文摘

动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎性疾病,和巨噬细胞发挥关键作用的所有阶段。最近的研究表明,mir - 221是一个生物标志物和中风;然而,mir - 221的作用和机制尚不清楚。在此,我们发现mir - 221和NCoR水平减少ox-LDL-treated THP-1-derived巨噬细胞。种能阻碍DNMT3b相比之下,il - 6和TNF -α在这些条件下表达水平增加。Upregulation mir - 221或NCoR能部分抑制ox-LDL-induced il - 6和TNF -α表达式。种能阻碍DNMT3b进一步的研究表明,mir - 221的目标。DNMT3b抑制抑制il - 6和TNF -α表达和增加NCoR表达ox-LDL的存在。种能阻碍DNMT3b此外,参与ox-LDL-induced NCoR DNA甲基化在启动子区域。这些发现表明,mir - 221抑制ox-LDL-induced通过抑制炎症反应DNMT3b-mediated NCoR DNA甲基化在启动子区域。这些结果提供了一个理由使用胞内mir - 211作为一个可能的antiatherosclerotic目标。

1。介绍

动脉粥样硬化(AS)及其并发症,如心肌梗死和中风,是主要的全球威胁生命的疾病,对患者和他们的家庭沉重的经济负担(1]。巨噬细胞介导的炎症反应中扮演关键角色的整个过程,从开始到发展,包括角色在动脉内皮损伤,动脉粥样硬化斑块的形成,和斑块破裂2,3]。因此,抑制炎性反应可能会推迟斑块形成和发展(4- - - - - -8]。

小分子核糖核酸(microrna)短非编码rna扮演了重要的角色在控制新陈代谢,函数,并通过目标基因转录后的调控真核生物的命运。microrna的表达和异常位置在某些时刻参与多种疾病的发生和进展,包括癌症、神经发育疾病、自身免疫性疾病和炎症9]。多项研究表明,microrna发挥关键作用,调节胆固醇体内平衡,动脉粥样硬化的发展,和斑块形成和破裂10]。我们之前的研究表明,mir - 155介导的炎症反应和斑块形成小鼠模型(8]。最近的研究表明,mir - 221是一个生物标志物,中风,局部动脉粥样硬化行为,与斑块稳定性(11- - - - - -13]。另一项研究表明,mir - 221超表达了lncRNA增长arrest-specific 5 (GAS5),同时提高了ox-LDL巨噬细胞炎症反应(14]。然而,mir - 221的作用和精确的机制的炎症反应仍然未知。

DNA甲基化是一种表观遗传改变,接触各种刺激后发生在真核生物。这个过程包括DNA甲基转移酶(DNMTs),如种能阻碍DNMT3B DNMT3A和绑定,通过甲基胞嘧啶核苷酸在CpG位点,形成5-methylcytosine (5 mc)和导致基因转录抑制15]。之前的研究表明,异常的DNA甲基化在基因启动子区域通常相关(16- - - - - -20.]。问题等人表明STAT1的甲基化水平,IL12b, MHC2,进气阀打开,JAK1和JAK2冠心病(CAD)患者高于对照组(21]。另一项研究表明DNA程度增加的demethylase TET1和减少动脉粥样硬化斑块的DNMT1水平(22]。此外,抑制雌激素受体(ER)的启动子甲基化α通过mir - 152绑定DNMT1 ER表达增加,有一个antiatherosclerotic效应通过抑制人类主动脉平滑肌细胞(HASMC)扩散23]。因此,调节DNA甲基化状态的基因的启动子区域是一种新型的预防战略发展。

核受体辅阻遏物(NCoR)辅阻遏物复合体是一个主要组成部分,含有组蛋白deacetylase-3 (HDAC) transducin beta-like蛋白1 (TBL1)及其受体TBLR1。这个复杂的扮演着一个很重要的角色,核受体转录抑制绑定unliganded启动子区域的核受体,如甲状腺激素受体(TR) [24- - - - - -27]。瓦格纳和他的同事们发现,NCoR抑制人类孕激素受体(PR)转录活性和8-bromo-cAMP中断之间的交互公关和NCoR和增强公关转录活动(28]。同样,删除USP44, NCoR不可或缺的组成部分,受损的能力NCoR调节基因的表达和抑制乳腺癌细胞侵袭性(29日]。因此,NCoR起着重要的作用在调节基因表达和细胞功能。

