右美托咪定对大鼠缺血再灌注肾损伤的保护作用

摘要

急性肾损伤(AKI)是一种临床综合征，是一种突然发作的肾功能衰竭，严重影响肾小管。一种潜在的治疗方法是右美托咪定(DEX)，一种高度选择性的药物α_2.- 一种用作麻醉剂佐剂的激动剂。它还具有抗炎，神经保护和同情的品质。本研究的目的是建立德克斯是否还提供针对缺血和再灌注的保护 - （I / R-）诱导大鼠的AKI。腹膜内注射德克斯（25 μg/kg）给药30分钟 导入I/R之前的最小值。结果表明，在I/R大鼠中，DEX通过减少肾小管损伤和维持肾功能发挥保护作用。此外，作为对I/R的反应，DEX治疗降低了TNF的mRNA表达-α，IL-1β肾组织中IL-6和MCP-1以及血清TNF水平-α，IL-1βIL-6和MCP-1。DEX还能降低肾小管细胞的氧化应激和凋亡水平。这些结果表明，在I/R肾损伤中，DEX通过抑制炎症和小管细胞凋亡，减少活性氧的产生，促进肾功能，发挥保护作用。

1.介绍

急性肾损伤（AKI）可能是大手术的后果。它显著增加了发病率和死亡率的风险[1.］.AKI可以导致心律失常，脑水肿，高钾血症，肾功能不全和水中毒品。所有这些条件都构成了死亡的风险[2.］.关于急性应激性AKI的研究报道很少;因此，有必要研究其潜在机制和有效的治疗方法。

AKI可由缺血再灌注(I/R)引起。在I/R期间，肾小管上皮细胞的细胞极性和细胞骨架完整性受到干扰，细胞-细胞和细胞-基质相互作用受到破坏，线粒体受损，活性氧(ROS)合成增加[3.–5.］.由急性约束应激引起的氧化应激已被确定可导致海马和肝脏损伤[6.]. 因为氧化应激可以促进细胞凋亡，它也有能力引起AKI。事实上，许多病理性肾损伤都归因于细胞凋亡[6.］.这一发现刺激了对氧化应激和细胞凋亡在I/ r诱导的肾损伤病理过程中的作用的研究。

右美托咪定（DEX）具有几种可能有益于治疗AKI的性质。这是一种有效的、高度选择性的方法α_2.肾上腺素能激动剂具有镇痛，镇静和反动脉分解特征[7.,8.］.肾脏的远端和近端小管以及梗死脉管系统丰富α_2.-肾上腺素受体[7.,8.]. 利用动物模型，研究探索了DEX在I/R损伤后的作用。DEX不仅有利于肾小管的结构和功能以及肾小管上皮细胞的凋亡，还能减少ROS的合成并抑制促炎细胞因子的分泌[9］.尽管德克斯在手术后缓解了肾I / R损伤的能力，但它在AKI上行使的机制尚未阐明。

本研究旨在探讨地塞米松对大鼠肾I/R损伤的保护作用。此外，目的是确定DEX调节细胞凋亡、炎症细胞因子和ROS的机制。

2.材料和方法

2.1. 动物与实验设计

这项研究遵循了中国医科大学的实验动物使用指南。经中国医科大学第一医院动物实验伦理委员会审批。

使用了180名健康的7-8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠220-270g。他们被安置在实验室（ ,12–12 h光暗循环）在试验前一周在无病原体的外壳中。直到12月12日，食物和水都是自由提供的 h在实验前。食物随后被取出；然而，水是可用的。

大鼠镇静后用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)和10μg/kg枸橼酸舒芬太尼(仁福药业，中国，批号81A06031)腹腔注射为改善围手术期镇痛，在手术切口前和缝合后，采用0.2%罗哌卡因(阿斯利康AB，瑞典)局部浸润。测量大鼠体温，用热垫将其维持在37°C(±1°C)。用皮下电极监测心率。在左股动脉放置24g套管针，有创地监测动脉压力。排除标准适用于心率低于每分钟200次(bpm)且持续时间超过5分钟或平均血压(MAP)低于55 mmHg的大鼠。为诱导肾I/R损伤，钳取右侧肾蒂45 min，手术切除左侧肾蒂。

