实验研究与雌性和雄性C57BL / 6 x129 / SvEv野生型(WT)和ASM-deficient (ASM^{- / -})年龄在8到10周,小鼠体重25到30克。实验协议是按照德国动物保护法律和地方政府当局批准(Landesamt皮毛自然界,客观世界和北莱茵-威斯特法伦州Verbraucherschutz许可数量AZ 8.87 50.10.37.09.287)。

小鼠麻醉与戊巴比妥钠腹腔内(75毫克/公斤)和芬太尼(40 μ克/公斤)和通风较低潮汐卷( V T )所描述的 27]。肺功能,紧随其后的是低频强迫振荡技术(flexiVent SCIREQ,加拿大蒙特利尔)。经过30分钟的通风,基线值达到了100人 μL生理盐水注射输液稳定心血管功能。15分钟后,老鼠收到50 μg endotoxin-free (< 0.1 ng / μ欧盟/ g, < 1 μg)小鼠肿瘤坏死因子(美国落基山PeproTech)在100年 μL(生理盐水后6 h的通风。此外,两组治疗与普通半胱天冬酶抑制剂zVAD (Bachem AG)、Bubendorf、瑞士),这是悬浮在DMSO溶液在125毫克/毫升,进一步稀释0.9%氯化钠2.5毫克/毫升。基于研究Cauwels et al。 25),zVAD注射输液两次:250 μ100年g zVAD 30分钟后通风 μL 0.9%的氯化钠和100年 μg zVAD连同1毫克的牛血清白蛋白(BSA)在140年60分钟的通风 μL总量(实验设计,请参阅补充图。 1)。仅以下组调查:TNF (ASM^{- / -}+肿瘤坏死因子( n = 5 )和WT +肿瘤坏死因子( n = 5 ))和肿瘤坏死因子和zVAD (ASM^{- / -}+ zVAD /肿瘤坏死因子( n = 5 )和WT + zVAD /肿瘤坏死因子( n = 5 ));对照组为405分钟通风和接收盐水或生理盐水+ DMSO溶液代替肿瘤坏死因子或zVAD,分别(ASM^{- / -}虚假的( n = 6 )和WT假( n = 5 ))。导管测量的平均动脉压(MAP)和流体支持插入到颈动脉。为了稳定血压,0.9%氯化钠(200 μL / h)注入动脉内的(一、)和体温稳定在37°C(恒温的毯子,哈佛仪器Holliston妈,美国)。心脏频率(高频)计算从心电图(PowerLab, ADInstruments, Spenbach,德国)。老鼠牺牲通过动脉放血。血液样本进行了分析通过血液气体分析(ABL700辐射计,哥本哈根,丹麦)。肺解剖、灌洗和所述处理( 27]。

促炎介质、BSA和原降钙素(PCT)在等离子体和量化BAL流体与酶联免疫吸附实验(ELISA)(介质:研发系统,阿宾顿,英国;美国南安普顿的BSA:天鹅座技术;和PCT: Uscn,武汉,中国)。BSA的比率在等离子体和BAL流体计算来确定微血管通透性。细胞死亡是由量化评估mono -和oligonucleosomes ELISA(罗氏应用科学,曼海姆,德国)。30毫克的试验进行均质冷冻肺组织根据制造商的指示。裂解缓冲被测量为空白,这是相对于结果。细胞死亡比例计算每毫克%肺组织相对于100%的积极控制提供分析。

左肺充满了缓冲甲醛4%。肺、肾脏和肝脏中位叶的一部分固定在4%缓冲甲醛和嵌入石蜡。肺和肝脏的部分3中被削减 μm其次是苏木精和伊红染色(他)。肺,用实验肺损伤评分系统( 29日]。10字段/肺根据以下标准进行评估:答:中性粒细胞在肺泡空间,B:中性粒细胞在孔隙空间中,C:透明膜,D:蛋白质的碎片在空域和E:肺泡间隔增厚。分数计算如下: 分数 = 20. × 一个 + 14 × B + 7 × C + 7 × D + 2 × E / 数量 的 字段 × One hundred. 。肾脏切片在1 μm,沾染了周期性acid-Schiff (PAS),并与苏木精复染色。管损伤在0 - 4的得分:0 =正常组织学,1 =轻度扩张,2 =扁平上皮细胞刷状缘和损失,3 =轻微空泡形成的管状细胞质(< 5液泡/小管)和管状细胞坏死或凋亡,4 =强烈的管状细胞质液泡化(> 5液泡/小管)和管状细胞坏死或凋亡。所有管的总分是计算平均分数。总共100 tubuli每部分进行评估。组织病理学在蒙蔽的方式评估。

