同时服用依那西普和他克莫司治疗作用变弱关节炎进展通过抑制矩阵Metalloproteinase-3生产和Osteoclastogenesis在人类肿瘤坏死因子-α转基因小鼠

文摘

在目前的研究中,我们调查的影响和机制的作用用依那西普进行联合治疗,可溶性肿瘤坏死因子受体(我)Fc融合蛋白和钙调磷酸酶抑制剂他克莫司在关节炎的发展在人类肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)转基因小鼠(hTNF-Tg)。单药疗法服用依那西普和他克莫司的临床症状而不是影像学变化与小鼠关节炎的发展有关。相反,联合治疗显著抑制影像学进展,也改善了临床症状。两种药物的联合治疗表现出协同效应在减少血清矩阵metalloproteinase-3水平和外围CD11b的数量^高破骨细胞前体细胞。此外,他克莫司抑制细胞因子诱导破骨细胞分化与服用依那西普在一个协同起来在体外化验。有趣的是,他克莫司没有抑制反麻醉品的抗体的生产(ADAs)对道hTNF-Tg老鼠。这个结果意味着服用依那西普和他克莫司协同效应由于继发效应来源于压制他克莫司的ADA生产,但由于他们的主要影响。这些发现表明,伴随服用依那西普和他克莫司治疗可能是一个更好的治疗方案控制类风湿关节炎患者的疾病活动,特别是对于那些骨吸收。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种最常见的慢性炎性疾病,表现为进行性关节损伤伴有关节外表现如血管炎、继发性淀粉样变性,系统性并发症(1,2]。在过去的二十年里,RA的管理发生了翻天覆地的变化,由于有效的生物制剂的开发和建立基于临床证据的处理算法(3,4]。目前,传统合成疾病修饰治疗风湿病的药物(csDMARDs)经常使用结合生物DMARDs (bDMARDs)治疗RA的中等或高疾病活动。在许多情况下,推荐使用甲氨蝶呤联合治疗与bDMARDs因为重要的临床证据和熟悉的专家与甲氨蝶呤锚药物(4,5]。

在日本,他克莫司被批准用于治疗自身免疫性疾病,如类风湿性关节炎,红斑狼疮肾炎,溃疡性结肠炎,2005年,2007年和2009年,分别。他克莫司已报告是有效的,它显示了一个可接受的安全性在RA患者应对csDMARDs不足,包括甲氨蝶呤(6,7]。此外,有人建议附加他克莫司与bDMARDs可能改善临床结果,即使患者显示反应不足bDMARDs伴随甲氨蝶呤(8- - - - - -10]。这些发现表明他克莫司的使用可能是一个有价值的选择为禁忌症患者或应对bDMARDs不足和/或甲氨蝶呤。然而,伴随治疗的有效性bDMARDs结合他克莫司治疗RA的不如,结合其他csDMARDs调查。

来测试假设道,同时伴随着他克莫司是一种更可取的治疗方案来控制对类风湿性关节炎患者的疾病活动,我们验证了治疗风湿病的效果和服用依那西普和伴随他克莫司的行动模式使用hTNF-Tg鼠标模型,它反映特征的患者反应anti-TNF——不足α生物制剂(11]。

2。材料和方法

2.1。药物

服用依那西普(恩利®),重组人类我TNF受体融合到一个免疫球蛋白常数片段,购买从辉瑞(美国纽约)和生理盐水稀释(大冢制药工厂,德岛,日本)皮下管理(0.4毫克/毫升)。他克莫司是购自MedChemExpress(美国新泽西州蒙茅斯结)和悬浮在1%甲基纤维素(东京化工、东京、日本)解决方案口服(0.3毫克/毫升)。

2.2。动物

Nine-week-old半合子的男性hTNF-Tg C57BL / 6小鼠(1006线)获得Taconic生物科学(美国纽约伦斯勒理工学院)。老鼠被安置在12 h光暗周期的温度 和相对湿度 ,与免费的食物和水。所有试验程序进行了动物实验伦理委员会批准的亚由美制药公司。

