心肌梗死 炎症介质 1466 - 1861 0962 - 9351 Hindawi 10.1155 / 2020/8680692 8680692 研究文章 Chitosan-Based纳米颗粒对细胞内交付ISAV融合蛋白cDNA成黑色素瘤细胞:一条路径发展溶瘤细胞的抗癌疗法 Robles-Planells 克劳迪亚 1 2 3 Sanchez-Guerrero 吉塞尔 1 2 Barrera-Avalos 卡洛斯 1 https://orcid.org/0000 - 0003 - 3797 - 6034 Matiacevich 西尔维亚 4 https://orcid.org/0000 - 0002 - 0188 - 2266 红色的 曼扎诺E。 1 2 Pavez 豪尔赫 5 https://orcid.org/0000 - 0003 - 4355 - 5252 Salas-Huenuleo 爱迪生 6 7 Kogan 马塞洛·J。 6 7 https://orcid.org/0000 - 0002 - 1587 - 4179 Escobar 亚历杭德罗 8 https://orcid.org/0000 - 0001 - 9738 - 6234 米拉 路易斯。 9 费尔南德斯 里卡多 10 Imarai 莫妮卡 1 2 斯宾塞 Eugenio 1 2 Huidobro-Toro 胡安-帕布鲁 1 3 https://orcid.org/0000 - 0003 - 3607 - 6077 Acuna-Castillo 克劳迪奥。 1 2 Kleinjan 亚历克斯 1 Departamento de Biologia Facultad de Quimica y Biologia 智利圣地亚哥大学(USACH) 阿拉米达 3363年圣地亚哥 智利 usach.cl 2 Centro de Biotecnologia Acuicola 智利圣地亚哥大学(USACH) 阿拉米达 3363年圣地亚哥 智利 usach.cl 3 Centro de Nanociencias y Nanotecnologia 智利圣地亚哥大学(USACH) 智利 usach.cl 4 Departamento de Ciencia y Tecnologia de los Alimentos Facultad Tecnologica 智利圣地亚哥大学(USACH) 阿拉米达 3363年圣地亚哥 智利 usach.cl 5 Departamento de Quimica de los材料 Facultad de Quimica y Biologia 智利圣地亚哥大学(USACH) 阿拉米达 3363年圣地亚哥 智利 usach.cl 6 Laboratorio de Nanobiotecnologia y Nanotoxicologia Departamento de Quimica Farmacologica y Toxicologica Facultad de Ciencias Quimicas y Farmaceuticas 智利大学 智利 uchile.cl 7 先进的慢性疾病中心 智利大学 智利 uchile.cl 8 皇家研究院Investigacion en Ciencias Odontologicas Facultad de Odontologia 智利大学 智利 uchile.cl 9 基于Centro de Investigacion y Aplicada (CIBAP) 医学院药物 Facultad de Ciencias》 智利圣地亚哥大学 智利 usach.cl 10 Departamento de Salud 拉各斯大学 Osorno 智利 ulagos.cl 2020年 29日 4 2020年 2020年 18 12 2019年 11 03 2020年 09年 04 2020年 29日 4 2020年 2020年 版权©2020克劳迪娅Robles-Planells et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

溶瘤病毒治疗与癌症的检测在临床前模型和临床化验。目前的证据表明,病毒诱导细胞病变效应与fusogenic protein-mediated合胞体形成和真核细胞的免疫原性细胞死亡。我们曾表明,肿瘤细胞产生的身体细胞表达fusogenic传染性鲑鱼贫血病毒的蛋白质(ISAV-F)增强crosspriming和显示预防性抗肿瘤活性对黑色素瘤肿瘤。在这项工作中,我们评估的影响对黑色素瘤B16转椅ISAV-F的表达模型,两者兼而有之 在体外和 在活的有机体内,使用壳聚糖纳米粒子作为转染载体。我们确认B16转椅的转染肿瘤细胞与壳聚糖纳米粒子(NP-ISAV)允许fusogenically活跃ISAV-F蛋白的表达,减少因为合胞体形成细胞生存能力 在体外。然而, 在活的有机体内转染诱导肿瘤生长延迟,没有诱导肿瘤淋巴数量的变化和脾脏。完全,我们的观察表明,使用壳聚糖纳米粒子ISAV融合蛋白的表达诱导细胞融合在黑色素瘤细胞和轻微的抗肿瘤反应。