TUNEL染色(罗氏)执行按照制造商的说明1 μm石蜡肾脏部分。量化的TUNEL染色法是由计算随机选择20视觉领域的积极染色细胞核在肾皮质的原始放大×100。

变性尿样SDS-PA凝胶电泳分离的10%,转移到硝化纤维膜,阻止了2% BSA在渐变Tris-buffered盐水(ttb)缓冲区,和ttb洗,和孵化兔多克隆anti-kidney损伤分子-(金)1抗体(美国圣地亚哥阿克利)稀释1:1000年ttb一夜之间在4°C。使用HRP-conjugated KIM-1抗体检测山羊anti-rabbit免疫球蛋白(Dako,汉堡,德国)抗体和可视化增强化学发光。

一氧化氮(NO)量化分析(研发系统,阿宾顿,英国)是用来测量总没有血浆样品。为此,内生硝酸盐转化为亚硝酸盐,硝酸盐还原酶。亚硝酸盐被量化为发色团的总azo-derivative格里斯试剂的550海里。

时间课程混合模型进行分析的过程。巴特利特测试用于检查方差相等。Box-Cox执行转换实现方差齐性,合适的时候。残差的正态分布与Shapiro-Wilk测试验证。单变量数据进行了分析与单向方差分析,其次是 t 以及和罗斯福校正或图基期末测验。百分比数据被转换使用反正弦转换之前的分析。非参数的数据,除了生存曲线,分析了克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是邓恩的期末测验。生存曲线比较kaplan meier估计量。对于这一分析,组织TNF和zVAD / TNF,显示在生存没有区别,每个基因型集中,导致 n = 10 。皮尔逊相关系数的相关评估。统计分析进行了5.0 GraphPad棱镜(美国拉霍亚GraphPad软件)或SAS 9.4软件(美国SAS研究所卡里)。一个 p 值< 0.05被认为是显著的。数据显示为 的意思是 + 扫描电镜 与 n = 6 组中的ASM^{- / -}虚假的, n = 5 在所有其他组织。在所有的实验中,后续测试进行比较同样治疗组不同基因型以及所有的组在相同的基因型。

尽管机械通气的,稳定的体温在37°C,和血管内容量约1500的支持 μL总计超过405分钟(见附加图。 1实验设计),四个WT老鼠死于肿瘤坏死因子,而所有的ASM^{- / -}小鼠存活(图 1)。因此,遗传损耗TNF-induced死亡率的ASM带来显著的保护。接下来,我们分析了WT老鼠TNF-induced死亡率是否可以解释为器官衰竭。

肺部输入阻抗测量显示,肿瘤坏死因子没有改变肺力学。肺组织倒电容(H)是在所有组的生理正常范围(图 2(一个))。由于未知原因,基线WT骗局的H值略高于在ASM^{- / -}虚假的老鼠( p < 0.001 ),但没有显著增加由于肿瘤坏死因子或TNF + zVAD倒电容。组织阻尼(G)(图 2 (b))和气道阻力(R_{亚历山大-伍尔兹})(图 2 (c))保持不变,也在所有组的正常范围,进一步表明高系统性TNF水平没有对肺有害的影响。ASM的生化评估肺组织的活动确认ASM^{- / -}老鼠没有功能性ASM(补充图。 2)。

pO₂/ FiO₂比约500毫米汞柱(66.7 kPa)和pCO的意思₂约38毫米汞柱(5.1 kPa)表示未受损伤的气体交换在所有实验组织和提供了进一步的证据表明,肿瘤坏死因子不损害肺(表 1)。

