壳聚糖为基础的纳米颗粒细胞内递送ISAV融合蛋白cDNA到黑素瘤细胞:发展溶瘤抗癌疗法的途径

摘要

溶瘤病毒疗法已经在临床前模型和临床试验中进行了抗癌试验。目前的证据表明，病毒诱导的细胞病变效应与融合蛋白介导的合胞体形成和真核细胞的免疫原性细胞死亡有关。我们之前已经证明，表达传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV-F) fusogenic蛋白的细胞生成的肿瘤细胞体可增强交叉聚合，并对黑色素瘤表现出预防性的抗肿瘤活性。在这项工作中，我们评估了ISAV-F的表达对B16黑色素瘤模型的影响在体外和在活的有机体内，以壳聚糖纳米颗粒为转染载体。我们证实，用壳聚糖纳米颗粒(NP-ISAV)转染B16肿瘤细胞可以表达具有fusogenically活性的ISAV-F蛋白，并由于合胞体的形成而降低细胞活力在体外．然而在活的有机体内转染诱导肿瘤生长延迟，而不会引起肿瘤和脾脏淋巴细胞的变化。总之，我们的观察表明，使用壳聚糖纳米粒表达ISAV融合蛋白可诱导黑色素瘤细胞融合和轻微的抗肿瘤反应。

1.介绍

溶瘤病毒治疗是一种新兴的癌症治疗方案。它利用有能力复制的病毒作为工具来摧毁癌细胞。它最初源自偶然的观察，病毒感染导致许多恶性肿瘤缓解。在肿瘤细胞中有效诱导细胞破坏的能力与受损的基因组修复机制有关，这允许不受控制的病毒复制，以及免疫反应机制的改变[1.]．在正常细胞中，这些保护反应保持病毒复制在控制之下，但fusogenic溶瘤病毒放弃这些保护反应，这就是为什么它们被认为有希望增强免疫治疗和启动广泛的抗肿瘤反应。这些病毒通过病毒融合蛋白表达介导的合胞体形成显示细胞病变效应[2.]．合胞体可在短时间内存活，有证据表明它经历免疫原性细胞死亡(ICD) [3.]．病毒-细胞融合是由一个或多个病毒表面糖蛋白实现的，称为fusogenic膜糖蛋白(FMGs)或简单的融合蛋白。fmg通过病毒膜和细胞膜之间的融合过程介导病毒进入细胞。如果蛋白活性在酸性环境中需要传代后修饰，fgs也会触发病毒膜和内体膜之间的融合。尽管自20世纪70年代以来，已经开展了一系列人类肿瘤病毒治疗的临床试验，但直到2015年，疱疹介导疗法才被FDA批准用于不可切除阶段的黑色素瘤的治疗[4.]．目前正在调查其他溶瘤病毒及其与其他治疗方法结合使用的情况[5.]；其中一些已经处于临床试验水平，具有良好的效果[3.,6.]．其中一些病毒利用直接和/或免疫介导机制，促进恶性细胞的有效死亡[7.,8.]．

有必要的病毒修改来开发安全有效的癌症免疫治疗，这是耗时的，而是缩放的延长[3.]．使用病毒融合蛋白已被提出作为使用完全病毒的替代方法。理论上，转染表达病毒融合蛋白的肿瘤细胞可能触发合胞体的形成，从而破坏肿瘤细胞，激活抗肿瘤免疫应答[3.]．例如,在体外融合长臂猿白血病病毒(GALV-F)蛋白在肝癌、黑色素瘤和纤维肉瘤的人肿瘤模型中的表达导致细胞死亡。这一过程是由合胞体形成和外泌体型细胞外囊泡(称为合胞体)的释放介导的，它可以被免疫细胞识别，从而引发抗肿瘤反应[9–11]．同样，在携带人类肺癌源性肿瘤的免疫缺陷小鼠中，用编码GALV-F蛋白或内源性人类逆转录病毒W (HERV-W)的F蛋白的基因进行瘤内治疗，显示出明显的肿瘤生长延迟[12]．

