再评价tnf诱导的休克中的肺损伤:酸性鞘磷脂酶的作用

摘要

肿瘤坏死因子(TNF)是众所周知的败血症介质。在许多情况下，败血症会导致多个器官损伤，包括伴有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的肺。20多年的研究表明，TNF可能直接导致败血症期间的器官损伤。然而，这些旧的研究是不确定的，因为他们依赖于人而不是同族的TNF，在大多数研究中被内毒素污染。在这项研究中，我们描述了静脉注射无内毒素TNF对小鼠心血管功能和器官损伤的直接影响，特别是肺损伤。由于酸性鞘磷脂酶与脓毒症、ARDS和caspase非依赖性细胞死亡相关，我们还纳入了酸性鞘磷脂酶缺陷(ASM)^-/-)老鼠，ASM^-/-和野生型（wt）小鼠收到50 μg无内毒素小鼠TNF单独静脉注射或与泛半胱氨酸酶抑制剂carbobenzoxy-valyl-alanyl-天冬氨酸-[o -甲基]-氟甲基酮(zVAD)联合使用，并以低潮气量通气，同时观察肺力学。在应用TNF 6小时后，通过动脉内液体支持稳定血压，体温保持在37°C，以延缓致命休克，并对血气、肺组织病理学、促炎介质和微血管通透性进行调查。除肺外，还检查了肾脏和肝脏。TNF诱导炎症介质释放和高死亡率，但在6小时内对健康小鼠的肺、肾或肝脏没有明显损伤。WT小鼠的死亡率最可能是由于败血症样休克，如代谢性酸中毒、高降钙素原水平和心血管衰竭。ASM^-/-小鼠对tnf诱导的低血压和反射性心动过速有保护作用，对死亡率也有保护作用。在WT小鼠中，静脉注射外源性TNF不会导致器官损伤，但会诱导伴随心血管衰竭的全身炎症反应，ASM在其中发挥作用。

1.介绍

尽管进行了大量的实验和临床研究，但急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、危及生命的呼吸衰竭以及经常导致的多器官衰竭（MOF）的确切炎症机制仍不清楚。细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）一般认为在脓毒症和ARDS的发病机制中起着关键作用[1，2]，通常由败血症引起[3.，4]．这一观点是基于(i)早期实验和临床研究，这些研究表明，向实验动物输注人TNF可引起感染性休克症状，包括发热、心血管损伤和肺、肾、肝等器官衰竭[5- - - - - -8];(ii) ARDS患者支气管肺分泌物中TNF水平升高[9，这些都与不良结果相关[10];(iii)在脓毒症临床试验中接受抗tnf治疗的患者生存率提高[11]．然而，尽管TNF得到了极大的关注，令人惊讶的是，对于循环TNF对肺和其他器官的直接影响知之甚少。在超过20年的研究中，检测了人类TNF对肺的影响体内，微血管通透性增加，并发肺水肿和急性肺损伤[7，12- - - - - -14]．这些早期发现尚未被同意的TNF证实的事实以及鼠内毒素无碱的可用性导致我们重新评估静脉内（I.V.）在小鼠中注射TNF的作用。

酸性鞘磷脂酶(ASM)是脓毒症和ARDS发病的另一个重要中介[15]．脓毒症患者表现出分泌性ASM活性水平升高，ASM血清活性被证明是脓毒症死亡率的有用预测指标[16，17]．在内毒素血症和肺内急性呼吸窘迫综合征模型中，ASM的药理学阻断和ASM缺乏保护血管屏障破坏[18- - - - - -20.]由于脓毒症休克，也降低了死亡率[16，18]．提出了几个机制，其中肺水肿的促进与ASM有关[21]，特别是TNF存在时[22].TNF激活ASM是公认的[18，23，24，这是纳入ASM缺陷(ASM^-/-)，本研究希望保护小鼠免受肿瘤坏死因子诱导的损伤。

除了其在免疫反应中的关键作用外，TNF还可诱导半胱天冬酶依赖性和非半胱天冬酶依赖性细胞死亡。有趣的是，在小鼠中，用羧基戊酰丙氨酰天冬氨酰-[O-甲基]-氟甲基酮（zVAD）抑制泛半胱天冬酶可加重TNF的毒性，导致超急性休克，死亡率和肾功能衰竭增加[25，26]．在目前的研究中，我们旨在进一步研究使用zVAD时TNF不依赖caspase的作用。我们推测这会加重肿瘤坏死因子的毒性，导致器官衰竭。