 Fondap 15130011 Comision Nacional de Investigacion Cientifica y Tecnologica 21171377 Direccion de Investigacion Cientifica y Tecnologica 021801 mb 021801 lr 021943交流 项目Equipamiento Cientifico y学府 EQM190024 EQM150069 洋底Nacional de Desarrollo Cientifico y学府 1180666 11140915 11140731 1161015 1。介绍

溶瘤病毒治疗是癌症治疗的新兴约定的选项。它使用主管复制病毒作为工具来摧毁癌细胞。它最初来源于偶然的观察,病毒感染导致许多恶性肿瘤缓解。能够有效地诱导细胞破坏肿瘤细胞与基因组受损修复机制,它允许不受监管的病毒复制,以及免疫反应机制的改变( 1]。在正常细胞中,这些保护性反应控制病毒复制,但是fusogenic溶瘤病毒放弃这些保护性反应,这就是为什么他们被认为是很有前途的候选人来增强免疫疗法,开始广泛的抗肿瘤反应。这些病毒合胞体形成显示细胞病变效应通过由病毒融合蛋白的表达( 2]。合胞体短时间时间是可行的,有证据表明,它经历了免疫原性细胞死亡(ICD) ( 3]。Virus-cell融合是通过一个或多个病毒表面糖蛋白,指示为fusogenic膜糖蛋白(消费品)或简单的融合蛋白。消费品调解病毒进入细胞的融合病毒膜和细胞膜之间的过程。消费品也触发病毒膜之间的融合和endosomal膜如果蛋白质活动需要posttraductional在酸环境中修改。虽然一系列oncoviral治疗临床试验在人类进行了自1970年代以来,直到2015年,herpes-mediated疗法被FDA批准用于治疗不可切除的阶段的黑色素瘤( 4]。额外的溶瘤病毒和他们的使用结合其他治疗是目前正在接受调查 5];他们中的一些人已经在临床试验水平的有前途的影响( 3, 6]。这些病毒的一些促进有效的恶性细胞死亡,采用直接和/或免疫介导机制[ 7, 8]。

病毒修改开发安全有效的癌症免疫疗法是必要的,这是耗时而昂贵的扩大( 3]。提出了使用病毒融合蛋白作为一种替代方法使用完整的病毒。理论上,转染肿瘤细胞表达的病毒融合蛋白可能引发合胞体形成,因此,破坏肿瘤细胞和抗肿瘤免疫反应的激活 3]。例如, 在体外表达的融合长臂猿猿白血病病毒(GALV-F)蛋白在人类肝癌的肿瘤模型,黑色素瘤,纤维肉瘤细胞死亡引起的。这个过程是由合胞体形成和exosome-type细胞外囊泡的释放,叫做syncytiosomes,它可以被免疫细胞引发的抗肿瘤反应( 9- - - - - - 11]。同样,intratumor治疗在人类肺癌carcinoma-derived肿瘤、免疫缺陷小鼠轴承与基因编码GALV-F人类内源性逆转录病毒的蛋白质或F W (HERV-W),显示了明显的延迟在肿瘤的生长 12]。

此外,使用replication-defective腺病毒包含活跃fusogenic蛋白质对同源的双边结肠癌导致改善生存和系统性小鼠的抗肿瘤免疫反应( 13]。也观察到当类似的结果表达的融合蛋白G水泡性口炎病毒(VSV-G) B16转椅黑色素瘤细胞,改善薄弱的同种异体疫苗的功效[ 14]。同时,融合蛋白的表达人类呼吸道合胞体病毒(hRSV)在小鼠结肠癌模型导致的局部抗肿瘤作用和细胞融合 13]。水疱性口炎病毒Interferon-sensitive编码呼肠孤病毒融合蛋白表现出增加乳腺癌的活动对两个模型体外(MCF-7和4 t - 1)和扩展生存4 t1哺乳动物转移性癌症和转移性结肠癌CT26动物 在活的有机体内( 15]。这一系列研究的结果表明,病毒融合蛋白的表达在肿瘤细胞杀死癌细胞通过合胞体形成和后续释放syncytiosomes含有肿瘤抗原,进而会引发抗肿瘤反应( 3, 11, 16]。