取下动脉夹后，观察剩余肾脏的颜色。5分钟内由深紫色变为红棕色，表明血流灌注恢复成功。每只大鼠每2小时给予0.5 ml生理盐水i.p.注射，直至苏醒或标本采集。I/R后24 h处死动物，立即采集腹主动脉血样。为了去除细胞元素，将血液样本放在冰上2小时，然后离心15分钟(3000 g, 4°C)。血清保存在−80°C。用冰冷的肝素化盐水经心脏灌注后取肾。部分肾组织切片用多聚甲醛固定，石蜡包埋;4μ取m切片，苏木精和伊红染色。此外，还进行了末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记（TUNEL）分析。其余肾组织保持在正常状态−80°C，直到进一步分析。

将大鼠随机分配给三组中的一个（ 每组）：

组1。假手术对照:大鼠在假手术前接受0.5 ml生理盐水i.p.注射。肾血管未被夹住。

组2。Renal I/R group (I/R): The surgery was performed as previously described.

组3。DEX+I/R组(DEX+I/R):在开始肾缺血前30 min, 25μ通过腹腔注射给予g/kg的DEX。

２.２.肾组织学

用10％缓冲的福尔马林将肾脏分解，脱次乙醇溶液，嵌入石蜡，切片，并用苏木精和曙红染色。急性管状坏死在0至4级的基础上，基于皮质或外部髓质的损伤分级：0 =正常，1 =最小损伤（<5％的受累），2 =温和损伤（5-25％的参与），3 =中度伤害（参与25-75％），4 =严重损害（> 75％的参与）[10］.

2.3. 肾功能

使用UniCel DxC800 Synchron设备（美国贝克曼）对血清肌酐（CREA）和血清尿素氮进行定量。使用标准酶免疫分析试剂盒（BioPorto Diagnostics，Gentofte，丹麦）来确定中性粒细胞明胶酶相关脂质沉积蛋白（NGAL）和胱抑素C的血清浓度。

２.４.逆转录聚合酶链反应

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测TNF的表达水平-α，IL-1β肾脏中的IL-6和MCP-1。用TRIzol（Invitrogen）提取细胞总RNA，用Moloney小鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录试剂盒（Promega）合成cDNA。通过使用IQ SYBR Green Supermix试剂（美国Bio-Rad）和Bio-Rad实时PCR机进行定量实时PCR。遵循制造商的说明。数据采用统计分析方法进行分析−ΔΔCT方法。甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）用作管家基因，靶向靶基因的表达水平标准化。桌子1.呈现引物序列。

2．5．肾氧化应激分析

制备肾组织匀浆以测量谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的浓度。匀浆还用于鉴定超氧化物歧化酶（SOD）抗氧化酶活性。遵循制造商关于相应分析试剂盒的说明（中国南京建成生物工程研究所）。

2.6。血清炎症细胞因子分析

通过使用南京建成生物研究所（南京，江苏，中国）的商用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒和450℃的微孔板阅读器测量血清炎性细胞因子 纳米（热科学，马萨诸塞州沃尔瑟姆）。遵循制造商的指南。