在这项研究中,我们评估mir - 221的表达的启动子甲基化后NCoR THP-1-derived巨噬细胞暴露于ox-LDL辨认小说机制mir - 221规定了ox-LDL-induced炎症反应。在这里,我们报告ox-LDL抑制mir - 221的表达,促进NCoR启动子DNA甲基化。mir - 221超表达抑制ox-LDL-induced炎症反应通过种能阻碍DNMT3b绑定目标基因和增加NCoR表达式。综上所述,我们的数据表明,mir - 221可能扮演一个关键的角色在小说监管机制,调节NCoR信号和潜在的病理。

2。方法和材料

2.1。材料和试剂

rpmi - 1640培养基、DMEM Opti-MEM™降低血清培养基(Opti-MEM介质),胎牛血清(的边后卫)和胰蛋白酶包含2.21毫米EDTA获得GIBCO(上海,中国)。从北京Union-Biology Ox-LDL得到有限公司(中国,北京)。ViaFect™转染试剂,microrna的第一链cDNA合成装备,通用的定量PCR主结构,荧光素酶报告基因检测装备,DNeasy血液和组织装备,和重亚硫酸盐处理DNA甲基化™工具买来Promega生物科技有限公司(中国,北京)。T-PER™组织蛋白提取试剂购自ThermoFisher有限公司(上海,中国)。核和胞质蛋白提取设备购买从Beyotime生物技术(南通,中国)。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和止动剂西方化学发光合衬底(ECL工具包)从默克密理博有限公司购买(上海,中国)。O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate (PMA)、试剂盒试剂和其他试剂购买和用作收到Sigma-Aldrich(上海,中国)。

2.2。细胞培养、分化和Ox-LDL治疗

THP-1细胞和293 t细胞是干细胞银行提供的请中国科学院(中国上海)。THP-1在rpmi - 1640细胞培养中有10%的边后卫和1%的抗生素。THP-1细胞治疗48 h 100海里PMA诱导巨噬细胞分化[30.,31日]。巨噬细胞是治疗20μg / ml ox-LDL表示时间。

293 t细胞在DMEM培养,10%的边后卫。细胞通过用0.25%胰蛋白酶和胰蛋白酶化种子细胞培养板上进行进一步的研究。

2.3。瞬时转染mir - 221模拟和抑制剂

mir - 221模拟和抑制剂序列5 - - - - - -ACCUGGCAUACAAUGUAGAUUU-3 和5 - - - - - -AGCTAAAAAAGCTACATT GTCTGCTGGGTTTCG-3 ,分别。消极的控制(数控)序列5 - - - - - -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 。所有寡核苷酸合成了GenePharma(上海,中国)。THP-1细胞被播种到6-well盘子和培养过夜。这些细胞转染100海里mir - 221模拟或抑制剂和50 nM数控使用ViaFect™转染试剂48 h。然后,这些细胞分化成巨噬细胞进行进一步的研究。

2.4。DNMT3b沉默和NCoR超表达

种能阻碍DNMT3b的siRNA序列5 - - - - - -CACTGGTTCTGCGCTGGGA-3 (siRNA-1) 5 - - - - - -GGGUUAAAGCGGAGACUCUTT-3 (siRNA-2)和5 - - - - - -GCUGUCCGAACUCGAAAUATT-3 (siRNA-3)。这些siRNAs和数控转染到THP-1细胞48 h根据制造商的指示和分化成巨噬细胞进行进一步的研究。

一个NCoR超表达腺病毒(放置NCoR)和空载体腺病毒(模拟)生产和纯化根据Hanbio标准技术有限公司(上海,中国)。THP-1细胞被播种到6厘米菜肴和培养24小时。然后,放置NCoR ( )和模拟( )被用来感染THP-1细胞24 h。培养基被丢弃的,添加了一个新的媒介文化对额外的24小时。这些细胞和PMA分化成巨噬细胞。