此外，使用含有活性fusogenic蛋白的复制缺陷腺病毒对抗同基因双侧结肠癌，提高了小鼠的生存和全身抗肿瘤免疫反应[13]．在B16黑色素瘤细胞中表达水疱性口炎病毒(VSV-G)的融合蛋白G时，观察到了类似的结果，提高了弱异体疫苗的疗效[14]．此外，人呼吸道合胞病毒(hRSV)融合蛋白在小鼠结肠癌模型中的表达导致了有效的局部抗肿瘤作用和细胞融合[13]．干扰素敏感的VSV编码呼肠孤病毒融合蛋白在体外对两种乳腺癌模型(MCF-7和4T-1)表现出更高的活性，并延长了4T1转移性哺乳动物癌和CT26转移性结肠癌动物的生存期在活的有机体内[15]．这一系列的研究结果表明，肿瘤细胞中病毒融合蛋白的表达会通过合胞体的形成和随后释放载有肿瘤抗原的合胞体杀死癌细胞，从而引发抗肿瘤反应[3.,11,16]．

使用表达fmg的肿瘤细胞产生的凋亡细胞中的死亡细胞或细胞外囊泡也被评价为抗肿瘤治疗。syncytiosomes释放在体外通过人类黑色素瘤细胞(Mel888和Mel624)表达GALV-F蛋白作为肿瘤抗原源，通过gp100(黑色素瘤相关抗原)的交叉表达激活CD8+ T淋巴细胞[11,16]．最近，我们小组报道了用表达传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV-F)融合蛋白的死肿瘤细胞免疫可促进抗原呈递并产生树突状细胞成熟。然而，它不能诱导有效的抗肿瘤反应在活的有机体内．在本研究中，我们评估了一种新的基于壳聚糖纳米颗粒的转染策略原位鼠黑素瘤肿瘤的转染与ISAV融合蛋白基因。我们提出了基于壳聚糖的生物相容性，生物相容性，生物分解性和无害性作为有效药物递送的药物赋形剂[17,18]．

2.材料和方法

2．1．纳米粒子的生成与表征

配合物由凝聚法生成[19使用壳聚糖(脱乙酰度为75-85%，50-190 kDa, Sigma)和描述的每种情况的载体。将0.25%的壳聚糖置于pH 5.5的醋酸中，与溶于MilliQ水中的质粒DNA (pDNA)混合，在55℃下孵育5分钟，然后在室温下保存30-60分钟直到使用。保持pDNA不变，改变壳聚糖的添加量，生成N/P (- nhh)比_2.一组壳聚糖对-PO_4.^2－1/4、1/20、1/28和1/40的pDNA）组。为了表征壳聚糖/pDNA复合物，我们进行了不同的评估。首先，我们使用0.8%琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中，用凝胶红染色，通过壳聚糖与裸pDNA（NV，裸载体）的电泳迁移延迟来确定复合物的形成（Biotium）。其次，根据用于生成复合物的初始pDNA量，通过计算pDNA复合物的百分比来确定pDNA负载效率（2.5） μg)， 14000 g离心10min后上清中pDNA的含量。用Tecan Infinite 200pro分光光度计对pDNA进行定量。第三，我们使用Zetasizer Nano ZS设备(Malvern Panalytical, United Kingdom)测定了配合物在1 ml悬浮液中的直径和zeta电位值，作为表面电荷的测量。第四，我们使用NanoScope IIIa Multimode Equipment (Digital Instruments, USA)的原子力显微镜(AFM)评估在N/P为1/20和1/28时合成的悬浮配合物的形貌。最后，以绿色荧光蛋白(GFP)编码序列为报告基因的表达载体，48小时后评估不同pDNA/复合物在B16细胞中的转染效率，确定GFP+ B16细胞。样品使用Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences, USA)进行分析，信息使用CFlow Plus软件(BD Biosciences)进行处理。