2.7。末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸镍骨贴贴标签（TUNEL）测定

为了检测凋亡的小管上皮细胞，按照制造商的说明书(in situ Cell Death Detection Kit, POD, Roche, Switzerland)使用原位TUNEL法。石蜡固定的切片被脱蜡。然后用二甲苯和一系列分级的乙醇和双蒸馏水再水合。切片用蛋白酶K (20μg/ml)，在室温下冲洗15分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗两次。载玻片干燥后，50μ应用1%的TUNEL反应混合物。载玻片在37°C的加湿室内孵育60分钟 分钟，然后用PBS冲洗三次。转炉吊舱（50 μl)加入标本，加盖，37℃湿室孵育30min。再用PBS冲洗三次，然后用二氨基联苯胺(DAB)底物染色(中国北京中山)。10min后，用PBS冲洗三次，去除DAB。苏木精或甲基绿污渍，然后立即用自来水冲洗。ImageJ软件(1.38版本;美国国立卫生研究院(Rockville, MD)用于计算10个随机选取切片的目标网格中tunel阳性细胞的数量。计数使用了一个40倍物镜，由一名对实验目的不知情的研究人员进行。对这10个计数的平均值进行分析。

2.8. 统计分析

数据在IBM SPSS Statistics for Windows, version 22.0 (SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)中进行分析。结果以平均值和标准偏差(SD)表示。采用单因素方差分析(ANOVA)对多组数据进行比较。统计显著性设为 .这些图形是在GraphPad Prism 7.00（美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad公司）中创建的。

3.结果

为了证实DEX对I/R诱导的肾损伤的作用，25 μG / kg DEX通过I.P给药。在I / R之前30分钟注射。数字1.报告肾脏损伤的组织学图像。苏木精和伊红染色的证据表明，I/R大鼠肾脏的组织学损伤包括局灶性肾出血、局灶性肾小管坏死、中性粒细胞浸润和肾小管上皮细胞空泡变性( )．dex处理的大鼠组织学损伤较轻( )比I/R大鼠的情况要好。

如图所示2.，血清CREA显著升高( )和尿素氮( )提示I/ r诱导的肾功能障碍。然而，这些血清标志物显著降低( )与I/R大鼠相比这说明在I/R诱导后，dex处理的大鼠肾脏功能得到了一定程度的维持。此外，I/ r诱导大鼠血清NGAL和胱抑素C水平显著升高( )比假组的人要多。然而，他们明显较低( )dex处理的大鼠比I/ r诱导的大鼠更明显(图)2.)．

还评估了DEX对氧化应激的影响。如图所示3.在I/R诱导的大鼠中，MDA浓度显著升高( )比假组的人要多。然而，在用DEX处理的I/R大鼠中，氧化应激水平降低( )与I/R大鼠相比。I/R组GSH和SOD活性显著降低( )比假对照组的人要多。确实，I/R组用DEX处理后GSH浓度和SOD活性水平显著升高( )与I/R组相比。

评估DEX对促炎细胞因子表达的影响。肾脏样本的RT-PCR结果表明IL-1的表达水平β、IL-6、MCP-1和TNF-αmRNA显著升高( )在I/ r诱导的大鼠中比在对照组中(图)4.)．DEX具有调节作用。IL-1的mRNA表达β、IL-6、MCP-1和TNF-α( )右美地塞米松治疗组大鼠肾组织中酶活性明显低于I/ r诱导组大鼠。血清IL-1水平β、IL-6、MCP-1和TNF-α在I/R大鼠中明显高于dex处理的I/R大鼠( )．血清IL-1水平β、IL-6、MCP-1和TNF-α( )接受DEX治疗的大鼠的死亡率低于I/R诱导的大鼠。这表明在I/R损伤的情况下，DEX对炎性细胞因子的表达具有抑制作用。

现有证据表明，肾小管细胞的凋亡加剧了I/R损伤的发病机制。因此，我们探讨了地塞米松对I/ r诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响。TUNEL实验结果显示，I/R损伤与显著增加相关( )在这些上皮细胞的凋亡水平。相比之下，dex处理的大鼠肾脏样本中凋亡细胞较少( )与I/R组相比(图)5.)．

4.讨论

心血管和移植手术或休克的后遗症是引起AKI的肾I/R损伤。这导致住院时间延长，甚至死亡[11］.本研究表明，DEX预处理有助于维持I/R损伤患者肾脏的形态和功能。当肾脏I/R发生时，血液中循环的炎症介质水平降低，由于给药DEX，肾脏经历的氧化应激减少。这些结果提示DEX可能是一种适当的药物干预，以减少急性损伤引起的肾脏损害。