2.5。总RNA隔离和实时PCR

治疗细胞收获,总RNA分离使用试剂盒试剂根据制造商的协议。microrna的第一链cDNA合成装备和环球定量PCR (qPCR)主混合用来评估mir - 221的表达根据制造商的协议。U6被用作控制mir - 221正常化。mRNA分析,生成的互补使用RevertAid第一链cDNA合成装备和qPCR进行使用BIO-RAD CFX96系统。GAPDH是作为内部控制。所有的数据进行了分析使用2-ΔΔt方法。这些检测引物用于补充表所示1。

2.6。西方墨点法

总从治疗细胞和核蛋白质收集使用T-PER™组织蛋白质提取试剂和核和胞质蛋白提取工具根据制造商的协议。蛋白质提取分离通过sds - page然后electrophoretically转移到PVDF膜。种能阻碍DNMT3B孵化了PVDF膜主要抗体(CST,很多:# 57868)(1:500),NCoR (CST,很多:# 34271)(1:1000),GAPDH (CST,很多:# 5174)(1:2000),和组蛋白H3 (CST,很多:# 4499)(1:1000)在一夜之间在4°C。HRP-labeled二级抗体膜和孵化发现使用一个发射极耦合逻辑系统。

2.7。NF -κB活性测定

荧光素酶记者pNF——虽然κB是转染到THP-1细胞使用ViaFect™转染试剂48 h,而这些细胞然后用G418培养基中孵化。选择性培养基是改变每一个2 d直到耐药克隆出现。所选的克隆(luc-pNF -κB-THP1)保持在一个新鲜G418-containing媒介分析和进一步的实验。pRL Renilla荧光素酶控制记者向量被转染进luc-pNF -κB-THP1细胞,进行荧光素酶化验根据制造商的协议。

2.8。Methylation-Specific聚合酶链反应(MSP)

NCoR CpG岛在启动子区域的分析,和一个MSP引物设计MethPrimer 2.0网站(32]。基因组cDNA从巨噬细胞制备DNeasy血液和组织装备和亚硫酸氢处理使用EZ DNA甲基化™工具。然后,亚硫酸氢样品被PCR扩增。这个分析引物用于补充表所示1。

2.9。荧光素酶报告实验

野生型和突变序列的3 种能阻碍DNMT3b UTR的合成和插入到SpeI HindIII网站pMIR-reporter荧光素酶的向量。这两个质粒构建被测序验证。荧光素酶报告实验的细节描述了在我们之前的研究8]。

2.10。量化的il - 6和TNF -α在巨噬细胞培养上清液

il - 6和TNF -α在巨噬细胞文化上层的量化水平BioLegend LEGENDplex™工具根据制造商的指示33]。短暂、文化上层清液收集后巨噬细胞被视为表示。上层清液的孵化与LEGENDplex珠子与抗体和streptavidin-PE 2 h,然后。流式细胞术分析了珠子,数据分析使用LEGENDplex软件(BioLegend)。

2.11。统计分析

数据表示为 (S.E.),从至少三个独立的实验。双尾学生的 - - - - - -测试和单向方差分析(方差分析)进行。被定义为显著差异 。

3所示。结果

3.1。mir - 221镇压Ox-LDL-Induced巨噬细胞的炎症反应

在这项研究中,我们调查了mir - 221表达式后THP-1 cell-differentiated巨噬细胞治疗与ox-LDL(图1(一))。数据显示,mir - 221表达是24小时和48 h组低于0 h组( ),和ox-LDL诱导mir - 221剂量依赖性的方式。与之前研究的结果一致,NF -κB活动和il - 6和TNF -αmRNA水平提高与ox-LDL细胞治疗后(数字1 (b)- - - - - -1 (d))。此外,NF -κB活性降低ox-LDL / mir - 221模拟组比ox-LDL / NC组( )。没有区别NC组和mir - 221模拟单独组( )(图1 (e))。巨噬细胞治疗后炎症介质检测mir - 221模拟和ox-LDL。mir - 221 upregulation可以部分逆转增加il - 6和TNF -α表达式由20μg / ml ox-LDL和数控(数字1 (f)和1 (g))( )。这些数据表明,mir - 221抑制炎症介质的产生。