2．2．转录表达

ISAV-F蛋白的编码序列从pUC57载体亚克隆到真核细胞商业表达载体pIRES2 (BD Biosciences Clontech, PT3267-5)，如前面所述(Morales et al.， 2017)。

采用常规RT-PCR检测纳米颗粒(N/P为20)转染B16细胞48小时后ISAV-F mRNA的表达情况。简单地说，收集细胞，根据制造商的建议，用Trizol®Reagent (Gibco, 15596026)提取总RNA。随后,1μg总RNA经DNase处理(RQ1 DNase游离Rnase;Promega, M610A)在37°C下孵育30分钟，然后根据制造商的说明书使用逆转录酶M-MLV和OligodT15 (Promega, C1101)进行cDNA合成。采用PCR (Fw 5)检测ISAV-F的转录本 -ATCGAAGCTTATGGCATTCCTGACTAT-3和房车5 -CCTGGTGCACTTCGGACG-3 ），检测酶甘油醛3-磷酸脱氢酶的转录物（GAPDH，FW 5 -TCGGTGAACGATTTTGGC-3和房车5 -TTTGCCGTGAGTGGAGTCATACTG-3 )作为构成表达的控制。获得的产品在1%琼脂糖凝胶染色与凝胶红(Biotium, 41002)观察。

２．３．细胞融合

通过评估转染的B16细胞中的合胞苷的存在进一步证实细胞融合。简而言之，将B16细胞接种在盖玻片上。当达到40-60％的汇合时，用0.5转染 μ根据制造商的建议，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668027)和2.5 . g的pIRES-ISAV质粒μ在N/ p20条件下合成的壳聚糖NPs中含有相同质粒。posttransfection 48小时,细胞用PBS和孵化CellMask橙色质膜染色探针(生活技术,C10045)根据制造商的建议,与3.75%多聚甲醛固定30分钟在37°C和最后孵化与DAPI 0.5毫克/毫升为5分钟。覆盖层用DABCO固定在载玻片上，用LSM 800蔡司共聚焦显微镜观察。分别在B16、B16 Lipo-ISAV和B16 NP-ISAV中测定合胞体数量，并按场表达。

２.４.细胞毒性

通过检测转染后B16细胞的代谢活性来评估ISAV-F表达对细胞活力的影响。要做到这一点, 在上述相同条件下，用壳聚糖纳米粒或Lipofectamine 2000转染B16细胞。24、48和120小时后，按照制造商的建议进行MTT (Sigma-Aldrich, M2128)检测。未转染细胞在570 nm处的吸光度值作为100%的活力值。

2．5．动物

转C57BL/6J FoxP3转基因小鼠8 ~ 10周^{GFP +}在Treg细胞中FoxP3启动子控制下表达GFP的实验材料来自智利圣地亚哥大学(Universidad de Santiago de Chile)的动物设施Facultad de Química y Biología。这些动物被养活了自由在12月12日的光和暗循环下进食。实验动物协议由智利圣地亚哥大学生物伦理委员会批准(第489号信)。

B16细胞悬浮液用于诱导C57BL/6J FoxP3的肿瘤发生^{GFP +}皮下(s.c.)注射 小鼠腰区活细胞(挑战)。当肿瘤达到2.0 mm时，将动物分为三组^3.，可检测的肿瘤出现在挑战后的第9天和第17天之间。实验组中所有动物的肿瘤分布和肿瘤发生的发生没有显着差异。第一组未接受治疗（对照），第二组被壳聚糖（CH）处理，第三组用NPS的壳聚糖和PIRES-ISAV（NP-ISAV）处理。壳聚糖治疗包括122的肿瘤内（即）注射 μG / 100μPBS的l。NP-ISAV处理包括注射在N/ p20合成的纳米颗粒悬浮液，该悬浮液由122组成μg壳聚糖和10 μg pIRES-ISAV在100μPBS的l。用卡尺测量肿瘤大小，根据半球公式计算肿瘤体积，评估肿瘤生长情况( ,在哪里对应的体积单位为mm^3.和是肿瘤半径为mm）。最大肿瘤体积（MTV）为​​260毫米^3.作为终点标准，动物被颈椎脱位处死并进行后续分析。