2.3。关节炎的临床评估

二十小鼠随机分为以下四个治疗组根据他们的身体重量( ):车辆治疗组服用依那西普,他克莫司,联合疗法治疗组。老鼠皮下注射4毫克/公斤道,每周两次在3 -为期4天的间隔,口头给3毫克/公斤他克莫司每天一次,或两种药物管理根据治疗组4周。前台和后肢的老鼠在四周治疗期间每周检查两次。临床关节炎在每个鼠标得分如下:0,没有肿胀;1、轻微的肿胀;2、明显水肿的肿胀;和3,明显水肿的肿胀和关节僵硬。每个肢体分级,导致最高12分/鼠标。当天最后一个剂量后,老鼠在异氟烷麻醉的情况下牺牲,他们的脾脏被切除后流仪分析收集的血液腹部腔静脉。

2.4。关节炎的影像学评估

Arthritis-associated影像学变化hTNF-Tg老鼠评估使用UltraFocus数字摄影系统(Faxitron活组织检查的,图森市阿兹,美国)。三个观察员评估四肢的关节破坏蒙蔽的方式使用以下评分标准:0,没有接头的破坏;1、小关节破坏限制在一个单一的数字或睑板骨;2,标志着联合多个数字或睑板骨的破坏;和3,完全破坏的关节。四肢从每个鼠标进行评估,导致最高12分/鼠标。

2.5。组织病理学

前台和后肢标本每个鼠标在中和10%福尔马林固定缓冲溶液和脱钙10% ethylenediaminetetraacetate解决方案,直到骨头柔软。石蜡的四肢与苏木精染色(默克公司,达姆施塔特,德国)和伊红(默克公司)())与二甲苯deparaffinization之后(Mutokagaku、东京、日本)和蒸馏水水化。软骨损伤,骨质破坏、滑膜增生和浸润的炎症细胞在掌骨滑膜衬里,腕,跖骨,睑板,并使用光学显微镜指骨的关节进行了评估。组织病理学分数分配基于以下标准:0,没有变化;1,非常轻微的(轻微的焦点更改);2、轻微(温和的焦点更改);3、中等(严重的焦点更改或适度分散更改);4、严重(严重的弥漫性改变),导致最大每只老鼠每项得分为16。

2.6。确定反麻醉品的抗体;矩阵Metalloproteinase-1 Metalloproteinase-3, Metalloproteinase-9;和细胞因子水平

相对大量的反麻醉品的抗体(ADAs)血清样本测定的酶联免疫吸附试验(ELISA)。简单地说,96年的平底盘子被涂上一层1μ服用依那西普,g溶解在磷酸盐(Nacalai Tesque,京都,日本),每。一夜之间,盘子被孵化在4°C。与50 mM Tris-buffered盐水洗涤步骤进行渐变20 (pH值8.0)和0.05%(美国Bethyl实验室、蒙哥马利、TX)。阻止了在室温1小时50 mM Tris-buffered盐水(pH值8.0)和1% BSA (Bethyl实验室)。血清稀释被添加到井和孵化室温1小时。检测到特定的绑定使用peroxidase-labeled山羊anti-mouse免疫球蛋白,人类广告(美国SouthernBiotech、伯明翰、AL)在室温下30分钟。反应是由增加100μL (tetramethylbenzidine (Bethyl实验室)与100年30分钟,停止了μL 0.18 H₂所以₄(Bethyl实验室)。吸光度测量在450 nm使用标(PHERAstar FSX;BMG Labtech Ortenberg,德国)。水平的基质金属蛋白酶(MMPs)测定血清样本使用商用设备(研发系统,明尼阿波利斯,美国)按照制造商的指示。血清浓度的白介素(IL) 23日,IL - 1α,干扰素(IFN)γ主题趋化因子配体(CCL) 2, IL-12p70, il - 1β、il - 10、il - 6、IL-27 IL-17A,干扰素-β和集落刺激因子(gm - csf)测量使用bead-based multianalyte分析工具包(LEGENDplex™小鼠炎症面板;美国圣地亚哥BioLegend CA)按照制造商的指示。最低检测浓度如下:IL-23, 12.2 pg / mL;il - 1α2.44 pg / mL;干扰素-γ2.44 pg / mL;CCL2, 2.44 pg / mL;IL-12p70 2.44 pg / mL;il - 1β2.44 pg / mL;il - 10、2.44 pg / mL;il - 6、2.44 pg / mL;IL-27 12.2 pg / mL;IL-17A 2.44 pg / mL;干扰素-β12.2 pg / mL;和gm - csf, 2.44 pg / mL。