在血浆TNF是量化检查输液注射肿瘤坏死因子的分布在循环。TNF浓度高约1000 ng / mL等离子体被发现在所有TNF-treated老鼠(图 3(a))。还值得注意的是,球液含有高TNF水平(图 3(e)),表明通过静脉注射肿瘤坏死因子进入肺部。对照组ASM^{- / -}和WT骗局,等离子体和BAL TNF水平附近的检测极限。

il - 6和MIP-2血浆TNF浓度强烈上升的所有组与对照组相比(数字 3(b)和 3(c)),而IP-10 (CXCL10)解放只是明显增加的血WT老鼠(图 3(d))。在落下帷幕,il - 6水平(图 3(f))只有适度增加了肿瘤坏死因子和血浆值相比,ASM的浓度更高^{- / -}比在WT老鼠。肿瘤坏死因子增加MIP-2 (CXCL2)只在ASM落下帷幕的水平^{- / -}老鼠(图 3(g))。IP-10 BAL浓度在所有组(图同样低 3(h))。zVAD并不影响分析介质的解放。有趣的是,MIP-2和IP-10血浆浓度高于在所有TNF-treated组球,表明TNF诱导的趋化现象的梯度是针对血管的一面。

尽管嗜中性粒细胞趋化因子MIP-2强烈增加ASM的落下帷幕^{- / -}WT老鼠相比,肿瘤坏死因子后没有观察到血管外的迁移应用程序。因此,量化intra-alveolar中性粒细胞透露,这些没有招募针对肿瘤坏死因子或TNF + zVAD(图 4(一))。相比之下,相对较高的中性粒细胞数量ASM的肺^{- / -}老鼠强烈降低TNF后注入。符合这一点,微血管通透性,这是衡量白蛋白进入肺泡,涌入在ASM骗局高于在TNF-treated ASM WT老鼠和减少^{- / -}老鼠(图 4 (b))。

组织病理学检查进一步表明,肿瘤坏死因子没有显著影响肺WT(数字 5(b)和 5(c))和ASM^{- / -}老鼠(图 5(e)和 5(f)),尽管损伤分数在所有TNF-treated组增加了10%左右。这一增长是由于间质中性粒细胞的数量略有增加(红色箭头)肿瘤坏死因子,但除此之外,没有观察到主要的改变。在ASM^{- / -}小鼠肺泡障碍物与泡沫扩大巨噬细胞充满了胞质脂质夹杂物在场(黑色箭头),这增加了ASM的损伤评分^{- / -}虚假的WT虚假的老鼠相比,无关紧要的(图 5(g)),表示sphingolipidosis发作。

为了评估肿瘤坏死因子是否会影响肺细胞死亡,mono -和oligonucleosomes量化在肺部组织。有趣的是,在WT老鼠,高肺肿瘤坏死因子水平没有显著影响肺的细胞死亡(图 5(h))。因此,老鼠收到TNF结合pan-caspase抑制剂zVAD没有显示出对肺有害的影响。此外,在ASM^{- / -}老鼠,相对细胞死亡只是稍微增加了肿瘤坏死因子,而这显然是更高的ASM^{- / -}组相比,相应的WT老鼠。此外,我们执行一个anti-cleaved caspase-3免疫染色,证实了从ASM持续的肺部细胞死亡^{- / -}老鼠,即使没有TNF治疗,而WT骗局集团完全是消极的(补充图。 3)。

PAS-stained肾脏的组织病理学显示在WT老鼠没有主要的病理改变,甚至TNF治疗后(数字 6(一)- 6(c))。相比之下,ASM^{- / -}虚假的老鼠显示不同的管状空泡形成和僵化的肾小球(图 6(d))。得分的管状损伤确认不仅ASM^{- / -}老鼠有一个更高层次的组织损伤,与WT老鼠相比,但也容易伤TNF(数字 6(g) - 6(我))。The protein kidney injury molecule- (KIM-) 1, which is an indicator for tubular injury, was detected in the urine from mice in the group ASM^{- / -}+ TNF和没有WT老鼠。图 6(j)显示一个模范免疫印迹与尿液从三个老鼠每组。TUNEL染色肾脏部分没有说明细胞死亡(图 6(k))。对肾脏zVAD没有影响。