2.6。脾细胞和浸润性肿瘤淋巴细胞的评价

Euthanasia后，C57BL / 6 Foxp3的脾脏和肿瘤^{GFP +}老鼠提取。脾脏在100目金属网格中被分解，然后用ACK缓冲液(155 mM nhh)处理_4.氯，10毫米KHCO_3.，及 嗯，那_2.EDTA, pH 7.3)，轻轻摇匀5分钟，通过差异裂解去除红细胞。同时切除肿瘤，胰酶(HyClone, SH30042.01)在RPMI 1640培养基(Gibco, 31800022)中，37℃持续搅动30分钟。在此之后，收集细胞，清除实体瘤残留，剩余的溶液与脾脏提取液，1600 g离心5分钟。脾细胞和肿瘤细胞在含有10%胎牛血清(BFS)的RPMI 1640培养基(Gibco, 31800022)中重悬(Biological, DW105804-127-1A)。脾细胞标记, 细胞，肿瘤细胞，150μL。所有抗体在4°C下标记30分钟。CD8+和CD4+人群标记分别使用Anti-Mouse CD8a-PE (eBioscience, Clone: 53-6.7)和Anti-Mouse CD4- pe (eBioscience, Clone: GK1.5)。对于CD4+亚群，在4℃下用Fix-Perm缓冲液(细胞内固定渗透缓冲液，eBioscience, 88-8824-00)固定和渗透细胞30分钟，然后标记;对CD4 + RORγt (Th17)，抗小鼠RORγt-APC（eBioscience，克隆B2D）；对于CD4+Tbet（Th1），抗人/小鼠Tbet-PE-Cyanine7（eBioscience，克隆：eBio4B 10）。最后，FoxP_3.CD4+亚群(Treg)是通过使用报告小鼠的FoxP3-GFP标记来确定的。数据采集使用了BD Accuri C6设备(BD Bioscience, USA)，数据分析使用了FlowJo 7.6.1软件。

2.7。统计分析

结果用图表示为 并通过非参数Mann–Whitney检验进行分析。使用95%的置信值。所有分析均使用GraphPad Prism 5.01软件（美国GraphPad软件公司）进行。

3.结果

3.1.纳米颗粒表征

通过在琼脂糖凝胶中的壳聚糖存在下PDNA的电泳迁移来评价壳聚糖和PGFP之间的复合物的形成。在以N / P比为1/4合成的络合物的情况下，所获得的PDNA带状图案与没有壳聚糖的对照相似（图1（a）)，表明部分pGFP是游离的，不与壳聚糖相互作用。相反，在存在较高水平的壳聚糖（N/P比为1/20、1/28和1/40）的情况下合成的复合物中，未观察到pGFP迁移；这是它们与多糖完全相互作用的证据（图1）1（a））.为了测量复合物形成的效率，我们量化了负载效率，这是由壳聚糖络合pGFP的量所决定的。根据壳聚糖的相对含量，我们观察了装载效率的差异。以壳聚糖相对含量最低(N/P比为1/4)合成的配合物能配合70%的有效pDNA。然而，当氮磷比分别提高到1/20、1/28和1/40时，负载效率分别达到92%、97%和93%(图4)1（b））.