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图1
mir - 221抑制ox-LDL-induced巨噬细胞炎症反应。(模拟)mir - 221的表达,il - 6和TNFα和活动的NF -κB被qPCR检测与ox-LDL THP-1-derived巨噬细胞治疗后在指定时间( )。 ,与0 h组;^ ,与24小时组。(eg) NF -κB活动和il - 6和TNF -α表达荧光素酶试验进行评估,qPCR,和流式细胞术(FCM)与mir - 221模拟THP-1细胞转染后48 h,分化成巨噬细胞,并与ox-LDL孵化24小时( )。 ,与NC组;^ ,与ox-LDL / NC组;# ,和mir - 221模拟组。
3.2。DNMT3b mir - 221的目标基因

mir - 221通过直接目标调节炎性反应。在这项研究中,荧光素酶质粒含有野生型(WT)和突变种能阻碍DNMT3b(傻瓜)3 utr(示意图如图2(一个))转染到hek - 293 t细胞和mir - 221模拟或miR-NC随后转染到这些细胞24 h。种能阻碍DNMT3b荧光素酶活动水平较低的WT / mir - 221模拟组种能阻碍DNMT3b比WT / NC组( )。种能阻碍DNMT3b之间没有不同的荧光素酶活性的狗种能阻碍DNMT3b / mir - 221模拟和狗/ NC组( )(图2 (b))。种能阻碍DNMT3b进一步证实,mir - 221的直接目标,我们评估了种能阻碍DNMT3b蛋白质的表达和巨噬细胞治疗后NCoR mir - 221模拟或抑制剂。这些数据显示种能阻碍DNMT3b减少和增加NCoR蛋白质含量与mir - 221细胞治疗后模拟(图2 (c))。种能阻碍DNMT3b相比之下,蛋白表达增加,NCoR蛋白表达减少,当细胞接受mir - 221抑制剂(图2 (d))。种能阻碍DNMT3b这些数据表明是mir - 221的目标基因。

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图2
DNMT3b直接mir - 221的目标。(a)预测mir - 221之间的对齐序列和野生型(WT)和突变(傻瓜)3 种能阻碍DNMT3b utr的。(b)一种能阻碍DNMT3b荧光素酶试验评估的记者活动WT和狗3 293年utr t细胞( )。 ,与NC组。(c, d)种能阻碍DNMT3b免疫印迹检测蛋白质的表达和NCoR THP-1-derived巨噬细胞转染后mir - 221模拟或抑制剂48 h ( )。 ,与NC组。
3.3。DNMT3b击倒部分逆转在巨噬细胞炎症信号激活

小干扰rna寡核苷酸被转染到THP-1细胞种能阻碍DNMT3b三种能阻碍DNMT3b评估的有效抑制表达,种能阻碍DNMT3b qPCR和免疫印迹显示信使rna和蛋白质水平显著下降。种能阻碍DNMT3b此外,siRNA益生元(02)是更有效地比其他核种能阻碍DNMT3b推倒寡核苷酸(数字3(一个)和3 (b))。NF -水平κ种能阻碍DNMT3b B活性较低的比数控/ / ox-LDL组ox-LDL集团( )(图3 (c))。il - 6和TNF -的水平α种能阻碍DNMT3b也低/ ox-LDL组比数控/ ox-LDL集团( )(数据3 (d)和3 (e))。此外,种能阻碍DNMT3b沉默部分阻塞ox-LDL-induced NCoR mRNA和蛋白表达(数字3 (f)和3 (g))。此外,种能阻碍DNMT3b沉默mir - 221细胞后表达增加处理ox-LDL(补充图1)。种能阻碍DNMT3b这些数据表明,调节通过NCoR ox-LDL-mediated巨噬细胞炎症反应。

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图3
种能阻碍DNMT3b消声减毒ox-LDL-induced通过增加NCoR巨噬细胞炎症反应。种能阻碍DNMT3b (a, b) mRNA和蛋白表达被qPCR评估,西方墨点法种能阻碍DNMT3b THP-1细胞转染后siRNAs 48 h和PMA诱导48 h ( )。 ,与NC组。种能阻碍DNMT3b THP-1细胞转染与siRNA和数控48 h和使用PMA 48 h。这些细胞治疗与ox-LDL 24 h。NF -κB活动(c)、il - 6和TNF -α信使rna表达(d)、il - 6和TNF -α文化水平上层清液(e), NCoR mRNA水平(f),和蛋白质水平(g)进行了分析使用荧光素酶测定,qPCR, FCM和免疫印迹( )。 ,与NC组;^ ,与ox-LDL / h NC组;# ,种能阻碍DNMT3b与核组。
3.4。种能阻碍DNMT3b Ox-LDL提升NCoR启动子的DNA甲基化