使用死亡的细胞或细胞外囊泡从凋亡细胞产生肿瘤细胞表达消费品也被评为antitumoral疗法。syncytiosomes释放 在体外由人类黑色素瘤细胞(Mel888和Mel624)表达GALV-F蛋白作为肿瘤抗原来源,CD8 + T淋巴细胞激活的crosspresentation gp100,与黑素瘤相关抗原( 11, 16]。最近,我们小组报告说,与死亡的肿瘤细胞表达的融合蛋白免疫病毒传染性鲑鱼贫血(ISAV-F)促进抗原表示和生成树突状细胞成熟。然而,它未能引起一种有效的抗肿瘤反应 在活的有机体内。在目前的研究中,我们评估一个新的转染策略基于壳聚糖纳米粒子 原位转染小鼠黑色素瘤肿瘤与ISAV融合蛋白基因。我们建议这个策略基于生物相容性,生物降解能力,无害的壳聚糖作为有效的药物赋形剂药( 17, 18]。

 2。材料和方法 2.1。纳米粒子生成和特征

生成的复合物是凝聚方法( 19)使用壳聚糖(75 - 85%的脱乙酰作用程度和50 - 190 kDa,σ),针对每种情况描述的向量。壳聚糖在0.25%醋酸,pH值为5.5,与质粒DNA混合(pDNA)溶解在水和孵化MilliQ 5分钟55°C,然后在室温下保持30 - 60分钟,直到它的使用。pDNA保持不变,壳聚糖的量是不同的,生成N / P比值(nh2壳聚糖与po42 -群pDNA)的1/4,1/20,1/28,1/40。的壳聚糖/ pDNA复合体,我们做出了不同的评估。首先,我们确定复杂地层的电泳迁移延迟pDNA复杂的壳聚糖相比,裸pDNA (NV,赤裸裸的向量),用0.8%的琼脂糖凝胶TAE缓冲区,沾胶红(Biotium)。第二,pDNA加载效率取决于计算的百分比pDNA复杂,基于数量的初始pDNA用于生成复合物(2.5 μg)和pDNA目前离心后的上层清液14000克10分钟。pDNA量化使用Tecan无限200分光光度计。第三,我们确定了直径和电动电势值,测量的表面电荷,暂停1毫升的复合物,用Zetasizer Nano z设备(英国莫尔文Panalytical)。第四,我们评估暂停复合物的形态合成的N / P比值1/20和1/28通过原子力显微镜(AFM)毫微秒示波器iii a多模设备(数字仪器,美国)。最后,用一个与绿色荧光蛋白(GFP)表达载体编码序列作为一名记者,我们评估的转染效率不同pDNA /复合物在细胞B16转椅后48小时内,确定GFP +细胞B16转椅。样品进行了分析使用Accuri C6流式细胞分析仪(美国BD生物科学),和信息处理使用CFlow +软件(BD生物科学)。

 2.2。转录表达

ISAV-F蛋白质编码序列的subcloned pUC57向量为商业为真核细胞表达载体,pIRES2 (BD生物科学Clontech PT3267-5)如前所述(Morales et al ., 2017)。

ISAV-F mRNA表达在48小时后细胞B16转椅posttransfection与纳米颗粒在20 N / P比值评价常规rt - pcr。简单地说,这些细胞被收获,总RNA提取与试剂盒®试剂(Gibco, 15596026)根据制造商的建议。随后,1 μ克总RNA治疗DNase (RQ1 DNase核糖核酸酶的自由;Promega M610A)为30分钟37°C,然后用于互补脱氧核糖核酸合成使用逆转录酶M-MLV和OligodT15 (Promega C1101)根据制造商的指示。ISAV-F的成绩单是由PCR检测(Fw 5 ′ -ATCGAAGCTTATGGCATTCCTGACTAT-3 ′ 和房车5 ′ -CCTGGTGCACTTCGGACG-3 ′ ),检测酶的转录5 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH,弗雷德里克 ′ -TCGGTGTGAACGGATTTGGC-3 ′ 和房车5 ′ -TTTGCCGTGAGTGGAGTCATACTG-3 ′ )作为控制组成型表达。观察产品获得1%的琼脂糖凝胶染色凝胶红(Biotium, 41002)。

 2.3。细胞融合

细胞融合进一步证实了评估在转染细胞B16转椅合胞体的存在。简单地说,B16转椅细胞被播种在盖玻片。40 - 60%融合实现时,转染了0.5 μpIRES-ISAV质粒使用Lipofectamine 2000 g(表达载体,11668027)根据制造商的建议和2.5 μg相同的质粒存在于壳聚糖NPs合成N / P 20。posttransfection 48小时,细胞用PBS和孵化CellMask橙色质膜染色探针(生活技术,C10045)根据制造商的建议,与3.75%多聚甲醛固定30分钟在37°C和最后孵化与DAPI 0.5毫克/毫升为5分钟。封面是安装在幻灯片DABCO和LSM 800蔡司共焦显微镜观察。数量的合胞体在B16转椅量化,B16转椅Lipo-ISAV,和B16转椅NP-ISAV并表示数量的字段。