一旦确定了络合物的形成，物理参数如尺寸、表面电荷(由zeta电位确定)和形态就被分析了。我们观察到在N/P比为1/4时合成的配合物的单分散直径，从分布图中32.7 nm处的单峰可见一斑。当N/P比为1/20和1/28时，配合物也表现出类似的行为，其直径为68.1 nm;当N/P比为1/40时，其直径为78.8 nm1 (c)）.该证据支持所有壳聚糖/ PGFP络合物的直径低于100nm的事实，符合纳米粒子（NP）分类的标准。

通过测量zeta电位来评估NPs的表面电荷。N/P比为1/4时，NPs呈单色散，在-1.22 mV处有一个峰值;N/P比为1/28和1/40时，NPs有两个峰值(N/P比为1/28:2.08和31.8 mV;N/P比为1/40:-2.81和23.2 mV)，说明NP总体是异质性的。相比之下，N/P比为1/20的纳米颗粒也表现出均匀分布，有一个接近7.15 mV的单正峰(图)1 (d)）.正的电位值表明NPs具有正的表面电荷。这一特性增加了它在水介质中的溶解度，并促进了它与细胞膜的相互作用。

NP物理表征的最后一步是用原子力显微镜测定它们的形态。在N/P为1/20时合成的NPs呈均匀的球状形态。然而，当壳聚糖的添加量达到N/P比1/28时，可以得到球形纳米粒子和游离的壳聚糖纤维(图)1 (e))，证明壳聚糖过量。

为了确定纳米颗粒在培养细胞中的可能的细胞毒性作用，在处理24、48和120小时后评估细胞对B16肿瘤细胞的代谢活性。与未处理的对照组相比，在所有评估条件下，纳米颗粒处理的细胞存活率均无显著差异(图)1 (f)）.这些结果表明，实验剂量范围内的壳聚糖- pgfp纳米颗粒对培养的B16细胞无毒性。

最后，评估NPS的功能度测量其在B16细胞中的转染容量，量化GFP阳性细胞的百分比（GFP⁺)。所有评估的NPs显示超过40%的GFP⁺细胞，在所有情况下都显著高于对照组的非转染细胞。有趣的是，N/P比例为1/4的细胞比Lipofectamine(18%)转染的细胞效率更高(图)1 (g)）.

３．２．ISAV-F蛋白在B16细胞中的表达

我们的主要目标是确认之前描述的ISAV在哺乳动物细胞中的fusogenic活性(Morales et al.， 2017)，在本案例中，利用壳聚糖纳米颗粒作为低毒高效转染方法[20.].根据我们的NP表征结果，如材料和方法中所述，壳聚糖/pIRES-ISAV复合物以1/20的N/P比合成。在这些条件下，我们观察到pIRES-ISAV载体的延迟电泳迁移，表明与壳聚糖的成功络合作用（图2(一个)）.这些配合物的平均纳米颗粒直径接近100 nm(图)2 (b)）和Zeta势值为5.57 mV的正面浅表电荷（图2 (c)）.使用NP-ISAV(壳聚糖/ pres -ISAV纳米颗粒)转染B16细胞48小时后，检测到与ISAV转录本相对应的预期扩增子。当我们使用Lipofectamine (lipoisav)时，也观察到了同样的结果，但在未转染的细胞中没有观察到(图)2 (d)）.综上所述，这些结果表明，使用NP-ISAV作为转染方法，可使ISAV-F转录本在培养的B16细胞中表达。

通过评估合胞体48的存在来确定ISAV-F蛋白的融合活性 B16细胞转染后h。此时，我们观察到大的多核细胞，这是NP-ISAV转染细胞成功合胞体形成的明显标志。在Lipo-ISAV转染细胞中也观察到这种现象，但在未转染细胞中未观察到（图2 (e)）.B16、B16 Lipo-ISAV和B16 NP-ISAV的合胞体数量如材料和方法所述。不管转染方法如何，在所有测试条件下，ISAV诱导的合胞体数量显著增加(图)2 (f)）.在NP-ISAV转染的细胞中，观察到合胞体与转染后48 - 120小时B16细胞活力下降20%相关(图)2 (g)）.综上所述，这些结果表明，用NP-ISAV转染B16肿瘤细胞后，可以表达具有fusogenically活性的ISAV-F蛋白，并降低与合胞体形成相关的细胞活力。