当前研究的目的是使用高剂量高纯度同种TNF来研究TNF对器官损伤和心血管功能的直接影响，特别是对肺的影响。为了延缓致死性休克并获得临床相关结果，小鼠被通气在“小鼠重症监护病房”(MICU)，便于监测和稳定体温和血压数小时[27，28]．通过液体支持延迟低血容量休克的目的是为器官衰竭的发展争取时间。

根据我们的假设，TNF引起包括致命心血管衰竭在内的全身炎症反应，而这在ASM中是不存在的^-/-老鼠。然而，令人惊讶的是，尽管tnf在产生休克方面非常有效，但在野生型小鼠中却没有引起显著的肺、肾或肝损伤。

2.方法

2.1.小鼠

实验对象为C57BL/6x129/SvEv野生型(WT)和ASM缺陷型(ASM)^-/-) 8至10周龄、体重25至30克的小鼠。实验方案符合德国动物保护法，并获得地方政府部门批准(Landesamt für nature, Umwelt und Verbraucherschutz NRW，许可号AZ 8.87-50.10.37.09.287)。

2．2．外科手术和机械通气

用戊巴比妥钠(75 mg/kg)和芬太尼(40μG /kg)及低潮气量通风( ）描述(27]肺功能随后是低频强迫振荡技术（flexiVent，SCIREQ，Montreal，Canada） 最小通气量，达到基线值，100 μL氯化钠静脉注射稳定心血管功能。15分钟后，老鼠又接受了50只μG无内毒素(<0.1 ng/μ欧盟/ g, < 1μg） 小鼠肿瘤坏死因子（PeproTech，美国洛基山）100例 μL NaCl处理，通气6 h。此外，将caspase抑制剂zVAD (Bachem AG, Bubendorf, Switzerland)以125 mg/mL的浓度悬浮在DMSO中，再用0.9% NaCl稀释至2.5 mg/mL。基于Cauwels等人的研究[25]，zVAD静脉注射两次：250 μ30岁以后 100分钟内的最小通风量 μ0.9% NaCl和100μ用1mg牛血清白蛋白(BSA)灌胃140 min后再灌胃60 minμL总积(实验设计见补充图。1).对以下各组进行了调查：TNF单独组（ASM）^-/-+肿瘤坏死因子( ）和WT +肿瘤坏死因子( ）)TNF和zVAD (ASM)^-/-+ zVAD /肿瘤坏死因子( ）和WT + zVAD /肿瘤坏死因子( ）)；对照组通气405 min，分别给予生理盐水或生理盐水+DMSO替代TNF或zVAD (ASM^-/-虚假的( ）及sham ( ）)．导管插入颈动脉，测量平均动脉压(MAP)和液体支持。为稳定血压，0.9% NaCl (200μL/h)动脉内灌注，体温稳定在37℃(恒温毯，Harvard Apparatus Holliston, MA, USA)。根据心电图(PowerLab, ADInstruments, Spenbach, Germany)计算心频(HF)。小鼠经动脉放血处死。血液样本通过血气分析(ABL700, Radiometer, Copenhagen, Denmark)进行分析。肺解剖，灌洗，按所述处理[27]．

２．３．酶联免疫吸附测定

用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量测定血浆和BAL液中的促炎介质、BSA和降钙素原(PCT)(介质:R&D Systems, Abingdon, UK;BSA: Cygnus Technologies, Southport, USA;PCT: Uscn，武汉，中国)。计算血浆和BAL液中BSA的比值，测定微血管通透性。通过ELISA定量单核和寡核苷酸体评估细胞死亡(罗氏应用科学，曼海姆，德国)。根据制造商的说明，用30 mg均质冷冻肺组织进行检测。裂解缓冲液作为空白，从结果中减去。细胞死亡比率计算为%每mg肺组织相对于100%阳性对照提供的本试验。