 2.4。细胞毒性

ISAV-F表达式产生的效应细胞生存能力评估是通过测量在转染B16转椅细胞代谢活动。要做到这一点, 3所示。5 × 10 4 B16转椅细胞转染与壳聚糖纳米粒子或Lipofectamine 2000在相同条件下上面提到的。后24、48和120小时,MTT (Sigma-Aldrich M2128)化验进行符合制造商的建议。吸光度值在570 nm nontransfected细胞被用作生存价值的100%。

 2.5。动物

的8 - 10周的转基因小鼠C57BL / 6 j FoxP3压力GFP +GFP表达FoxP3在Treg细胞启动子的控制下得到的动物设施Facultad de Quimica y Biologia从智利圣地亚哥大学。动物被维护 随意喂养12/12光明与黑暗周期。实验动物协议生物伦理委员会批准的智利圣地亚哥大学(489号信)。

B16转椅细胞悬浮液被用来诱导C57BL / 6 j FoxP3的肿瘤发展GFP +通过皮下注射(南) 2 × 10 5 活细胞小鼠腰椎地区(挑战)。动物被分为三组,肿瘤大小达到2.0毫米3天9到17岁之间的,检测肿瘤出现后的挑战。肿瘤分布在所有动物和实验中出现的肿瘤组没有显著不同。第一组不接受治疗(控制),第二组是处理壳聚糖(CH),第三组接受NPs的壳聚糖和pIRES-ISAV (NP-ISAV)。壳聚糖处理由一个瘤内注射(信息技术)122 μ100年g(壳聚糖 μPBS的l。NP-ISAV治疗由纳米颗粒悬浮的it注入合成N / P 122组成的 μ克壳聚糖和10 μ100年g pIRES-ISAV μPBS的l。肿瘤生长是评估通过测量肿瘤大小使用卡尺和计算肿瘤体积根据stokes定理的公式( V = 2 / 3 π r 2 ,在那里 V 对应的体积在毫米3和 r 是肿瘤在毫米半径)。最大的肿瘤体积(MTV)的260毫米3作为端点条件,动物被颈椎脱位牺牲为后续的分析和处理。

 2.6。脾细胞和肿瘤浸润淋巴细胞评估

安乐死后,脾脏和C57BL / 6 FoxP3的肿瘤GFP +老鼠提取。脾脏被分解在一个100 -网状金属网格,然后处理ACK缓冲NH(155毫米4KHCO Cl, 10毫米3,1毫米Na2EDTA, pH值7.3)为5分钟温柔颤抖的删除,微分溶菌作用,红细胞。并行,肿瘤被切断和胰蛋白酶处理(RPMI 1640 HyClone SH30042.01)中(Gibco, 31800022),在30分钟37°C与常数风潮。之后,收集细胞,固体肿瘤仍被淘汰,剩下的解决方案,随着来自脾,在1600 g离心5分钟。脾细胞和肿瘤细胞resuspended RPMI 1640介质(Gibco, 31800022)与10%胎牛血清(BFS)(生物、dw105804 - 127 - 1 - a)。脾细胞标记, 2 × 10 6 细胞,对肿瘤细胞,150 μl先前获得的细胞悬液。所有抗体标记进行30分钟在4°C。CD8 +及CD4 +人口标签,Anti-Mouse CD8a-PE (eBioscience,克隆:53 - 6.7)和Anti-Mouse CD4-PE (eBioscience,克隆:GK1.5)被使用,分别。CD4 +亚种群,这些细胞被固定和permeabilized Fix-Perm缓冲区(细胞内固定透化作用缓冲设置,eBioscience, 88-8824-00)在4°C为30分钟,随后标记;对CD4 + ROR γAnti-Mouse ROR t (Th17) γt-APC (eBioscience克隆B2D);和CD4 + Tbet (Th1),反/鼠标Tbet-PE-Cyanine7 (eBioscience,克隆:eBio4B 10)。最后,FoxP3CD4 +分组人口(Treg)确定使用老鼠记者FoxP3-GFP标签的使用。数据采集,BD Accuri C6设备(美国BD生物科学),和数据分析,FlowJo 7.6.1软件使用。