3.3。黑色素瘤NP-ISAV腹腔内治疗的影响

我们之前报道过表达ISAV-F的B16细胞产生的一种特定类型的细胞体诱导抗原呈递在体外，但在黑素瘤免疫小鼠中不会产生抗肿瘤反应[21]．基于这一发现，我们的目标是确定在活的有机体内肿瘤内注射NP-ISAV对小鼠B16黑素瘤生长的影响用B16细胞刺激的小鼠在刺激后第9到17天显示出可检测到的肿瘤(图)3(一个)).肿瘤达到2小时后，通过i.t.注射NPs 嗯^3.体积，每天监测肿瘤，直至其达到260mm的最大体积（MTV）^3.．将接受治疗的动物的肿瘤生长情况与对照组(未接受治疗)进行比较。我们观察到，在3只小鼠中，NP-ISAV治疗诱导肿瘤生长延迟，在1只小鼠中肿瘤完全消退(图)3 (b)）.CH治疗诱导两只小鼠的延迟并在一只小鼠中完全回归。然而，在用壳聚糖处理的基团中没有观察到壳聚糖处理的基团没有显着差异，相对于NP-ISAV治疗组。

根据在表达ISAV-F的死B16细胞免疫小鼠中观察到的结果，对我们观察到的肿瘤生长延迟的一个可能的解释可能与对肿瘤的免疫反应的诱导有关[21]．我们没有观察到肿瘤中CD4+和CD8+浸润淋巴细胞数量的显著变化(图)3 (c))和脾脏(图4.）.同样，脾脏表达Tbet、ROR的CD4+未见变化γt和Foxp3，在NP-ISAV处理后，仅观察到几丁糖处理后脾脏Tbet+细胞显著增加(图5.）.总之，我们的结果表明，瘤内NP-ISAV治疗诱导了显著的肿瘤延迟，可能与细胞融合诱导有关。

4.讨论

我们发现，含有ISAV融合蛋白基因的壳聚糖纳米颗粒对小鼠B16黑色素瘤的瘤内治疗延迟了肿瘤的生长，并在一个病例中诱导了肿瘤的完全消退。据我们所知，这项工作是关于ISAV-F蛋白在哺乳动物细胞中fusogenic活性的第二份报告。第一部作品由我们小组发表[21并引导我们提出了一种基于壳聚糖纳米颗粒的病毒融合蛋白基因胞内传递的抗肿瘤疗效的改进。

根据证据，与病毒融合蛋白相关的抗肿瘤作用是基于这些蛋白的破坏性功能和免疫系统的作用。虽然isav - f介导的效应可以用多种方式解释，但我们认为，由于GALV和HERV-W融合蛋白在人类肺癌肿瘤中的表达，直接的细胞病变效应是其瘤内效应的关键[12]．在这种癌症模型系统中，GALV-F蛋白的高度融合变异诱导形成半衰期短的不稳定合胞体，从而增加细胞毒性[10,12抑制肿瘤生长在活的有机体内[12,16]大多数关于病毒融合蛋白抗肿瘤作用的研究主要基于GLAV-F蛋白的高度融合变体的作用，GLAV-F蛋白是长臂猿白血病病毒包膜的一部分，负责介导病毒膜和靶细胞膜之间的融合。GALV-F在人肺癌H322和A549细胞中的表达在转染后第4天和第5天分别导致细胞活力下降55.5%和78.9%[12]．这种细胞毒性作用归因于GALV-F介导的细胞融合形成多核或合胞细胞。这些合胞体最初是可存活的，并在代谢和转录方面保持活性[10]．然而，它们最终会失去黏附并死亡，这是一种尚未完全确定的细胞死亡类型。实际上,凋亡[22]和非凋亡性细胞死亡[11在最近的报告中都有记载。尽管我们没有观察到合胞体的侵略性形成在体外表达ISAV-F后，细胞毒性作用明显。因此，我们不能排除这种可能的行动方式在活的有机体内．

