文摘

神经性疼痛是一个棘手的脊髓损伤的发病率。增加非编码rna已经与神经性疼痛的发展。lncRNAs神经性疼痛被认为是重要的监管机构。lncRNA小核仁的RNA宿主基因4 (SNHG4)与一些肿瘤相关。然而,SNHG4在神经性疼痛的分子机制仍几乎没有记录。在这里,我们评估的功能SNHG4脊神经结扎(SNL)大鼠模型。我们观察到SNHG4显著调节SNL老鼠。击倒SNHG4能够减弱神经性疼痛的进展通过调节行为的神经性疼痛包括机械和热痛觉过敏。此外,击倒SNHG4可以抑制神经炎症通过抑制il - 6、il - 12, TNF -α而诱导il - 10的水平。此外,mir - 423 - 5 - p是预测的目标SNHG4采用生物信息学分析。mir - 423 - 5 - p报道施加在几个疾病明显较差。然而,mir - 423 - 5 - p的角色发展的神经性疼痛需要澄清。在我们的调查中,把化验证实mir - 423 - 5 - p之间的关系和SNHG4。与此同时,我们发现mir - 423 - 5 - p明显减少SNL鼠模型。SNHG4监管mir - 423 - 5 - p表达负面。展出,mir - 423 - 5 - p的损失导致神经性疼痛恶化,获救的SNHG4的沉默。因此,我们的研究表明SNHG4作为小说治疗神经性疼痛的目标通过骗取mir - 423 - 5 - p。

1。介绍

神经性疼痛会导致损伤的神经组织或神经系统的功能障碍(1]。它可以表现为自发性疼痛,触诱发痛和痛觉过敏(2]。神经性疼痛的发病率每年增加的病人(3]。然而,发生的病理生理机制和神经性疼痛治疗的发展仍然鲜为人知。临床诊断和治疗神经性疼痛仍然是一个大挑战。

lncRNAs家庭长非编码rna,特点是与记录超过200核苷酸分子长度(4- - - - - -6]。以前的研究已经指出,lncRNAs参与神经性疼痛的发展(7- - - - - -9]。例如,击倒lncRNA NONRATT021972可以抑制糖尿病神经性疼痛,可由P2X3受体(10]。lncRNA X-inactive特定记录可以通过调节促进神经性疼痛发展mir - 154 - 5 - p和TLR5 CCI老鼠(11]。XIST可以诱发神经性疼痛,骗取mir - 544和激活STAT3 (12]。的损失lncRNA PKIA-AS1可以通过下调减弱神经性疼痛CDK6 [13]。SNHG4已被确定在几个生理和病理过程,参与癌症。例如,upregulation SNHG4促进前列腺癌进展通过调节mir - 377和ZIC5 [14]。SNHG11诱发肝癌进展通过调节mir - 184和AGO2 [15]。然而,SNHG4功能和分子机制的神经性疼痛仍被知晓。

小分子核糖核酸是小非编码rna可以发挥至关重要的作用在基因调控16]。小分子核糖核酸可以调节基因表达的转录后的通过绑定到相应的互补序列的蛋白质编码mrna (17]。新兴的角色小分子核糖核酸在神经性疼痛已经表现出18,19]。例如,mir - 142 - 3 - p可以通过调节高流动性缓解神经性疼痛组框1 (20.]。mir - 93可以通过针对缓解神经性疼痛信号传感器和转录激活3 (21]。mir - 423 - 5 - p的失调是常见的几种疾病。例如,mir - 423 - 5 - p报道通过针对Nox4抑制high-glucose-induced足细胞损伤(22]。mir - 423 - 5 - p可以通过针对Sufu[抑制成肌细胞增殖和分化23]。然而,mir - 423 - 5 - p的函数在神经性疼痛仍然是未知的。

在这里,我们发现SNHG4 SNL大鼠的脊髓组织中大幅增加。的角色在SNL-triggered SNHG4神经性疼痛集中。我们发现SNHG4击倒压抑的神经性疼痛通过抑制体内存在炎症进展。通过生物信息学分析,我们还发现,过度的SNHG4提升神经性疼痛通过直接骗取mir - 423 - 5 - p。因此,我们的研究表明SNHG4作为小说治疗神经性疼痛的目标通过调节mir - 423 - 5 - p。