 2.7。统计分析

结果绘制和作为 平均 价值 ± 扫描电镜 和分析的非参数Mann-Whitney测试。95%的信心值是使用。所有使用GraphPad Prism 5.01分析软件(GraphPad软件,Inc .)、美国)。

 3所示。结果 3.1。纳米表征

复合物的形成壳聚糖与pGFP评估pDNA的电泳迁移在琼脂糖凝胶壳聚糖的存在。的配合物合成N / P比值的1/4,pDNA乐队模式类似于控制获得的壳聚糖(图 1(一)),这表明pGFP的一部分是免费的,不与壳聚糖进行交互。相比之下,在配合物合成的存在较高的壳聚糖(N / P比值的1/20,1/28,1/40),没有观察到pGFP迁移;这是他们的证据与多糖(图完成交互 1(一))。为了测量效率在复杂地层,我们量化装载效率,占pGFP通过壳聚糖复合体。我们观察到不同的加载效率根据壳聚糖的相对量。相对最低的配合物合成的壳聚糖(N / P比值1/4)能够复杂pDNA可用的70%。然而,较高的加载效率为92%,97%,和93%的人当N / P比值增加到1/20,1/28,1/40,分别(图 1 (b))。

NP描述和评估。(一)复杂的整体评估在不同的比率与壳聚糖pGFP pDNA的电泳迁移在琼脂糖凝胶壳聚糖的存在。DNA梯(L)巷1所示,赤裸裸的向量(NV)用作-控制巷2,和不同的N / P复合物车道3 - 6所示。(b)中描述复杂的形成效率是评价材料和方法,它对应于不溶性pDNA总pDNA,表示为 平均 + / − 标准 错误 。代表等物理参数的直方图(c)的大小和(d)为N / P 4电动电势,20日,28岁和40所示红色,绿色,蓝色,黑色,分别。(e) NP形态是由原子力显微镜N / P 20、28天的评分。(f)裸向量的影响(NV)和NP(从4 - 40 N / P)对细胞生存能力评估通过MTT检测24日,48和120 h挑战和归一化后对未经处理的细胞(控制)。(g)转染效率是评价利用绿色荧光蛋白作为记者和NPs Lipofectamine通过流式细胞术和评估。至少三个独立的实验。酒吧对应 平均 + / − 标准 错误 和统计分析使用Mann-Whitney测试( ∗ p < 0.05 )。

一旦确认该复合物的形成,物理参数,如大小、表面电荷(由电动电势),和形态进行了分析。我们观察到在配合物合成单分散的直径N / P比值的1/4,证明的存在一个峰值为32.7 nm的分布曲线。类似的行为观察复合物在1/20和1/28 N / P比值,峰值为68.1 nm直径和复合物的N / P比值与峰值为78.8 nm(图1/40 1 (c))。这证据支持所有的壳聚糖/ pGFP复合物的直径是100纳米以下,符合纳米粒子(NP)的标准分类。

NPs是评估的表面电荷测量电动电势。N / P比值的1/4,NPs显示monodispersion峰值-1.22 mV,在N / P比值的1/28和1/40,两个峰出现(N / P比值的1/28:2.08和31.8 mV;N / P比值1/40:-2.81和23.2 mV),表明异构NP人口。相比之下,N / P比值1/20的纳米颗粒也表现出均匀分布在一个积极的峰值接近7.15 mV(图 1 (d))。积极的泽塔潜在价值表明,NPs有积极的表面电荷。该特性增加其溶解度在水介质和促进与细胞膜的相互作用。

NP的物理特性的最后一步是通过原子力显微镜形态学的决心。NPs合成的N / P比值1/20显示均匀球形形态类型。然而,增加壳聚糖的N / P比值1/28了球形纳米粒子和免费的壳聚糖纤维(图 1 (e)),证明过多的壳聚糖。

确定可能的细胞毒性效应的纳米颗粒在培养细胞,细胞代谢活动评估在24日,48和120小时后治疗肿瘤细胞B16转椅。所有的评估条件显示显著差异与纳米粒子的细胞治疗的可行性与未经处理的对照组相比(图 1 (f))。这些结果说明的测试剂量范围chitosan-pGFP纳米颗粒对培养B16转椅细胞是没有毒的。

最后,NPs的功能是测量B16转椅细胞中转染能力评估,量化GFP-positive细胞(GFP的百分比+通过流式细胞术)。所有的NPs评估显示,超过40%的GFP+细胞,在所有情况下都显著高于控制nontransfected细胞。有趣的是,1/4的N / P比值显示显著更高的效率比细胞转染Lipofectamine(18%)(图 1 (g))。