DNA甲基化在启动子区域是一个很重要的调节基因表达的机制。,启动子的CpG岛NCoR预测了李实验室网站(http://www.urogene.org/index.html)[30.),方案如图4(一)。ox-LDL诱导DNA甲基化MSP检测显示,NCoR启动子(图4 (b))。此外,种能阻碍DNMT3b的蛋白表达明显增加与ox-LDL巨噬细胞治疗后(图4 (c))。巨噬细胞也接受ox-LDL有或没有脱甲基代理5-Aza-dC。NCoR mRNA和蛋白表达的巨噬细胞在ox-LDL / 5-Aza-dC组高于仅ox-LDL集团( )(数据3 (d)和3 (e))。这些数据表明,ox-LDL诱导DNA甲基化的种能阻碍DNMT3b NCoR启动子的参与。

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DNMT3b参与NCoR ox-LDL-mediated基因启动子甲基化。(一)示意图NCoR CpG岛在启动子区域的。(b) MSP NCoR用于分析DNA甲基化的启动子区域( )。(c)种能阻碍DNMT3b免疫印迹分析的蛋白表达与ox-LDL THP-1-derived巨噬细胞治疗后( )。 ,与NC组;(d, e)的蛋白质和mRNA表达NCoR被qPCR评估,西方墨点法与ox-LDL THP-1-derived巨噬细胞被刺激后存在与否的5 - - - - - -阿扎( )。 ,与NC组;^ ,与ox-LDL组。
3.5。NCoR缓解il - 6和TNF -的生产α

在这项研究中,NCoR mRNA和蛋白表达水平的评估后巨噬细胞治疗与20μ克/毫升ox-LDL。数据显示NCoR mRNA和蛋白表达水平的这组低于0 h组( )(数据5(一个)和5 (b))。探索在ox-LDL-induced NCoR炎症反应的作用,巨噬细胞感染了放置HA-NCoR或放置公顷(模拟)48 h。数据5 (c)和5 (d)表明,蛋白质和NCoR显然是更高的信使rna表达水平放置NCoR组比模拟组( )。此外,il - 6和TNF的表达水平α低ox-LDL /睡觉。NCoR组比ox-LDL /模拟组( )(数据5 (e)和5 (f));此外,mir - 221的表达没有明显改变(补充图2)。这些数据表明,NCoR缓解il - 6和TNF -的生产α,这表明NCoR镇压ox-LDL-induced炎症反应。

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NCoR过度抑制了ox-LDL-induced巨噬细胞的炎症反应。(a, b)的蛋白质和信使rna表达水平NCoR被免疫印迹检测,qPCR与ox-LDL THP-1-derived巨噬细胞治疗后在指定的时间点( )。 ,与0 h组;^ ,与24小时组。THP-1细胞转染与放置HA-NCoR 48 h和对待PMA 48 h。(c, d) NCoR的蛋白质和信使rna表达水平是评估THP-1细胞转染后放置NCoR 48 h ( )。 ,与模拟。(e, f) il - 6和TNF -的水平α在文化上层清液和信使rna被qPCR测量和FCM和ox-LDL巨噬细胞治疗后24 h ( )。 ,与NC组;^ ,与ox-LDL / NC组。

4所示。讨论

在这项研究中,我们报道了mir - 221 upregulation能部分抑制ox-LDL-induced炎症反应。我们已经表明,mir - 221种能阻碍DNMT3b调节NCoR表达式通过直接绑定并抑制其DNA甲基化活动,导致抑制炎性介质生产ox-LDL诱导的巨噬细胞。