2.4.组织病理学分析

左肺用4%缓冲甲醛填充。肺、肾和部分肝正中叶用4%缓冲甲醛固定，并用石蜡包埋。肺和肝切成3个切片 μ然后苏木精-伊红（HE）染色。对于肺，使用实验性肺损伤评分系统[29]．每只肺按以下标准评价10个野:A:肺泡间隙中性粒细胞，B:间质间隙中性粒细胞，C:透明膜，D:肺泡间隙蛋白碎片，E:肺泡间隔增厚。积分计算方法如下: ．肾脏在1μm，用周期酸-希夫(PAS)染色，苏木精反染色。肾小管损伤的评分为0-4分:0 =正常组织学,1 =轻度扩张,2 =扁平上皮细胞刷状缘和损失,3 =轻微空泡形成的管状细胞质(< 5液泡/小管)和管状细胞坏死或凋亡,4 =强烈的管状细胞质液泡化(> 5液泡/小管)和管状细胞坏死和细胞凋亡。总分是所有管状评分的计算平均值。每段共评估了100个细管。以盲法评估组织病理学。

2．5．TUNEL染色

TUNEL染色(罗氏)按照生产商说明书进行1μM石蜡肾切片。TUNEL染色定量:在原始放大倍数×100下，随机选取20个视野，对肾皮质阳性核进行计数。

2.6。免疫印迹分析

变性尿液样品在10% SDS-PA凝胶中进行电泳，转移到硝基纤维膜上，在Tween tris缓冲盐水(TTBS)缓冲液中用2% BSA阻断，用TTBS洗涤，并与兔多克隆抗肾损伤分子- (KIM-) 1抗体(Acris, San Diego, Acris)孵育。(美国)在4°C过夜稀释至1:10 00 TTBS。使用酶标山羊抗兔IgG (Dako, Hamburg, Germany)抗体检测KIM-1抗体，并通过增强化学发光显示。

2.7。一氧化氮量化

采用一氧化氮(NO)定量分析(R&D Systems, Abingdon, UK)测定血浆样本中的总NO。为此，内源硝酸盐通过硝酸还原酶转化为亚硝酸盐。在550 nm处，总亚硝酸盐被定量为Griess试剂的偶氮色度衍生物。

2.8。统计分析

采用混合模型法对时间过程进行分析。采用巴特利特检验检验方差是否相等。当合适时，进行Box-Cox变换以实现同方差。采用夏皮罗-威尔克检验验证残差的正态分布。对单变量数据进行单因素方差分析，然后进行方差分析 -测试和FDR修正或Tukey后测试。百分比数据在分析前使用反正弦变换进行转换。非参数数据，除生存曲线外，采用Kruskal-Wallis检验和Dunn后验进行分析。生存曲线与Kaplan-Meier估计值进行比较。在本分析中，TNF组和zVAD/TNF组在生存率上没有差异，将每个基因型合并，结果为 ．相关性用皮尔逊相关系数进行评估。采用GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, USA)或SAS 9.4软件(SAS Institute, Cary, USA)进行统计学分析。一个值< 0.05被认为是显著的。数据如下所示 与 ASM组^-/-虚假的, 在所有其他组中。在所有的实验中，后测是通过比较相同处理的不同基因型组以及相同基因型的所有组彼此进行的。

3.结果

３．１．生存

尽管采用了机械通气，体温仍稳定在37°C，血管内容量维持在1500左右 μ在405 min以上(见补充图)。1在实验设计中)，4只WT小鼠在TNF作用下死亡，而所有ASM小鼠死亡^-/-小鼠存活(图1）.因此，ASM的基因缺失对tnf诱导的死亡具有显著的保护作用。接下来，我们分析了tnf诱导的WT小鼠死亡率是否可以用器官衰竭来解释。

３．２．TNF对肺的影响

肺输入阻抗测量显示TNF没有改变肺力学。各组肺组织弹性(H)均处于生理正常范围(图)2(一个)）.由于未知原因，H基线值在WT sham中略高于ASM^-/-虚假的老鼠( )，但TNF或TNF+zVAD没有显著增加弹性。组织阻尼(G)(图2 (b))和气道阻力(R_{亚历山大-伍尔兹})(图2 (c))所有组均保持不变，也处于正常范围，进一步表明高全身TNF水平对肺没有损伤作用。肺组织ASM活性的生化评估证实ASM^-/-小鼠无功能性ASM(补充图。2）.

pO₂/ FiO₂比约500 mmHg (66.7 kPa)和平均pCO₂大约38岁 毫米汞柱（5.1毫米汞柱） kPa）表明所有实验组的气体交换均未受影响，并进一步证明TNF不会损害肺（表1）1）.