2.7。流式细胞术

红细胞裂解后,单细胞的脾细胞悬浮液每个鼠标与anti-mouse孵化集群分化16/32 (CD16/32)单克隆抗体(mab) (93;BioLegend)阻止Fc受体抗体的非特异性结合。CD4细胞被沾anti-mouse CD11b,程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1) C-X-C趋化因子受体5 (CXCR5)类型,和B220 CD45R马伯(M1/70 GK1.5, 29 f。分别1 a12 L138D7和RA3-6B2;与ZombieNIR BioLegend),其次是死细胞染色(BioLegend)。数据是使用细胞分选仪SH800S(索尼、东京、日本)和分析FlowJo软件版本10(美国或树明星,亚什兰)。

2.8。细胞培养

小鼠单核细胞/巨噬细胞生264.7细胞(日本住友制药,大阪,日本)是生长在最少的必要媒介α(Nacalai Tesque)和10%(补充 )heat-inactivated胎牛血清(擤鼻涕、Nuaille、法国),100 U /毫升青霉素,100μ和光纯化学工业,g / mL链霉素(kouichi大阪,日本)在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂在空气中。破骨细胞的分化,264.7原始细胞(在96 - 5000细胞/板)是培养10 ng / mL的核因子k B受体激活剂配体(RANKL;研发系统)为2天,然后细胞被刺激10 ng / mL RANKL和人类肿瘤坏死因子- 10 ng / mL重组α(研发系统)存在与否的药物3天。

2.9。细胞生存能力分析

细胞生存能力是决定使用细胞计数Kit-8 (Dojindo、熊本、日本)按照制造商的指示。简单,刺激10 ng / mL RANKL和人类肿瘤坏死因子- 10 ng / mL重组α存在与否的药物3天,10μL细胞计数Kit-8化验试剂添加到每个好,和450海里的吸光度测量使用标。

2.10。体外Osteoclastogenesis

积极Osteoclastogenesis被量化评估细胞染色的陷阱。短暂,细胞在96孔板与10%的中性缓冲福尔马林固定解决方案5分钟然后染色使用陷阱染色工具包(Cosmo生物、东京、日本)。在光学显微镜下,观察破骨细胞与三个或更多TRAP-positive多核细胞,和他们在每个计算总数。

2.11。统计分析

统计分析进行使用单向方差分析和多重比较Dunnet多重比较的测试或钢的测试根据Bartlett的测试的结果和克鲁斯卡尔-沃利斯检验紧随其后joint-ranking Dunnett的多重比较检验。统计分析是由一个单比较 - - - - - -其次是学生的测试 - - - - - -测试或Aspin-Welch测试(EXSUS;CAC Croit,日本东京)。被认为是在统计上显著的差异值小于0.05。

3所示。结果

3.1。结合治疗服用依那西普和他克莫司变弱hTNF-Tg小鼠关节炎进展

服用依那西普,我们调查了影响他克莫司,综合治疗关节炎的进展hTNF-Tg老鼠。关节炎的发病的最初迹象在小鼠观察到9周时,意味着临床评分随着年龄增加治疗组(图1(一))。单独服用依那西普治疗导致显著减少关节炎的临床分数意味着10周时,尽管没有显著差异栏和车辆之间可以检测到治疗组小鼠的12周或后的时代。他克莫司和它用依那西普进行联合治疗明显减毒的临床评分在治疗期间,有统计学意义( )。我们也评估了影像学变化与关节炎小鼠的治疗时期。如图1 (b)四肢、关节破坏的观察在治疗组,而联合治疗显著抑制引起的关节破坏得分的价格相比治疗组(也看到补充图1)。均值联合破坏得分在每个单药治疗组略低于治疗组,但差异不显著。估计造成的副作用治疗相结合,我们也评估体重增长和器官重量的老鼠在这项研究。然而,我们找不到任何统计组(补充图之间的区别2)。