mir - 221的作用在免疫和炎症反应是有争议的。赵等人证明了脂多糖(LPS)诱导mir - 221表达,和mir - 221超表达加强LPS-induced NF -κB激活和TNF -增加α通过绑定和il - 6水平目标基因表达A20 [34]。在内皮细胞,mir - 221 upregulation促进了NF -炎症反应κB-dependent方式(35- - - - - -37]。相比之下,mir - 221超表达中发挥着抗炎作用通过减少p38 / NF -内皮细胞κB水平(38]。mir - 221还结合TNF -α3 UTR并促进其降解[39]。mir - 221超表达了lncRNA GAS5,这增强了ox-LDL巨噬细胞炎症反应(14]。另一项研究表明,mir - 221超表达抑制ox-LDL巨噬细胞炎症反应(14]。在这项研究中,我们发现,mir - 221在调节巨噬细胞炎症反应中发挥着关键作用。我们发现ox-LDL抑制NF - mir - 221表达和增加κB推广活动和il - 6和TNF -α的水平。与其他研究结果一致(14),mir - 221超表达部分抑制NF - ox-LDL-induced激活κB和炎性介质生产。此外,mir - 221 upregulation也增加了NCoR水平。这些数据表明,mir - 221具有抗炎作用在ox-LDL-induced巨噬细胞炎症反应通过增加NCoR水平,抑制NF -的活动κ启动子。

DNA甲基转移酶调节共价添加甲基胞嘧啶残基在CpG二核苷酸,导致DNA甲基化在基因的启动子区域。玉等人发现ox-LDL诱导DNMT1巨噬细胞,增加DNMT1水平提升的进展通过甲基化过氧物酶体proliferation-activated受体(PPAR)启动子40]。在此,我们发现种能阻碍DNMT3b ox-LDL诱导巨噬细胞,和种能阻碍DNMT3b沉默NCoR表达增加,从而抑制NF -κ启动子的激活和减少炎性介质水平。种能阻碍DNMT3b此外,mir - 221的目标。鉴于上述数据,这些发现表明,mir - 221抑制了ox-LDL炎症反应通过抑制DNMT3b-mediated NCoR启动子的甲基化。

几项研究已经报道,NCoR调节炎症反应中起着重要的作用。NCoR位于炎症通路基因的启动子区域,如NF -κB和AP-1,和维护一个抑制状态没有配体(41,42]。炎症途径激活后TLR4或TLR2 NCoR脱离启动子区域的促炎的转录因子,导致越来越多的基因表达和炎性介质生产(43]。此外,监管NCoR表达式也控制炎症反应(44,45]。在目前的研究中,我们发现在接触ox-LDL NCoR水平的降低,NCoR hypermethylated启动子。此外,5-AZA DNA甲基转移酶的抑制剂,恢复NCoR表达式与ox-LDL细胞治疗后,NCoR可能差别表明对这些抑制NCoR启动子的转录活动。巴里斯等人表明Bcl6-SMRT / NCoR复杂抑制NF -的转录激活κB,约束ox-LDL-induced巨噬细胞炎症反应和预防进展(46]。此外,最低限度氧化LDL-induced NCoR去除趋化因子促进剂促进转录的炎性细胞因子在动脉粥样硬化病变(47]。与以前的研究结果一致,NCoR THP-1-derived巨噬细胞过度也在一定程度上扭转了ox-LDL-mediated诱导il - 6和TNF -α表达式。这些数据表明,恢复NCoR水平对炎症反应是一种有效的方法。

总之,mir - 221抑制炎症反应的表达下调DNMT3b-mediated DNA甲基化在启动子区域NCoR和动脉粥样化形成中发挥了重要作用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

历下杨金山你们设计的研究和实验。金山,Ruiwei郭,曾庆红蒙牛,延安段负责数据收集。金山和志华杨分析数据。金山你们起草了手稿。金山你们和历下杨修订后的手稿,所有作者同意最后的手稿。你们金山和吴桠溪同样这项工作。

确认

我们感谢美国杂志专家(http://www.aje.cn/)语言的援助在准备手稿。

补充材料

补充表1:PCR引物的序列。补充图1:qPCR mir - 221的表达分析。种能阻碍DNMT3b THP-1细胞转染与siRNA和数控48 h和使用PMA 48 h。这些细胞治疗与ox-LDL 24 h。 ,与NC组;^ ,与ox-LDL / h NC组。补充图2:qPCR mir - 221的表达分析。THP-1细胞转染与放置HA-NCoR 48 h和对待PMA 48 h。这些细胞治疗与ox-LDL 24 h。 ,与模拟组;^ ,与ox-LDL / h NC组。(补充材料)