2。材料和方法

2.1。动物研究

男性的雄性SD (SD)中老鼠(∼300 g)来自上海动物实验中心。我们住的老鼠在一个保存在一个标准12小时光/暗周期的设备 和50 - 70%的湿度。老鼠都提供免费的水和食物。行为测试前,动物被安置了1 - 2天。脊神经结扎(SNL)引发神经性疼痛模型建立如下。老鼠后使用1%戊巴比妥钠麻醉,L5脊神经是孤立使用6丝缝合和结扎。sham-operated组相同的手术是在没有结扎大鼠。然后,每组大鼠手术后被牺牲掉了好几天0,3、6、9和15;脊髓组织立即收集和维护在未来实验的-80°C。这项研究是根据需求指导下执行的护理和使用美国国立卫生研究院的实验动物。本研究通过武汉大学人民医院的伦理委员会。

2.2。细胞培养

PC12细胞获得写明ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞在DMEM培养基培养(表达载体;热费希尔科学公司,沃尔瑟姆,妈,美国有10%的边后卫(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和1%的青霉素和链霉素(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。5%的公司2孵化器在37°C用于培养细胞。这些细胞被感染了慢病毒( )5毫克/毫升聚凝胺(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)48小时。

2.3。慢病毒感染

lv -反- mir - 435 - 5 - p, LV-shSNHG4或相应的负控制LV-NCs获得系统生物科学公司(美国加利福尼亚州山景城)。SNL老鼠收到鞘内注射慢病毒( )手术后第三天。鞘内注射过程执行如下。大鼠麻醉后容易被保持在一个位置。一个小孔在椎间L4和16种椎骨之间的空间被创建。后来,无菌PE10鞘内导管是通过开到腰肿大。老鼠被允许恢复为其他实验进行了前两天,在收到导管。

2.4。评估疼痛阈值

机械触诱发痛评估使用爪子撤军阈值(佩恩表的编制者)·冯·弗雷细丝。短暂,老鼠放进一个透明的塑料盒金属网层。我们使用校准·冯·弗雷细丝(IITC林地山坡、钙、美国)创建足底压力表面大鼠后爪。然后,细丝的大小在爪子撤军被记录。爪子撤军延迟(PWL)是用来评估使用足底的热痛觉过敏测试仪器。每隔5分钟记录交替后爪子。刺激和爪子撤军记录之间的持续时间。我们设置了截止时间30秒。

2.5。RNA免疫沉淀反应试验

麦格纳RIP工具包(EMD微孔,Billerica,妈,美国)被用来做RNA免疫沉淀反应试验根据制造商的指示。使用RIP裂解缓冲细胞细胞溶解。磁珠结合人类anti-Ago2抗体或控制抗体(微孔)被添加到细胞溶解产物整整一个晚上。

2.6。ELISA

脊髓组织收集。蛋白溶解产物添加到每组脊髓组织样本的同质化的组织。然后,我们收获离心后的上层清液 在4°C。水平的肿瘤坏死因子-α发现,il - 12、il - 6和il - 10是使用ELISA试剂盒(Cwbiotech,北京)。浓度的标准井是0,7.5,15、30、60、120 pg / ml。除了空白威尔斯,100μl HRP-labeled检测抗体(美国剑桥Abcam)添加到标准井和井样品。后来,井被封口膜密封,在37°C和孵化后一个小时,液体被移除,板是干,板与PBS反复清洗。50μl (A和B的每个基质添加到。混合是在37°C的环境中15分钟没有光。最后,50μl停止添加解决方案;每个油井的OD值决定使用一个微型板块读者在15分钟内450海里。蛋白质浓度是根据标准曲线计算。

2.7。提取的RNA和存在

从脊髓组织和小胶质细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体)。探测SNHG4和mir - 423 - 5 - p M MLV逆转录酶(BioTeke Corp .),北京,中国)被用来获得的互补。qPCR进行使用SYBR-Green系统(应用生物系统公司)。相对基因表达表现出使用2ΔΔCt。实时PCR引物序列见表1。引物对SNHG4 GAPDH, mir - 423 - 5 - p, U6, il - 6、il - 12、il - 10, TNF -α从Sangon(上海,中国)。