血浆中TNF定量，以检查静脉注射TNF在循环中的分布。在所有TNF处理过的小鼠中检测到约1000 ng/mL的高TNF浓度(图)3.(a))。值得注意的是，BAL液中也含有高水平的TNF(图)3.(e))，显示经静脉注射的TNF已进入肺。在对照组中，ASM^-/-血浆和BAL TNF水平均接近检测限。

与对照组相比，所有组的IL-6和MIP-2的血浆浓度均被TNF显著升高(图)3.(b)和3.(c))，而IP-10 (CXCL10)的释放仅在WT小鼠的血液中明显增加(图3.(d))。在BAL中，IL-6水平(图3.(f)) TNF仅中度升高，与血浆值相比，ASM中浓度较高^-/-比野生型小鼠更明显。TNF仅在ASM中增加MIP-2 (CXCL2) BAL水平^-/-老鼠(图3.(g))。IP-10 BAL浓度在所有组中都同样低(图3.（h） ）。zVAD不影响分析介质的释放。有趣的是，在所有TNF治疗组中，血浆中的MIP-2和IP-10浓度均高于BAL，表明TNF诱导的趋化梯度指向血管侧。

而中性粒细胞趋化因子MIP-2在ASM BAL中明显升高^-/-与野生型小鼠相比，在应用TNF后未观察到血管外迁移。因此，肺泡内中性粒细胞的定量显示，这些中性粒细胞不是因TNF或TNF+zVAD而募集的（图4(一)）.相反，ASM肺中中性粒细胞数量相对较高^-/-小鼠在注射TNF后明显减少。与此相一致的是，微血管通透性(测量为白蛋白流入肺泡)在ASM假组中高于野生型小鼠，而在tnf处理的ASM中降低^-/-老鼠(图4 (b)）.

组织病理学检查进一步证明TNF对WT的肺没有显着影响（图5(b)和5(c))和ASM^-/-老鼠(图5(e)和5（f） ），尽管所有TNF治疗组的损伤评分都增加了10%左右。这种增加是由于TNF使间质中性粒细胞数量（用红色箭头表示）略有增加，但除此之外，没有观察到重大改变。在ASM中^-/-小鼠，肺泡阻塞，泡沫状巨噬细胞充满胞浆脂质包体(黑色箭头)，这增加了ASM损伤评分^-/-假小鼠与野生型小鼠相比差异不显著(图5(g))提示神经鞘脂质增多症的发生。

为了评估TNF是否对肺中的细胞死亡有影响，我们对肺组织中的单核和寡核体进行了量化。有趣的是，在WT小鼠中，高水平的肺TNF对肺细胞死亡没有显著影响(图)5(h))。因此，TNF联合泛半胱天冬酶抑制剂zVAD对小鼠的肺也没有损伤作用。此外,在ASM^-/-在小鼠中，TNF仅轻微增加细胞相对死亡，而在所有ASM中明显升高^-/-此外，我们还进行了抗切割半胱天冬酶-3免疫染色，证实ASM导致的肺细胞持续死亡^-/-小鼠，即使没有TNF处理，而WT组完全阴性(补充图。3.）.

３．３．TNF对肾、肝的影响

pas染色的肾脏组织病理学显示WT小鼠的肾脏没有重大的病理改变，即使在TNF治疗后(图)6(一)-6(c))。相比之下,ASM^-/-假小鼠表现出明显的肾小管空泡化和肾小球硬化(图6(d))。肾小管损伤评分证实，不仅仅是ASM^-/-与WT小鼠相比，小鼠有更高水平的组织损伤，但它们也容易受到TNF的损伤(图)6(g) -6（i） 在ASM组小鼠的尿液中检测到肾损伤分子（KIM-）1蛋白，该蛋白是肾小管损伤的指标^-/-+TNF，在WT小鼠中未发现。数字6(j)显示了典型的western blot，每组3只小鼠的尿液。肾切片TUNEL染色未显示细胞死亡(图6(k))。zVAD对肾脏没有影响。