肝脏组织的组织学评估显示正常的形态在WT虚假的老鼠(图 7(一)),而出血明显在TNF-treated WT老鼠和血窦满是红色和白血细胞(蓝色箭头人物 7(b)和 7(c)),说明血瘀。出血以及blood-clogged正弦曲线没有肝脏的ASM^{- / -}老鼠(打开正弦曲线由黑色的箭头表示)(数据 7(d) - 7(f))。ASM的肝细胞^{- / -}老鼠一般显示细胞质颗粒的形态改变,加重了细胞膜和细胞内脂质夹杂物尼曼氏病的特征。的细胞图中的绿色箭头所示 7(d),这些改变是明显多数的肝细胞。肝损伤的血浆进行了分析标记天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、肿瘤坏死因子增加到一个小和生理上无关紧要的程度(数字 7(g)和 7(h))。胆红素水平约为0.5 mg / dL在所有老鼠,因此在健康动物的范围(数据没有显示)。再次,zVAD对器官损伤无显著影响。

血气分析显示,所有TNF-treated老鼠遭受严重的代谢性酸中毒 pH值 < 7.2 (表 1),这表明TNF造成sepsis-like症状。这是进一步支持量化原降钙素(PCT)、败血症和无菌炎症的标志,显示PCT水平高于2000 ng / L(图 8)。组中的血红蛋白增加WT +肿瘤坏死因子比虚假的控制和高TNF-treated WT老鼠比TNF-treated ASM老鼠(表 1)。zVAD没有系统性的影响,无论是在这个图还是在下面显示的数字。

平均动脉压(MAP)普遍偏低是由于与戊巴比妥麻醉,但在控制(图仍然保持不变 9(a))。相比之下,随着时间的推移它降临在TNF-treated WT老鼠,直到它最终达到极低的值< 40毫米汞柱在nonsurvivors幸存者和< 30毫米汞柱。血压的下降伴随着连续增加心脏频率(高频)(图 9(b))。有趣的是,ASM^{- / -}老鼠似乎TNF-induced低血压的保护。该集团ASM^{- / -}+ TNF没有地图和下降只在高频最初的适度增长。

在这项研究中,没有量化的等离子体检查是否耐火低血压和受损在WT老鼠生存可能与血管舒张由于激活的通过ASM以挪士。WT虚假的老鼠显示没有水平显著高于ASM^{- / -}虚假的老鼠,没有水平显著增加了TNF治疗,但是没有TNF-treated ASM的区别^{- / -}和WT老鼠(图 10)。

综上所述,肿瘤坏死因子引起的系统性炎症反应包括心血管失败与致命的结果只在40%的WT老鼠,而ASM^{- / -}老鼠防止TNF-induced低血压。

小鼠的死亡率TNF-treated WT表明TNF的高剂量,这是致命的(之前在其他研究 18, 25, 30.(图),一直有效 1)。尽管如此,没有发生肺损伤(图 2和表 1)。这惊人的发现导致问题是否注射肿瘤坏死因子实际上已经进入肺部,这是证明了量化TNF的球(图 3)。血浆il - 6水平,MIP-2 IP-10反映了肿瘤坏死因子分布,这是独特的高血浆比落下帷幕,表明TNF注入了定向趋化现象的梯度对血管端鼠标两种病毒。这个假设被观察到支持intra-alveolar中性粒细胞计数(图 4(一))是在一个范围内,可以认为是正常的通风老鼠( 27),并没有增加,而是降低TNF,表明中性粒细胞可能是阻碍流通,而不是隔离的肺。