 3.2。ISAV-F蛋白的表达在细胞B16转椅

我们的主要目标是确认ISAV fusogenic活动之前描述的哺乳动物细胞(Morales et al ., 2017)在这种情况下,壳聚糖纳米粒作为低毒性和高效的转染方法( 20.]。基于我们的NP表征结果,壳聚糖/ pIRES-ISAV复合物合成N / P比值的1/20,在材料和方法描述。在这种情况下,我们观察到的延迟电泳迁移pIRES-ISAV向量,与壳聚糖(图指示成功的络合交互 2(一个))。这些复合物表明纳米颗粒平均直径接近100海里(图 2 (b))和一个正的表面电荷泽塔潜在价值为5.57 mV(图 2 (c))。相对应的预期扩增子ISAV记录检测48小时posttransfection使用NP-ISAV(壳聚糖/ pIRES-ISAV纳米粒子)在细胞B16转椅。同样是观察到当我们使用Lipofectamine (Lipo-ISAV),但不是在nontransfected细胞(图 2 (d))。总之,这些结果表明使用NP-ISAV转染方法允许的表达在细胞培养B16转椅ISAV-F成绩单。

NP-ISAV特征和效果。(一)复杂的整体评估壳聚糖和pIRES-ISAV向量之间在琼脂糖凝胶电泳迁移。DNA梯(L)巷1所示,裸体向量巷2,复合物巷3。代表直方图等物理参数的大小(b)和(c)电动电势。(d) ISAV融合蛋白的表达(上半部分)和家政GAPDH(下图)是由rt - pcr posttransfection 48小时。代表凝胶显示DNA梯(L,巷1),PCR空白控制(空白,莱茵2),亲代细胞nontransfected (n /将左巷3)Lipofectamine-ISAV细胞转染(Lipo-ISAV巷4)和NP-ISAV细胞转染(NP-ISAV,莱茵4)。(e)的fusogenic活动ISAV-F蛋白质是由评估存在的合胞体48 h posttransfection比较B16转椅亲代细胞(上半部分),Lipo-ISAV转染B16转椅细胞(中间面板),和NP-ISAV转染B16转椅细胞(下图)。细胞与DAPI染色(左列)和CellMask(中间列)。合并的颜色显示在右列,一个白色箭头表示合胞体。数量(f)的合胞体应量化B16转椅,B16转椅Lipo-ISAV,和B16转椅NP-ISAV和对应的平均5字段,3个独立的实验。(g)的影响转染对细胞生存能力评估在24、48、120 h posttransfection和规范化对nontransfected细胞; data from Lipofectamine (Lipo-ISAV) and nanoparticle (NP-ISAV) transfected cells were graphed as 平均 + / − 标准 错误 。统计分析使用Mann-Whitney测试( ∗ p < 0.05 )。

ISAV-F fusogenic活动的蛋白质是由评估存在的合胞体48 h posttransfection B16转椅细胞。在这个时候,我们观察到大型多核细胞,成功的合胞体形成的一个明显信号NP-ISAV转染细胞。这种现象也观察到Lipo-ISAV转染细胞,但不是在nontransfected细胞(图 2 (e))。合胞体数据量化在B16转椅,B16转椅Lipo-ISAV,和B16转椅NP-ISAV中描述的材料和方法。不管转染方法,ISAV诱导更高数量的合胞体在所有测试条件(图 2 (f))。在NP-ISAV转染细胞,观察的合胞体就会降低20%是在细胞B16转椅48和120小时posttransfection(图之间的可行性 2 (g))。总之,这些结果表明,B16转椅肿瘤细胞的转染NP-ISAV允许fusogenically活跃ISAV-F蛋白的表达,减少细胞生存能力与合胞体形成。

 3.3。影响黑色素瘤NP-ISAV Intratumor治疗

我们之前报道,产生特定类型的细胞B16转椅细胞表达ISAV-F诱导抗原表达 在体外,但不产生免疫小鼠黑色素瘤的抗肿瘤反应( 21]。基于这一发现,我们的目标是确定 在活的有机体内影响肿瘤生长的治疗小鼠黑色素瘤B16转椅intratumor NP-ISAV(信息技术)注射。老鼠被质疑B16转椅细胞显示检测到肿瘤天9至17 postchallenge(图 3(一个))。NPs时注入it肿瘤达到2毫米3肿瘤的体积,每天监测,直到达到最大体积(MTV)的260毫米3。对待动物的肿瘤生长与控制同行(不处理)。我们观察到NP-ISAV治疗诱导的肿瘤生长延迟三个老鼠和一个完整的回归肿瘤的老鼠(图 3 (b))。CH治疗诱导推迟两只老鼠在一个鼠标和完整的回归。然而,没有观察到显著差异在壳聚糖治疗组,对NP-ISAV-treated组。