组织病理学研究表明,hTNF-Tg老鼠发达多发性关节炎,滑膜增生、炎症、骨头和软骨破坏和炎性细胞浸润到滑膜(图2),如前面描述的(11]。如表所示1、辨道,或者他克莫司治疗并不影响组织病理学变化与关节炎的发展有关,而他们的联合疗法显然倾向于抑制变化。这些发现表明,联合治疗提高了衰减与关节炎的进展相关的关节损伤hTNF-Tg老鼠。

3.2。他克莫司不抑制ADA开发和Etanercept-Induced B220的增加⁻CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺T卵泡辅助细胞

我们检查了ADAs的存在对道hTNF-Tg老鼠服用依那西普的ADAs导致不足。除了ADAs的测量,我们调查B220的数量⁻CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺T卵泡辅助(Tfh)细胞,B细胞发育中扮演关键的角色,体液免疫反应12),为进一步研究药物对ADA开发的影响。如表所示2服用依那西普(皮下管理4毫克/公斤,4周每周两次)明显诱导ADA对道的发展,而口服他克莫司治疗(3毫克/公斤,每天一次4周)没有抑制它。同样,B220的百分比⁻CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺服用依那西普组Tfh细胞明显高于汽车集团,而他克莫司没有抑制etanercept-induced B220的增加⁻CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞(图3)。

3.3。结合治疗服用依那西普和他克莫司hTNF-Tg小鼠血清MMP-3水平降低

hTNF-Tg小鼠的血清MMP-3水平联合治疗组显著低于车辆和每个单一药物治疗组(表中3)。虽然血清金属蛋白酶- 1水平也道,加上他克莫司组显著低于车辆组无显著差别血清中可观察到金属蛋白酶- 1水平之间的每个单一药物治疗组和联合治疗组。关于血清MMP-9水平,两组之间没有统计上的显著差异。IL-23,我们还研究了各种炎性细胞因子il - 1α干扰素-γCCL2 IL-12p70, il - 1β、il - 10、il - 6、IL-27 IL-17A,干扰素-β在血清样本,gm - csf。虽然我们可以检测这些细胞因子的检测范围内,没有观察到显著差异之间的任何药物治疗组和治疗组(数据未显示)。

3.4。他克莫司和道,减少外围CD11b综合治疗^高破骨细胞前体在hTNF-Tg老鼠

一项研究表明数量的外围CD11b升高^高破骨细胞前体((ocp) hTNF-Tg老鼠(13]。评估每一个药物治疗是否会影响到周边CD11b人口^高(ocp,它们的数量取决于流仪分析。仅用依那西普进行治疗和单独使用他克莫司的外围CD11b比例下降^高(ocp显著差异(图4)。此外,周边CD11b人口^高联合治疗组(ocp是比其他组小得多。

3.5。服用依那西普和他克莫司协同影响体外监测分化

如前所述,我们的研究结果表明,伴随治疗服用依那西普和他克莫司似乎发挥协同和/或添加剂影响破骨细胞病理炎症环境中细胞分化hTNF-Tg老鼠。为了证实这一点,我们研究了每种药物的影响和RANKL和肿瘤坏死因子联合治疗α全身的细胞分化的原始264.7到TRAP-positive osteoclast-like细胞。如图5(一个)264.7原始细胞RANKL和TNF -刺激α彼此融合,分化成TRAP-positive多核细胞。仅用依那西普进行治疗和他克莫司的数量减少TRAP-positive剂量依赖性的方式,多核细胞显著差异在150 ng / mL和100海里的浓度,分别(图5 (b))。此外,TRAP-positive多核细胞联合治疗组比这低得多的单药治疗组在每个浓度。这些结果与初步评价TRAP-positive多核细胞计数hTNF-Tg老鼠的联合治疗药物(补充表1)。另一方面,264.7的原始细胞分化时没有被道生264.7细胞被刺激,RANKL(补充图3)。在相同的测试条件下细胞的存活率也检查,也没有降低速度在三个治疗组,观察与任何药物治疗组相比,在测试中使用的药物浓度范围(图5 (c))。