ASM^{- / -}老鼠intra-alveolar中性粒细胞的数量高于同等对待WT老鼠,ASM的最高数量^{- / -}虚假的组。因此,这一组表现出alveolar-capillary屏障破坏的迹象。由于中性粒细胞封存不是ASM的共同特征^{- / -}老鼠一般( 31日),大量的中性粒细胞可能是引起机械通风。值得注意的是,TNF治疗导致的肺保护ASM^{- / -}老鼠。事实上,微血管通透性的中性粒细胞封存表明TNF没有造成neutrophil-independent水肿(图 4 (b))。这是符合发现TNF-induced水肿是neutrophil-dependent在以前的研究中显示 32- - - - - - 34]。符合这一点,TNF没有诱导灌注水肿在孤立的游离鼠和兔肺( 35)和静脉注射应用TNF甚至防止水肿形成( 36]。相比之下,在肿瘤坏死因子的模型是直接管理到呼吸系统,它引发了中性粒细胞招募和水肿的形成 37, 38]。与17个病人,此外,在一个小型研究中肿瘤坏死因子用于孤立的肢体灌注,三个发达呼吸衰竭患者继发于肺部水肿( 39),但这被认为审判是在癌症患者中执行。TNF-induced减少在ASM的中性粒细胞和微血管通透性^{- / -}老鼠表明这些肺preinjured,进一步支持,肿瘤坏死因子对血管端定向趋化现象的梯度。值得注意的是肿瘤坏死因子没有增加血管通透性。综上所述,这些研究结果有力地表明,肿瘤坏死因子没有直接对肺血管通透性的影响。

此外,组织病理学评价肺(图 5)证实,高浓度的循环肿瘤坏死因子不产生病理改变,除了一个间质中性粒细胞数量的增加,也在早前的一项研究报告( 40]。组织病理学进一步透露,尽管年轻的老鼠(8 - 10周),脂质存储疾病与泡沫细胞的形成,典型的ASM不足( 31日),已经正在进行。这可能导致增加BAL趋化因子水平和最有可能也解释了ASM的更大程度的细胞死亡^{- / -}老鼠(图 5(h))。的裂解caspase-3-positive细胞组ASM^{- / -}+ zVAD / TNF进一步支持之前,这些细胞已经凋亡实验(补充图。 3)。

缺乏肺损伤的一种解释这项研究可能的使用endotoxin-free TNF (< 0.1 ng / μ欧盟/ g, < 1 μ克)。在早期的实验研究,肿瘤坏死因子有有害的影响,存在少量的内毒素( 7, 13, 14]。众所周知,肿瘤坏死因子和内毒素有协同效应,甚至少量的内毒素增加肿瘤坏死因子的毒性( 41, 42]。不幸的是,这些研究被执行没有测量肺力学或氧化,所以它仍然悬而未决,实际上肺功能受损的程度。相比当前方法的另一个区别是使用小鼠肿瘤坏死因子的早些时候,它与受体小鼠TNF-R1和TNF-R2,因此代表了生理配体在小鼠系统中,而不是以前的人类肿瘤坏死因子,结合选择性小鼠TNF-R1 [ 25]。TNF-R1促进死亡信号、肺中性粒细胞封存和水肿形成,而TNF-R2被证明防止肺水肿( 43),减弱TNF-mediated炎症反应( 44]。因此,TNF-R2可能引起部分炎性TNF-R1的行动。

众所周知,因为肿瘤坏死因子在肾和肝衰竭中发挥作用 5, 8, 45),肾脏(图 6)和肝脏(图 7器官损伤的)也被检查。ASM的脂质典型夹杂物缺陷( 31日)肾脏和肝脏中发现表明,ASM缺陷本身造成了一些器官损伤,这是符合我们的发现在肺。此外,ASM的肾脏^{- / -}老鼠容易伤TNF,可能由于解放促炎介质的迁移白细胞增加,如肺部所示。值得注意的是,肿瘤坏死因子不引起急性肾损伤(AKI)在WT老鼠(数字 6(g) - 6(j)),这是一个常见的并发症在脓毒症 45]。符合我们的发现,先前的研究报道管状或肾小球损伤和损伤其他器官肿瘤坏死因子单独使用时的 25, 26]。这突显出器官损伤的复杂性,而不是一个需要一整套的介质,如脂多糖作为刺激时释放( 46, 47]。

