机制，特别强调的microRNA信号：胶质瘤的影响，”杂志细胞生理学卷。234，没有。1，第158-170，2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 辛，黄，朱，“非编码rna:神经胶质瘤细胞上皮-间质转化的调节因子”，病理学-研究和实践卷。215，没有。9，P。152539，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
8. Y.郭W.香港，X. Wang等，“微RNA小胶质细胞：怎么做的microRNA影响激活，炎症，小神经胶质细胞的极化和介导的小胶质细胞与神经胶质瘤之间的相互作用”。分子神经科学前沿卷。12，第125，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
9. “miRNA在神经胶质瘤中的作用”。从长凳到床边，”Acta Biochimica Polonica卷。62，没有。3，第353-365页，2015年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
10. E. Ngadiono和N. S. Hardiany，“向有效的胶质瘤治疗迈进:从脐带间充质干细胞的细胞外囊泡中提取的microRNA，”马来西亚医学科学院卷。26，没有。4，第5-16，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
11. J.菲格罗亚，L.M。菲利普斯，T.沙哈尔等人，“外来体从神经胶质瘤相关间质干细胞增加胶质瘤的致瘤性干细胞样通过的miR-1587的转移细胞，”癌症研究卷。77，没有。21，第5808-5819，2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
12. L. Saadatpour, E. Fadaee, S. Fadaei等，“胶质母细胞瘤:外泌体和microRNA作为新的诊断生物标志物”，癌症基因治疗卷。23，没有。12，第415-418，2016。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
13. S.严，G.柳，C. Jin等人，“微小RNA-6869-5p充当肿瘤抑制经由靶向TLR4 / NF-κ乙信令在结肠直肠癌途径，”杂志细胞生理学卷。233，没有。9，第6660-6668，2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
14. Yan S.， B. Han, S. Gao等，“外泌体封装microRNAs作为结直肠癌的循环生物标志物”Oncotarget卷。8，没有。36，第60149-60158，2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
15. c.m. Smith, D. Catchpoole, G. Hutvagner，《小儿实体瘤的非编码rna》，在遗传学前沿卷。10，第798，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
16. A. Goustin，P. Thepsuwan，M. Kosir和L. Lipovich，“生长阻滞特异的（气体）-5-长的非编码RNA：一个引人入胜lncRNA在癌症中广泛表达，”非编码RNA第5卷，no。第3页，2019年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
17. Y. H.林，“微小RNA调控网络在癌症氧化应激，”国外医学分子科学卷。20，没有。18，第4497，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
18. C. J.程，R. Bahal，I. A.巴巴尔等人，“微小RNA沉默用于靶向肿瘤微环境癌症疗法”自然卷。518，没有。7537，第107-110，2015。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
19. J. T. Powers, K. M. Tsanov, D. S. Pearson等，“神经母细胞瘤中破坏let-7 microRNA家族的多种机制，”自然卷。535，没有。7611，第246-251，2016。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
20. C.戈尔韦亚，T. Mosbruger和D. Cazalla，“A病毒的Sm-类RNA碱基对与的mRNA和微小RNA新兵抑制细胞凋亡，”自然卷。550，没有。7675，第275-279，2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
21. M.法布里，“自然杀伤细胞衍生水泡的miRNA：一种新的抗癌方法”癌症研究卷。80，没有。1期，第17-22，2020。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
22. M. Avgeris，K. Panoutsopoulou，M. A. PAPADIMITRIOU和A. Scorilas，“循环外来体的miRNA：在人类癌症临床意义”分子诊断学的专家评论卷。19，没有。11，第979-995，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
23. O.王，Y.黄，吴H.，郑B.，J.林和P.金，“LncRNA LOC728196 /的miR-513C轴功能有助于神经胶质瘤致癌物质的目标TCF7”基因，第679卷，第119-125页，2018年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
24. Y.元，L. Jiaoming，W.翔等人，“分析mRNA的相互作用中，miRNA，lncRNAs和circRNAs预测竞争在胶质母细胞瘤内源RNA网络”《神经肿瘤学学会举办的卷。137，没有。3，第493-502，2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
25. R.张，H.金，和F楼，“长非编码RNA TP73-AS1染miR-142相互作用，通过HMGB1 / RAGE途径调制脑胶质瘤生长”细胞生物化学杂志卷。119，没有。4，第3007-3016，2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
26. B.崔，李B.，Q.刘和Y.崔，“LncRNA CCAT1由海绵擦的miR-181B促进神经胶质瘤肿瘤发生，”细胞生物化学杂志卷。118，没有。12，第4548-4557，2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
27. “microRNA-193b在神经胶质瘤患者中的诊断和预后价值及其对肿瘤进展的影响”，朱m .， Zhao W.， Zhao H.， Zhang J.，“microRNA-193b在神经胶质瘤中的诊断和预后价值及其对肿瘤进展的影响”，肿瘤快报卷。18，没有。5，第4882-4890，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
28. 宋倩，庞海华，齐良等，“低microRNA-622表达预测神经胶质瘤的不良预后并与ZEB2相关，”OncoTargets和治疗，第12卷，第7387-7397页，2019年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
29. Y.张，G.宇，H. Chu等，“巨噬细胞相关PGK1磷酸化促进有氧糖酵解和肿瘤发生，”分子细胞卷。71，没有。2，第201-215.e7，2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
30. S. S. Ahmad, J. Glatzle, K. Bajaeifer等，“磷酸甘油激酶1作为结肠癌转移的启动子，”国际肿瘤学杂志第43卷，no。2，第586-590页，2013年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
31. J. W.周，J. J.汤，W. Sun和H.王“PGK1设施顺铂耐药通过触发子宫内膜癌HSP90 / ERK通路介导DNA修复及甲基，”分子医学第25卷，no。2019年，第11页。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
32. 丁海华，程玉杰，颜海华等，"磷酸甘油酸激酶1促进U251人胶质瘤细胞的放射抵抗"肿瘤的报道第31卷，no。2，第894-900页，2014。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
33. X. Li, Y. Jiang, J. Meisenhelder等，“线粒体移位的PGK1作为蛋白激酶在肿瘤发生中协调糖酵解和TCA循环。”分子细胞卷。61，没有。5，第705-719，2016。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索

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