DEX的优点之一是它保留麻醉效果和促进血流动力学稳定。因此，DEX经常作为围手术期和重症监护药物的镇静剂。它也被用作麻醉剂的佐剂[12］.右美托咪定具有镇痛、血流动力学、镇静和解交感神经的特性，对围手术期患者特别有用，因此具有广泛的临床应用价值。

其他特征是它对大脑、心脏、肺和肾脏的抗炎、抗氧化和抗凋亡作用[13,14]. 几项动物模型研究的结果表明，DEX还可以保护肾脏免受I/R损伤[12,15］.其他研究也强调了DEX在预防心血管及其他重大外科手术患者肾脏损伤方面的有益作用[16］.这些发现补充了早期的研究，即在I/R损伤后CREA和BUN水平显著升高。这表明肾功能受损。组织病理学检查显示I/R引起肾损伤;DEX预处理可起到缓解作用。

在应激状态下，机体会产生过量的氧自由基。这就破坏了氧化系统和抗氧化系统之间的微妙平衡17］.本研究结果表明，DEX可降低氧化损伤的重要生物标志物MDA水平，提高GSH和SOD水平。MDA是自由基损伤程度的一个有用的间接指标[18］.相比之下，GSH和SOD是重要的抗氧化剂[19］.结果表明，I/R通过提高MDA水平、降低GSH和GSH酶活性来降低抗氧化防御系统。这提示I/R可诱导氧化应激，氧化应激可能在AKI的发病机制中起重要作用。DEX治疗有助于防止氧化应激，表明它有抗氧化作用[20.］.因此，DEX对I/ r诱导的AKI具有保护作用。

I/R损伤的另一种表现是炎症反应增强[21,22]. 这种反应加重了病情，因为巨噬细胞、T细胞和其他炎症介质被征募到I/R损伤的组织中[21,22]. 正如本研究中从I/R损伤大鼠肾脏获得的组织样本的结果所示，IL-1的表达β、IL-6、MCP-1和TNF-α信使rna是升高的。相比之下，在I/R后注射地塞米松的大鼠肾组织样本显示IL-1较低β、IL-6、MCP-1和TNF-α信使rna表达。发现肾脏形态、血清炎症介质水平和细胞凋亡状态之间的关系。I/R损伤的发病机制和进展受到包括IL-1在内的促炎细胞因子的影响β、IL-6、MCP-1和TNF-α[23,24]. DEX不仅作用于肾脏的局部α_2.- 一种肾上腺素抑制剂，但也影响抗炎反应，从而减轻I / R对肾脏的破坏作用。

细胞凋亡，也称为程序性细胞死亡，是维持细胞稳定性的关键机制；但是，太多可能会损坏身体[25］.通常，细胞凋亡是肾I/R损伤的早期事件，与随后的炎症和肾损伤相互作用[26］.在本研究中，从I/ r损伤的肾脏中提取的tunel阳性细胞数量明显高于接受DEX干预的肾脏。研究发现TNF-α对肾脏造成伤害[27,28]. DEX可能通过刺激抗凋亡作用保护I/R后的AKI。

本研究中获得的数据表明，通过抑制管状细胞凋亡和炎症，降低ROS生产和促进肾功能，DEX对大鼠I / R损伤的保护作用对大鼠I / R损伤产生保护作用。这些结果表明DEX可能在治疗I / R启动的AKI中发挥作用。但是，Dex并非没有副作用;通过副交感神经激活，它可以促进颅卡。Dex如何最好地剥削以保护重要机构尚未建立。进一步研究其应用是合理的。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从相应作者处获得。

的利益冲突

作者宣布关于本条的出版物没有利益冲突。

作者的贡献

包乃仁完成了初稿；戴迪批判性地修改了手稿。所有作者都同意提交手稿。

致谢

这项工作得到了辽宁省教育署科技研究项目（LK201651）的支持。

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