肝组织的组织学评估显示WT假小鼠的肝组织形态正常(图)7（a）），虽然在TNF处理的WT小鼠中出血，并且用红色和白细胞堵塞正弦曲线（在图中用蓝色箭头表示7(b)和7(c))，提示瘀血。所有ASM患者肝脏均无出血及血窦阻塞^-/-小鼠(用黑色箭头表示的开放正弦波)(图7(d) -7(f))。ASM的肝细胞^-/-小鼠通常表现为形态改变，颗粒状的细胞质，突出的细胞膜，细胞内脂质包涵体，具有尼曼-匹克病的特征。示例细胞由图中的绿色箭头表示7（d），其中大多数肝细胞在这方面都很明显。分析血浆的肝损伤标志物天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT），其中TNF增加到轻微和生理上不相关的程度（图7（g） 及7(h))。在所有小鼠中，胆红素水平约为0.5mg / dl，因此在健康动物的范围内（未显示）。同样，ZVAD对器官损伤没有显着影响。

3．4．TNF对全身的影响

血气分析显示，所有tnf处理的小鼠均出现严重的代谢性酸中毒 (表1)，提示TNF已引起败血症样症状。这进一步得到了定量降钙素原(PCT)的支持，PCT是脓毒症和无菌炎症的标志，显示PCT水平高于2000 ng/L(图)8）.与sham对照组相比，WT+TNF组的血红蛋白升高，TNF处理的WT小鼠的血红蛋白高于TNF处理的ASM小鼠(见表2)1）.zad没有全身性的影响，在这幅图和下面的图中都没有显示。

由于戊巴比妥麻醉，平均动脉压(MAP)普遍较低，但在对照组保持恒定(图)9(a))。相比之下，在tnf处理的WT小鼠中，它随着时间的推移而下降，直到最终在存活小鼠中达到<40 mmHg和在未存活小鼠中达到<30 mmHg的极低值。血压下降伴随着心频(HF)的持续增加(图)9(b))。有趣的是,ASM^-/-小鼠似乎对tnf诱导的低血压有保护作用。该集团ASM^-/-+TNF没有显示MAP的下降，只有HF的初始中度增加。

在本研究中，我们在血浆中定量NO，以检测WT小鼠的难治性低血压和生存受损是否与通过ASM激活eNOS导致的血管扩张有关。WT假小鼠NO水平明显高于ASM^-/-而NO水平在TNF处理后明显升高，而在TNF处理后的ASM之间无明显差异^-/-和WT小鼠（图10）.

总之，TNF引起全身炎症反应，包括心血管衰竭，只有40%的WT小鼠死亡，而ASM则相反^-/-小鼠免受TNF诱导的低血压。

4.讨论

本研究旨在重新评估高剂量同质无内毒素TNF对肺和心血管功能的影响，并调查其中caspase依赖和caspase不依赖的ASM贡献。这项研究有两个主要发现。首先，TNF单独不足以引起肺、肾或肝损伤。其次，我们描述了ASM在全身炎症反应引起的低血压中一个重要的和以前未被认识的作用。

4．1.TNF对肺的影响

TNF处理的WT小鼠的死亡率表明，高剂量的TNF在之前的其他研究中是致命的[18，25，30.]，是有效的（图1）.尽管如此，并未发生肺损伤(图)2和表1)这一令人惊讶的发现引发了一个问题，即注射的TNF是否真的进入了肺，这一问题通过BAL中TNF的定量得到了证实（图1）3.）.血浆中IL-6、MIP-2和IP-10的水平反映了TNF的分布，这在血浆中明显高于BAL中，表明在两个小鼠品系中，注射TNF使趋化梯度朝着血管侧。肺泡内中性粒细胞计数支持了这一假设(图)4(一))的范围可以被认为是正常的通风小鼠[27]，并没有增加，而是减少了TNF，这表明中性粒细胞可能被抑制在循环中，而不是隔离在肺中。

ASM^-/-小鼠肺泡内中性粒细胞数量高于同等处理的WT小鼠，ASM中中性粒细胞数量最高^-/-虚假的组。因此，这组患者表现出肺泡-毛细血管屏障破坏的迹象。因为中性粒细胞隔离不是ASM的常见特征^-/-一般老鼠[31[可能已经通过机械通气诱导了大量的嗜中性粒细胞。值得注意的是，TNF治疗确实在ASM的肺部导致一些保护^-/-老鼠。事实上，微血管通透性反映了中性粒细胞隔离，表明TNF不会引起中性粒细胞非依赖性水肿（图1）4 (b)）.这与先前研究中发现tnf诱导的水肿是中性粒细胞依赖的结果一致[32- - - - - -34]．由此可见，TNF在离体无血灌注的大鼠或兔肺中没有引起水肿[35]，静脉注射TNF甚至可以防止水肿的形成[36]．相反，在直接给呼吸系统注射TNF的模型中，它会触发中性粒细胞募集和水肿形成[37，38]．此外，在一项17例患者的小型研究中，TNF用于离体肢体灌注，3例患者继发肺水肿而出现呼吸衰竭[39]但必须考虑的是，这项试验是在癌症患者中进行的。TNF诱导ASM中性粒细胞和微血管通透性降低^-/-小鼠表明这些肺是预损伤的，进一步支持TNF将趋化梯度指向血管侧。值得注意的是TNF并没有增加血管通透性。综上所述，这些结果强烈表明TNF对肺血管通透性没有直接影响。