表1
用于实时PCR引物。
2.8。RNA拉试验

纯化RNA RNA是用生物素标记和皮尔斯3 结束Desthiobiotinylation工具包(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。积极的控制(mir - 423 - 5 - p - bio),负控制(mir - 423 - 5 - p - bio -狗),细胞溶解产物和NC-Bio孵化。每个绑定的反应是表示与磁珠。使用中存在筛选了RNA进行了分析。

2.9。统计分析

使用GraphPad棱镜进行统计分析软件(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。学生的 - - - - - -测试和单向方差分析被用来评估两组之间的差异的统计学意义和多个组,分别。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。SNL鼠模型成功建立

首先,调查的角色SNHG4在脊髓损伤引发的神经性疼痛,SNL鼠模型建立了我们(数字1(一)和1 (b))。我们评估热痛觉过敏和机械触诱发痛。SNL鼠模型中,佩恩表的编制者和PWL大大减少在术后第3天,6,9岁和15岁。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
脊柱不结扎(SNL)大鼠模型。脊柱不结扎诱导机械痛觉过敏(a)和(b)热痛觉过敏的老鼠。 为每个组;三个独立的实验。误差线站的 至少一式三份的实验。 。
3.2。SNHG4 SNL老鼠调节

调查的潜在作用SNHG4神经性疼痛恶化,RT-qPCR SNHG4表达SNL老鼠来测试。SNHG4明显升高SNL老鼠相比,对照组在术后第3天,6,9和15(图2(一个))。随后,我们进行了功能丧失通过鞘内注射的LV shSNHG4实验。感染LV shSNHG4大大克制SNHG4表达SNL老鼠表现出图2 (b)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
表达式的SNHG4 SNL老鼠。(一)SNHG4表达式L4-L6背侧脊髓的老鼠。存在被用来检测SNHG4表达式术后天0,3、6、9、15。(b)模型大鼠SNHG4表达式感染LV-shSNHG4或LV-NC术后6天。 在每一个组。三个独立的实验。误差线站的 至少一式三份的实验。 。
3.3。SNHG4缓解神经性疼痛

此外,我们表明,沉默SNHG4佩恩表的编制者(图增加3(一个))和PWL(图3 (b)在LV shSNHG4-infected老鼠相比LV NC-infected鼠组在术后第3天,6,9和15。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
可拆卸的SNHG4缓解神经性疼痛。(a)的影响LV-shSNHG4机械触诱发痛被佩恩表的编制者评估。(b)的影响LV-shSNHG4热痛觉过敏被PWL评估。 为每个组。三个独立的实验。误差线站的 至少一式三份的实验。 。
3.4。的差别存在抑制了对这些SNHG4

此外,进一步探索SNHG4的生物功能,SNHG4在神经炎症的影响被评估检测il - 6、il - 12, TNF -α,il - 10。存在数据展示,SNHG4抑制il - 6的击倒,白介素、肿瘤坏死因子-α信使rna表达虽然增加了il - 10水平(图4(一))。另一方面,il - 6、il - 12和TNF -α蛋白表达也抑制了SNHG4而il - 10的损失被击倒的诱导SNHG4(图4 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
沉默SNL SNHG4压抑的神经炎症的老鼠。(a) mRNA水平的il - 6、il - 12 TNF -αL4-L6背侧脊髓,il - 10的老鼠测量使用中存在术后6天。(b)蛋白质水平的il - 6、il - 12, TNF -α,il - 10在L4-L6背的老鼠用ELISA测定脊髓术后6天。 为每个组。三个独立的实验。误差线站的 至少一式三份的实验。 。
3.5。mir - 423 - 5 - p是SNHG4的目标