4所示。讨论

本研究表明,用依那西普进行综合治疗,他克莫司的外围CD11b数量减少^高(ocp和血清MMP-3水平和减毒hTNF-Tg小鼠关节炎的进展。此外,结合治疗协同影响264.7原始细胞的分化成TRAP-positive osteoclast-like细胞。此外,服用依那西普hTNF-Tg老鼠引起政府ADAs的发展,而他克莫司没有抑制ADA生产。这些研究结果表明,与此同时服用服用依那西普和他克莫司对添加剂和/或协同抑制关节炎的进展,主要通过抑制MMP-3生产、CD11b^高(OCP动员和破骨细胞分化,但并不影响ADA生产。

在目前的研究中,我们使用hTNF-Tg老鼠来分析药物的治疗风湿病的影响,因为模型股票几个临床、组织病理学、免疫学和RA的发病的特性在人类14,15),反映患者反应anti-TNF——不足α生物制剂(11]。

与之前研究的结果一致(11),道,单一疗法抑制小鼠临床关节炎的进展;然而,药物的疗效是减毒的时间天。最近,Arnoult等人报道,一个静脉注射anti-TNF -α马伯诱导C57BL / 6野生型小鼠ADAs的发展(16]。他们的研究结果也显示,艾达生产被TNF -诱导α/ anti-TNF -α马伯免疫复合物。这份报告让我们检查是否诱导ADAs反对道,因为道,形成了一个与TNF -免疫复合物αhTNF-Tg老鼠,我们发现ADAs服用依那西普治疗组的血清。基于这一发现,它似乎是合理的假定的原因之一服用依那西普在本研究不足的生产ADAs反对道。此外,我们不能发现抑制他克莫司对ADA的影响生产,同时出现,他克莫司不影响周边B220的数量⁻CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞,诱导的道。这些发现表明,他克莫司不抑制炎症ADA生产环境hTNF-Tg老鼠。

ADAs经常生物疗法通过抑制或减弱的临床功效中和它们的活动和减少药物的半衰期。从这个角度来看,药物抑制ADA开发,如甲氨蝶呤,可取伴随药物在RA治疗(17]。然而,ADAs已经提出反对道,不是中和抗体和不与临床反应(18- - - - - -20.]。因此,我们相信,即使它不能抑制ADAs的发展,他克莫司可能是一个很好的治疗方案代替甲氨蝶呤用依那西普进行相应治疗RA患者不耐甲氨蝶呤。

先前的研究已经表明,几种基质金属蛋白酶参与促进滑膜炎症、软骨破坏,骨吸收hTNF-Tg老鼠(20.]。尽管Zwerina等人已经证明了药理TNF -的封锁α英夫利昔单抗,人类/鼠标anti-TNF -嵌合α马伯,减少hTNF-Tg小鼠的血清水平的il - 1 (11),我们无法检测减少服用依那西普治疗组il - 1的水平。这可能是部分原因是行动的机制英夫利昔单抗和道之间的差异;英夫利昔单抗而不道,诱导细胞周期阻滞和调节细胞因子的表达由外到内信号通过跨膜TNF -α(21]。与我们的研究结果一致,Schett等人已清楚地表明,迫使表达式的金属蛋白酶组织抑制剂(20.),这是一种内源性抑制剂MMP-3 [22),改善了临床症状和减毒的联合破坏而不影响小鼠的血清炎性细胞因子水平。