最后,blood-clogged正弦曲线WT老鼠表示,这些老鼠的肝脏遭受冲击( 48)(图 7(一)- 7(c))。有趣的是,没有病理改变明显的肝血流microcirculatory ASM的肝脏^{- / -}老鼠,尽管这些显示初始尼曼氏病(数据的表现 7(d) - 7(f))。AST和ALT的低TNF-induced增加以及一成不变的低胆红素值(数据未显示)表明,肝衰竭并非在WT小鼠死亡率(数据的原因 7(g)和 7(h))。先前的研究肿瘤坏死因子较低剂量注入了几天显示一个潜在有害的肿瘤坏死因子( 7, 49),我们不能排除肝细胞损伤和失败可能已经开发出更长一段时间后的结果微血管功能障碍( 48]。在动物研究中并没有受到生命支持措施,高ALT水平被发现已经致命的肿瘤坏死因子的挑战[6小时后 40]。这说明临床相关环境的重要性,这似乎严重影响结果在实验脓毒症模型。

在目前的研究中,一般的半胱天冬酶抑制剂zVAD没有可确定的影响肺部,肾脏或肝脏,这是最有可能归因于TNF的情况下不破坏内皮。因此,zVAD一直局限于脉管系统。此外,细胞死亡中没有相关的角色,因此不受zVAD。因此,使用zVAD不允许进一步表征ASM肺损伤的作用,尽管我们zVAD活跃,最近的研究证明了在癌细胞中,我们使用相同的许多zVAD 50]。

尽管TNF未能引起器官损伤,诱导sepsis-like品系小鼠症状。严重代谢性酸中毒TNF-treated小鼠微循环(表反映了受损 1)。此外,高水平的PCT(图 8),在人类和小鼠脓毒症的标志( 51),支持TNF诱导系统性炎症和还表明,TNF的病理生理反应是类似于由感染引起的。在这两个对照组,PCT水平低于检出限,证明PCT的增加并非由于有效的干预措施或机械通风。

肿瘤坏死因子的临床使用作为癌症治疗的药物被发现受到了其毒性的限制,反映在器官损伤和低血压 5, 8]。耐火低血压和反射性心动过速,可以视为系统性炎症的表现( 52),观察目前的研究(图 9低灌注),最有可能引起死亡的WT老鼠(图 1)。这是进一步支持的观察,血液集中在WT小鼠的肝脏,但不是ASM^{- / -}老鼠以及较高的血红蛋白水平在WT老鼠表明等离子体损失(表 1)。ASM的事实^{- / -}老鼠免受低血压和死亡率,在给定的时间框架,指出小说的角色ASM在休克的发病机制。这是符合发现增加了ASM水平与脓毒症患者的死亡率( 16]。有趣的是,ASM^{- / -}老鼠也证明是抵抗endotoxin-induced死亡率在前面的方法中,肿瘤坏死因子的机制——和endotoxin-induced冲击很大程度上是相同的 18]。然而,心血管影响TNF-induced冲击并不是在这种情况下。

一种机制的ASM可能参与的发展冲击响应的激活是肿瘤坏死因子没有神经酰胺合成酶,导致血管舒张和低血容量性休克,因为它已经显示中性鞘磷脂酶和以挪士( 22, 53, 54]。然而,测量总等离子体没有显示差异TNF-treated WT和ASM^{- / -}老鼠,虽然没有很明显增加了TNF在WT骗局也高于在ASM虚假的老鼠(图 10)。它必须被考虑,没有量化会受到溶血的影响( 55),现在尤其是在等离子体的样本TNF-treated WT老鼠。因此,ASM参与不解放不能完全被排除在外。ASM的机制介导TNF-induced低血压以及可能的肿瘤坏死因子对心脏的直接影响,如心肌炎、在TNF-overexpressing老鼠(证明是致命的 56),需要在未来调查。

在目前的研究中,不仅流体支持,特别是体温的稳定可能会影响结果,防止体温过低,与小鼠热相对应,可能阻止更快TNF-treated死老鼠。尽管这些措施,非常高的肿瘤坏死因子剂量(50 μg)诱导死亡更快与前两个相比,本研究研究15 - 25 μ使用g肿瘤坏死因子( 25, 26),所以实验时间有限,可能会限制器官损伤的发展。