生物信息学分析方法(http://starbase.sysu.edu.cn/)是由我们预测咨询mir - 423 - 5 - p为SNHG4作为目标(图5(一个))。此外,撕裂试验进行了在我们的研究中,我们证实了它们之间的直接相关(图5 (b))。展出,SNHG4和mir - 423 - 5 - p Ago2颗粒的更丰富的比免疫球蛋白在PC12细胞颗粒。RNA拉试验也验证SNHG4可以直接目标mir - 423 - 5 - p(图5 (c))。生物素化的mir - 423 - 5 - p (mir - 423 - 5 - p - bio)探针增加SNHG4水平比控制(NC-bio)或mir - 423 - 5 - p探针。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图5
mir - 423 - 5 - p是SNHG4的目标。(一)绑定地区mir - 423 - 5 - p和SNHG4。母星被用来预测在SNHG4 microRNA的监管目标。(b)之间的相关性SNHG4和Ago2在PC12细胞被撕裂试验评估。细胞溶解产物免疫沉淀反应使用Ago2抗体或免疫球蛋白。SNRNP70采用积极的控制水平。(c) RNA拉试验表明之间的直接交互mir - 423 - 5 - p和SNHG4 PC12细胞。细胞溶解产物被推倒使用生物素化的控制(NC-Bio), mir - 423 - 5 - p (mir - 423 - 5 - p - bio),或者mir - 423 - 5 - p探测器包含突变SNHG4-binding网站(mir - 423 - 5 - p - bio -狗)。三个独立的实验。误差线站的 至少一式三份的实验。 。
3.6。mir - 423 - 5 - p在SNL老鼠表达下调

此外,我们发现mir - 423 - 5 - p在SNL强烈表达下调大鼠与对照组相比(图6(一))。然后,当显示在图6 (b)大大增加,LV shSNHG4 mir - 423 - 5 - p表达SNL老鼠。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
表达SNL mir - 423 - 5 - p的老鼠。(一)mir - 423 - 5 - p表达式L4-L6背侧脊髓的老鼠。存在被用来检测SNHG4表达式术后天0,3、6、9、15。(b) mir - 423 - 5 - p模型大鼠表达感染LV-shSNHG4或LV-NC术后6天。 在每一个组。三个独立的实验。误差线站的 至少一式三份的实验。 。
3.7。SNHG4逆转的影响mir - 423 - 5 - p在神经性疼痛

我们检查了mir - 423 - 5 - p的影响在神经性疼痛。mir - 423 - 5 - p大大抑制了lv -反- mir - 423 - 5 - p,逆转的损失SNHG4(图7(一))。此外,我们显示抑制mir - 423 - 5 - p降低佩恩表的编制者(图7 (b))和PWL(图7 (c))在术后3天、6、9和15,救了SNHG4击倒的。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图7
SNHG4逆转的影响mir - 423 - 5 - p在神经性疼痛。(一)mir - 423 - 5 - p表达式L4-L6背侧脊髓的老鼠感染lv -反- mir - 423 - 5 - p或者lv -反- mir - 423 - 5 - p和LV-shSNHG4在术后6天。(b)的影响,mir - 423 - 5 - p机械触诱发痛被佩恩表的编制者评估。(c) mir - 423 - 5 - p的影响在热痛觉过敏被PWL评估。 为每个组。三个独立的实验。误差线站的 至少一式三份的实验。 。
3.8。SNHG4逆转mir - 423 - 5 - p的影响存在

mir - 423 - 5 - p的影响存在评估。我们发现mir - 423 - 5 - p的降价可能会增加il - 6、il - 12, TNF -αmRNA表达和降低il - 10 mRNA水平,可以逆转的损失SNHG4(图8(一个))。此外,il - 6、il - 12和TNF -α蛋白表达是受制于mir - 423 - 5 - p的损失而提高了il - 10 mir - 423 - 5 - p抑制(图8 (b)),它完全恢复SNHG4击倒的。

(一)
(一)
(b)
(b)
图8
SNHG4逆转的影响mir - 423 - 5 - p SNL老鼠的神经炎症。(a) mRNA水平的il - 6、il - 12 TNF -αL4-L6背侧脊髓,il - 10的老鼠测量使用中存在术后6天。(b)蛋白质水平的il - 6、il - 12, TNF -α,il - 10在L4-L6背的老鼠用ELISA测定脊髓术后6天。 为每个组。三个独立的实验。误差线站的 至少一式三份的实验。 。

4所示。讨论

神经性疼痛是一个问题对于脊柱手术后病人,和它与异常的感觉1,2]。虽然在治疗已经取得了很大的进步,许多患者仍遭受慢性疼痛。神经性疼痛的分子机制仍然是阐明。最近,许多非编码rna在神经性疼痛已报告进展(24]。目前,我们表明,SNHG4在SNL调节大鼠模型。目前的数据证明SNHG4导致神经性疼痛通过触发神经炎症进展。此外,mir - 423 - 5 - p是预测的目标SNHG4我们发现mir - 423 - 5 - p在老鼠明显减少。Upregulation SNHG4逆转的mir - 423 - 5 - p的影响在神经性疼痛。