此外，合胞体相关的细胞死亡与一种高度免疫原性的细胞死亡类型相对应，其特征是释放几个名为合胞体的细胞外囊泡，其中包含肿瘤抗原[11]．这些同形细胞已被证明是成熟和激活抗原提呈细胞的有效抗原来源。这些细胞激活CTL淋巴细胞，从而导致抗肿瘤免疫反应的组装在活的有机体内[14,23–25]因此，我们假设在缺乏营养的情况下，表达ISAV-F的死亡B16黑色素瘤细胞是诱导DC成熟和抗原交叉呈递的有效抗原源在体外．此外，cb -B16- isav预防免疫小鼠诱导B16黑色素瘤肿瘤生长延迟，并伴有脾脏CD4+和CD8+ T淋巴细胞数量的增加[21]．虽然在此工作,NP-ISAV治疗并没有引起显著分析淋巴细胞数量的变化,这些变化我们测量的时间点可以解释这些结果,尽可能治疗引发的变化对T细胞的数量可能已经克服当时我们测量(MTV实现时)26,27]．没有变化确实有可能反映了晚期的抗肿瘤免疫反应，其作用可能被肿瘤细胞所克服，从而导致肿瘤生长。此外，不同类型的细胞可能在这种反应中发挥作用，如自然杀伤(NK)淋巴细胞[28]．

壳聚糖自20世纪80年代起就开始进行抗肿瘤活性的研究。壳聚糖寡衍生物口服给瘤小鼠治疗肉瘤180 [29]，并通过静脉注射给有甲基苯丙胺肿瘤的小鼠[30.]诱导肿瘤生长抑制，增加IL-1和IL-2水平，并对细胞毒性T淋巴细胞极化，在甲胺磷的情况下。从那时起，大量的报告发表了使用壳聚糖作为小分子载体，通过口服、胃内、静脉和腹腔给药治疗不同形式的癌症[31,32.]．此外，在小鼠B16黑色素瘤模型中，壳聚糖腹腔治疗通过树突状细胞的作用导致IFN的激活和作用引发抗肿瘤免疫反应γ分泌NK淋巴细胞[28]．这些结果表明，壳聚糖可能与免疫系统激活产生干扰素有关γ．在体外分析表明，壳聚糖可以激活树突细胞[28,33.]和巨噬细胞[34.,35.]，触发IL-1的释放βIL-12是CD4+淋巴细胞向效应Th1淋巴细胞极化并增加IFN水平的关键细胞因子γ(一种有效的抗肿瘤细胞因子)[36.]．在这项工作中，在用壳聚糖治疗小鼠后，肿瘤生长延迟和肿瘤完全消退，这支持了这种天然聚合物诱导抗肿瘤细胞反应的想法，可能是由Th1 (Tbet+)淋巴细胞控制的。

5.结论

总之，壳聚糖纳米颗粒允许融合活性ISAV融合蛋白的表达，从而诱导B16黑色素瘤细胞的细胞融合和细胞毒性在体外．然而，其用于治疗黑素瘤诱发轻微在活的有机体内与壳聚糖治疗相比的抗肿瘤作用。我们认为有必要进行进一步的研究，但ISAV-F可能是治疗生长缓慢的肿瘤的良好替代/补充剂。

数据可用性

所有用于支持本研究发现的数据均可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

我们要感谢Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Nos. 1161015, 11140731, 11140915，和1180666)，Programa de Equipamiento Científico y Tecnológico (EQM150069和EQM190024)， Dirección de Investigación Científica y Tecnológica (Nos. 021943AC, 021801LR，和021801MB)，Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (No. 21171377)和Fondap(15130011)。

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