NP-ISAV治疗对肿瘤生长的影响。(一)治疗图。小鼠皮下注射(南) 2 × 10 5 在鼠标腰椎地区活细胞。当肿瘤达到2.0毫米3、老鼠收到,或没有(对照组)、壳聚糖或NP-ISAV intratumor治疗和日常监控,直到端点标准。(b)肿瘤生长参与组之间的比较(控制,打开圈),chitosan-treated集团(CH、灰色圆圈),和NP-ISAV-treated组(NP-ISAV,黑色圆圈)。代表直方图从肿瘤浸润T (c) CD8 +(下图)和CD4 +细胞(上图)中所示的未经处理的小鼠(控制)、壳聚糖治疗(CH),或壳聚糖ISAV纳米颗粒(NP-ISAV)。(d)的摘要显示至少5个独立的实验。酒吧对应 平均 + / − 标准 错误 。个人实验是画;统计分析使用Mann-Whitney测试( ∗ p < 0.05 )。

一个可能的解释为我们观察肿瘤生长延迟可能与肿瘤免疫反应的诱导,结果表明在免疫小鼠死B16转椅细胞表达ISAV-F [ 21]。我们没有观察到显著变化在CD4 +和CD8 +浸润淋巴细胞数量在肿瘤(图 3 (c)),在脾脏(图 4)。同样,没有检测到变化在脾脏CD4 +表达Tbet ROR γt, Foxp3在应对NP-ISAV治疗,只有显著增加脾Tbet +细胞在壳聚糖治疗后观察(图 5)。总之,我们的研究结果表明,intratumor NP-ISAV治疗诱发肿瘤显著延迟,可能与细胞融合归纳。

治疗效果与NP-ISAV脾T细胞。代表脾T的直方图(a) CD8 + CD4 +细胞和T (b)所示的未经处理的小鼠(控制)、壳聚糖治疗(CH)和壳聚糖ISAV纳米颗粒(NP-ISAV)。(c)的摘要显示至少5个独立的实验。酒吧对应 平均 + / − 标准 错误 ;个人实验是画;统计分析使用Mann-Whitney测试( ∗ p < 0.05 )。

治疗效果与NP-ISAV脾T CD4 +亚种群。脾(a) CD4 + Tbet +, CD4 + ROR (b) γt +, CD4 + FoxP (c)3+亚种群确定材料和所述方法未经处理的小鼠(控制)、壳聚糖治疗(CH)和壳聚糖ISAV纳米颗粒(NP-ISAV)。左右对应代表直方图和对应于一个总结至少5独立的实验。酒吧对应 平均 + / − 标准 错误 ;个人实验是画;统计分析使用Mann-Whitney测试( ∗ p < 0.05 )。

 4所示。讨论

我们确定,瘤内治疗的小鼠黑色素瘤B16转椅ISAV融合蛋白gene-containing壳聚糖纳米粒子延迟肿瘤生长和诱导肿瘤在一种情况下的完整回归。这项工作是我们的知识的第二个报告fusogenic ISAV-F蛋白在哺乳动物细胞的活动。第一个工作是由我们组发表( 21),让我们提出一个改善抗肿瘤功效通过壳聚糖nanoparticle-based细胞内的病毒融合蛋白基因。

根据证据,与病毒融合蛋白相关的抗肿瘤效应是基于这些蛋白质的破坏性的功能和免疫系统的作用。尽管ISAV-F-mediated效果可以从几个方面来解释,我们认为直接细胞病变效应是其瘤内效果的关键,因为GALV和HERV-W融合蛋白的表达在人类肺癌肿瘤( 12]。在这个癌症模型系统中,一个高度的fusogenic变体GALV-F蛋白诱发不稳定的形成合胞体的短半衰期,从而增加细胞毒性( 10, 12),抑制肿瘤的生长 在活的有机体内( 12, 16]。大多数研究的病毒融合蛋白的抗肿瘤效果的作用主要是基于高度的fusogenic变体GLAV-F蛋白质,是信封的一部分的长臂猿猿白血病病毒,负责调解之间病毒膜融合和目标细胞膜。的表达GALV-F H322和人类肺癌A549细胞产生细胞生存能力下降55.5%和78.9%天4和5 posttransfection,分别为( 12]。这种细胞毒性效应是由于多核的形成或合胞体细胞来源于细胞融合由GALV-F。这些合胞体最初是可行的和保持活跃新陈代谢和转录( 10]。然而,他们最终失去依从性和死亡,细胞死亡的一种,尚未完全特征。实际上,凋亡[ 22和nonapoptotic细胞死亡 11在最近的报告记录。即使我们没有观察到积极的合胞体的形成 在体外ISAV-F表达式后,细胞毒性效应无疑是礼物。因此,我们不能排除这种可能的作用方式 在活的有机体内。