此外，肺的组织病理学评估(图5)证实了高浓度的循环TNF除间质中性粒细胞数量增加外，并未引起病理改变，这在较早的研究中也有报道[40]组织病理学进一步显示，尽管小鼠年龄很小（8-10周），但脂质储存疾病会形成泡沫细胞，典型的ASM缺乏症[31已经在进行中了。这可能导致BAL趋化因子水平升高，也很可能解释了ASM中更大程度的细胞死亡^-/-老鼠(图5（h） ）。ASM组中存在分裂的半胱天冬酶-3阳性细胞^-/-+zVAD/TNF进一步支持这些细胞在实验前就已经凋亡(补充图。3.）.

本研究中没有肺损伤的一个解释可能是使用了无内毒素的TNF (<0.1 ng/)μ欧盟/ g, < 1μg).在早期的实验研究中，TNF具有损伤作用，存在少量内毒素[7，13，14]．众所周知，TNF和内毒素具有协同作用，即使是少量的内毒素也会增加TNF的毒性[41，42]．不幸的是，这些研究并没有对肺力学或氧合进行测量，因此肺功能究竟受到了多大程度的损害仍未可知。相比当前方法的另一个区别是使用小鼠肿瘤坏死因子的早些时候,它与受体小鼠TNF-R1和TNF-R2,因此代表了生理配体在小鼠系统中,而不是以前的人类肿瘤坏死因子,结合选择性小鼠TNF-R1 [25]．TNF-R1促进死亡信号、肺中性粒细胞隔离和水肿形成，而TNF-R2被证明可以预防肺水肿[43]，并减弱tnf介导的炎症反应[44]．因此，TNF-R2可能在一定程度上拮抗了TNF-R1的炎症作用。

4.2.TNF对肾脏和肝脏的影响

因为已知TNF在肾和肝衰竭中发挥作用[5，8，45),肾脏(图6)及肝脏(图)7)还检查了器官损伤。ASM缺乏的典型脂质内含物[31]，表明ASM缺乏本身已经造成了一些器官损伤，这与我们在肺中的发现是一致的。此外，ASM的肾脏^-/-小鼠易受TNF损伤，可能是由于迁移的白细胞释放促炎介质增多，如肺中所示。值得注意的是，TNF在WT小鼠中没有引起急性肾损伤(AKI)(图)6(g) -6（j） ），这是脓毒症的常见并发症[45]．与我们的研究结果一致，之前的研究报道TNF单独使用时，既没有肾小管或肾小球损伤，也没有其他器官损伤[25，26]．这就强调了器官损伤的复杂性，器官损伤需要的不是一种而是一整套的介质，例如，当脂多糖作为刺激物时所释放的介质[46，47]．

最后，WT小鼠肝脏中的血窦阻塞表明这些小鼠遭受了休克[48)(图7(一)-7(c))。有趣的是，ASM患者肝脏微循环血流未见明显的病理改变^-/-小鼠，尽管这些小鼠表现出尼曼-匹克病的早期表现(图)7(d) -7(f))。tnf诱导的低AST和ALT升高以及未改变的低胆红素值(数据未显示)表明肝衰竭不是WT小鼠死亡的原因(图)7（g） 及7(h))。先前的研究显示，几天内注入较低剂量的TNF具有损伤潜力[7，49，我们不能排除肝细胞损伤和衰竭可能在较长一段时间后由于微血管功能障碍而发生[48].在没有对动物进行生命支持措施的研究中，在致命的TNF攻击6小时后，已经发现高ALT水平[40]．这说明了临床相关环境的重要性，这似乎对实验性败血症模型的结果批判性地影响。