过度激活脊髓背角神经元的神经损伤后导致神经性疼痛的发展(25,26]。活化的小胶质细胞和星形胶质细胞可能导致后续生产过剩等炎症介质的TNF -α,il - 1β,il - 6 (27,28]。此外,抑制小胶质激活或星形活化可以有效减弱神经性疼痛恶化29日,30.]。

之前,它已经表明,lncRNA SNHG4可以促进骨肉瘤的生长通过骗取mir - 224 - 3 - p,它可以预测一个贫穷的生存和复发(31日]。此外,SNHG4能促进宫颈癌发展通过调节mir - 206和YWHAZ [32]。这些表明SNHG4发挥了至关重要的作用在各种癌症。目前,我们发现SNHG4 SNL鼠模型中增加。这些表明SNHG4可能为神经性疼痛的作用。然后,进一步研究函数的SNHG4 SNL老鼠的神经系统,LV-shSNHG4慢病毒是管理使用鞘内注射。我们发现的击倒SNHG4压抑的神经性疼痛恶化。强烈抑制了神经炎症SNHG4的损失。il - 6、il - 12和TNF -α被抑制而il - 10是SNHG4诱导的抑制。

通过使用生物信息学分析,mir - 423 - 5 - p被预测为SNHG4的目标。mir - 423 - 5 - p被报道为各种疾病的重要调节器。例如,mir - 423 - 5 - p是参与通过调节激活NF -狼疮肾炎κB和针对TNIP2 [33]。mir - 423 - 5 - p有助于temozolomide药物抗性恶性胶质瘤的34]。击倒mir - 423 - 5 - p可以增强神经胶质瘤干细胞敏感性芹黄素通过调节线粒体通路(35]。在卵巢癌,mir - 423 - 5 - p可以作为一个指标,可抑制增殖和入侵36]。此外,lncRNA AFAP1-AS1可以作为mir - 423 - 5 - p的龙头,它可以促进鼻咽癌通过调节ρ/ Rac途径[37]。在这里,我们发现mir - 423 - 5 - p是减少SNL模型。mir - 423 - 5 - p被SNHG4负监管,以及它们之间的直接联系是我们的调查验证。此外,SNHG4能够逆转的损失mir - 423 - 5 - p的影响抑制神经炎症和神经性疼痛。这些数据表明,SNHG4可以直接结合mir - 423 - 5 - p。然而,mir - 154 - 5 - p的角色在CCI老鼠仍不清楚。然后,基于生物信息学方法(http://starbase.sysu.edu.cn/),所以许多mRNA转录被预测。已报告一些mRNA转录参与神经性疼痛的发展,如STAT3和HMGA2。例如,过度mir - 98减少神经性疼痛的针对STAT3 (38]。通过针对STAT3 (mir - 93缓解神经性疼痛35]。HMGA2 mir - 98的差别此外,对这些压制神经性疼痛(39]。在未来的研究中,我们要做更多的调查澄清的潜在机制mir - 423 - 5 - p在神经性疼痛。综上所述,目前的研究表明,抑制SNHG4 SNL老鼠可能通过抑制神经炎症减少神经性疼痛。这表明SNHG4可能作为新的目标在人类治疗神经性疼痛,可为神经性疼痛的患者提供一个新的干预策略。然而,这应该是验证的病人。

5。结论

总之,我们发现SNHG4诱发神经性疼痛进展通过骗取mir - 423 - 5 - p在SNL模型大鼠。

缩写

SNHG4: 小核仁的RNA宿主基因4
lncRNAs: 长非编码rna
肿瘤坏死因子-α: 肿瘤坏死因子-α
IL: 白介素
SNL: 脊神经结扎
ELISA: 酶联免疫吸附试验
存在: 定量实时聚合酶链反应
CCK-8: 细胞计数Kit-8
EdU: 5-Ethynyl-2 - - - - - -脱氧尿苷
撕裂: RNA免疫沉淀反应试验。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

ZX和LW构思和设计研究;XP写的手稿。XP、CS和决断力进行实验,收集数据,并做了分析;ZX修订后的手稿。所有的作者批准最终的证据。

确认

这部分工作是支持由中国国家自然科学基金(批准号81772044)。