此外,syncytia-associated细胞死亡对应于一个高度免疫原性的细胞死亡类型,特点是几个细胞外囊泡的释放名叫syncytoms,含有肿瘤抗原( 11]。这些syncytoms已被证明是一种有效的抗原来源抗原递呈细胞的成熟和激活。这些细胞细胞毒性t淋巴细胞激活淋巴细胞,这可能导致的抗肿瘤免疫反应 在活的有机体内( 14, 23- - - - - - 25]。因此,我们假设死B16转椅黑色素瘤细胞表达ISAV-F,营养不足引起的,是一种有效的抗原诱发DC成熟和抗原crosspresentation来源 在体外。此外,预防接种小鼠CBs-B16-ISAV诱发的肿瘤生长延迟黑色素瘤B16转椅与增加脾脏CD4 +和CD8 + T淋巴细胞数量 21]。虽然在此工作,NP-ISAV治疗并没有引起显著分析淋巴细胞数量的变化,这些变化我们测量的时间点可以解释这些结果,尽可能治疗引发的变化对T细胞的数量可能已经克服当时我们测量(MTV实现时) 26, 27]。可能确实是缺乏变化反映了抗肿瘤免疫反应在后期阶段,其行动就会被克服肿瘤细胞导致肿瘤的生长。同时,不同的细胞类型可能发挥作用在这种类型的响应,如自然杀伤(NK)细胞 28]。

壳聚糖已经评估了1980年代以来的抗肿瘤活性。口服oligoderivatives的壳聚糖与实体肿瘤小鼠肉瘤180 ( 29日),通过静脉注射的小鼠Meth-A肿瘤( 30.诱导肿瘤生长抑制,增加水平的il - 1和- 2,以及细胞毒性T淋巴细胞的分化,对于Meth-A。从那时起,许多报告已经出版的使用壳聚糖作为小分子的车辆对不同形式的癌症通过口服,胃内的,静脉注射和腹腔内管理 31日, 32]。同时,腹腔内用壳聚糖治疗引发小鼠黑色素瘤B16转椅的抗肿瘤免疫反应模型通过树突状细胞的作用导致干扰素的激活和行动 γ分泌NK淋巴细胞( 28]。这些结果表明壳聚糖和免疫系统之间的联系可能激活对干扰素的生产 γ。 在体外分析表明,壳聚糖激活树突状细胞( 28, 33和巨噬细胞 34, 35),触发释放il - 1 β和il - 12,至关重要的细胞因子对CD4 +淋巴细胞极化效应Th1细胞干扰素水平上升 γ(一种强有力的抗肿瘤细胞因子) 36]。在这个工作中,肿瘤生长延迟,完成治疗后小鼠的肿瘤回归与天然高分子壳聚糖会支持这个想法,这引发一个抗肿瘤细胞反应,可能由Th1 (Tbet +)淋巴细胞。

 5。结论

总之,壳聚糖纳米粒子允许fusogenically活跃ISAV融合蛋白的表达,进而诱发细胞融合在黑色素瘤B16转椅细胞和细胞毒性 在体外。然而,它用于治疗黑色素瘤肿瘤引起的轻微 在活的有机体内antitumoral效应相比,壳聚糖治疗。我们认为,进一步的工作是必要的,但ISAV-F可能是一个不错的选择/互补剂治疗肿瘤的增长速度缓慢。

 数据可用性

所有的数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

我们要感谢洋底Nacional de Desarrollo Cientifico y学府(1161015号,11140731,11140915,1180666),项目Equipamiento Cientifico y学府(EQM150069和EQM190024), Direccion de Investigacion Cientifica y Tecnologica(021943号ac、021801 lr和021801 mb), Comision Nacional de Investigacion Cientifica y Tecnologica(21171377号),和Fondap (15130011)。

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