4.3.zVAD的影响

在本研究中，一般的caspase抑制剂zVAD对肺、肾或肝脏没有确定的影响，这很可能是由于TNF没有破坏内皮细胞的情况。结果，zVAD仅限于脉管系统。此外，细胞死亡在这里没有发挥相关作用，因此不受zVAD的影响。因此，尽管我们的zVAD是活性的，但使用zVAD并不能进一步描述ASM肺损伤的作用，这在最近的一项癌细胞研究中得到了证明，我们使用了同样批次的zVAD [50]．

4.4。TNF对心血管的影响

尽管TNF未能引起器官损伤，但它在两种小鼠品系中都诱导了败血症样症状。tnf处理小鼠的严重代谢性酸中毒反映了微循环受损(见表)1）.此外，PCT的高水平(图8)，是人类和小鼠败血症的标志[51，支持TNF诱导全身炎症，并表明TNF的病理生理反应与感染引起的反应相似。在两个对照组中，PCT水平均低于检测限，说明PCT的升高并非手术干预或机械通气所致。

TNF作为肿瘤治疗药物的临床应用被发现受到其毒性的限制，反映在器官损伤和低血压[5，8]．难治性低血压和反射性心动过速，可视为全身炎症的表现[52，在本研究中也观察到(图9)，极有可能导致WT小鼠的低灌注死亡(图1）.WT小鼠的肝脏中有集中的血液，ASM小鼠的肝脏中没有集中的血液，这进一步支持了这一观点^-/-WT小鼠的血红蛋白水平较高，表明血浆损失(表1).事实上^-/-在给定的时间框架内，小鼠免于低血压和死亡，这表明ASM在休克发病机制中的一种新作用。这与ASM水平升高与脓毒症患者死亡率相关的发现是一致的[16]．有趣的是,ASM^-/-在早期的研究中，发现小鼠对内毒素诱导的死亡率也有抵抗力，其中TNF-和内毒素诱导休克的机制基本相同[18]．然而，在此背景下，肿瘤坏死因子诱发的休克的心血管影响没有被提及。

ASM可能参与对TNF反应的休克发展的一个机制是神经酰胺激活NO合酶，导致血管扩张和低血容量休克，正如中性鞘磷脂酶和eNOS已经显示的[22，53，54]然而，血浆总NO的测量显示TNF处理的WT和ASM之间没有差异^-/-虽然NO在TNF下明显增加，并且在WT假小鼠中也高于ASM假小鼠(图)10）.必须考虑到NO的定量会受到溶血的影响[55，尤其存在于tnf处理的WT小鼠的血浆样本中。因此，不能完全排除ASM参与NO解放的可能性。ASM介导TNF诱导的低血压的机制以及TNF对心脏可能的直接影响，如心肌炎，在TNF过表达的小鼠中被证明是致命的[56]，需要在将来进行调查。

在目前的研究中，不仅是液体支持，特别是体温的稳定可能影响了结果，因为它防止了低体温(这与小鼠的发热相对应)，并可能防止了tnf处理的小鼠更快地死亡。尽管有这些措施，非常高的TNF剂量(50μg） 与之前两项研究（15-25岁）相比，本研究诱发死亡的速度更快 μ使用g TNF [25，26，因此实验时间范围有限，可能已经限制了器官损伤的发展。

5.结论

我们从我们的数据得出结论，循环TNF单独不足以增加肺血管通透性或导致器官损伤，这可能需要额外的介质。本研究提示，ASM在tnf诱导的低血压的发生发展中发挥重要作用，从而促进死亡率。因此，对ASM的药理抑制作为预防败血性休克致命心血管衰竭的途径应进一步研究。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

两位作者都没有相互竞争的利益需要宣布。

作者的贡献

斯蒂芬·乌利希和迪特尔·亚当是最后的作者。

致谢

我们感谢Anke Kowallik、Andrea Oberhaus和Sabine Mathieu提供的出色技术援助。此外，我们还要感谢杨洋博士在肺组织中ASM的定量方面贡献的专业知识。这项工作得到了德国科学基金会(SFB 877，项目B2, DA)的支持。

补充材料

补充图1：实验设计的图示。补充图2：通过放射性ASM活性测定评估的肺中酸性鞘氨醇髓鞘酶活性。补充图3：肺中切割的caspase-3免疫染色。（补充材料）

参考

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