债券等人认为核转录因子的激活(NF -κBκB),连同激活蛋白1 (AP-1)是至关重要的生长因子-或炎性细胞因子诱导MMP-3合成(23]。NF -κB RA滑膜的激活是一个常见的特性,并经常在外周血单核细胞,观察外周血细胞,单核细胞从RA患者24,25]。先前的报道表明NF -κB显著激活是肿瘤坏死因子引起的-α在这些细胞和被anti-TNF -α生物制剂(26]。此外,Migita等人证明了他克莫司能减弱AP-1转录激活通过废除c-Jun n端激酶1/2磷酸化在呈synoviocytes RA患者(27]。综上所述,道,管理与他克莫司对增强抑制性影响MMP-3生产通过阻断转录因子,NF -κB和AP-1, MMP-3合成所必需的。

进一步检查栏加上他克莫司的影响伴随治疗osteoclastogenesis,我们确定CD11b的频率^高在脾细胞的人口(ocp,基于早期发现李et al。(13]。结果显示,外围CD11b^高综合治疗(ocp显然是减少的,而每个单一药物治疗只显示适度anti-OCP效果。之前的一份报告表明,肿瘤坏死因子-α影响CD11b的招聘^高从骨髓(ocp到外围而不影响其增殖,分化,细胞凋亡(13]。因此,在外围CD11b etanercept-induced减少^高(ocp可能是因为他们减少了循环,从骨髓动员中和TNF -所致α。与我们的研究结果一致,科大等人最近报道,服用依那西普抑制antigen-induced小鼠关节炎的关节损伤模型不能通过直接抑制滑膜炎症,但通过减少(OCP供应从骨髓边缘(28]。在这项研究中,我们无法确定为什么他克莫司外围CD11b减少^高(OCP人口用依那西普进行协同。虽然我们假设他克莫司可能会影响生产的基质细胞衍生因子1和趋化因子(C-X3-C主题)配体1,负责监管的迁移(ocp [29日),我们无法检测这些化学引诱物,而不是至少在老鼠血清(数据未显示)。

众所周知,破骨细胞分化是由持续有效地诱导激活核转录因子的激活T细胞(NFAT)通过其协同c1和两个信号通路(30.),肿瘤坏死因子受体信号通路和RANKL-RANK通路。事实上,Takayanagi等人已经证明,钙调磷酸酶抑制剂他克莫司和环孢霉素等抑制RANKL-induced核易位NFATc1骨骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞前体细胞(桥梁养护管理系统)及其分化成TRAP-positive多核细胞(30.]。除了激活细胞内TNF -α受体信号通路在桥梁养护管理系统,TNF -α也间接促进了桥梁养护管理系统的分化为破骨细胞通过增强RANKL的表达和几种类型的细胞巨噬细胞集落刺激因子(31日,32]。因此,服用依那西普和他克莫司osteoclastogenesis协同抑制作用,观察到在目前的研究中,可能是由于阻断TNF受体和RANKL-RANK通路,导致完全抑制NFATc1激活。

5。结论

总之,同时服用依那西普和他克莫司治疗减毒增效剂hTNF-Tg小鼠关节炎的进展。虽然还需要进一步的研究来验证综合治疗作用的分子机制,抑制MMP-3生产,CD11b^高(OCP动员,破骨细胞分化的特征可能代表同时服用依那西普和他克莫司治疗。这些发现表明,伴随服用依那西普和他克莫司治疗可能是一个更好的治疗方案来控制对类风湿性关节炎患者的疾病活动,尤其是对于那些反应不足anti-TNF -α生物制剂或骨吸收。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

是和HA概念化实验;HM和监督研究女士;太,TK,党卫军处理样本,收集数据,在体内实验和评估关节炎;太分析《美国残疾人法》、细胞因子和MMP水平样本并进行体外osteoclastogenesis试验;分析了周边的人口B220吗⁻CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh和CD11b^高(ocp hTNF-Tg小鼠的脾脏;太进行数据的统计分析;和太导致写作手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

我们感谢女士Satomi渡边对她优秀的技术援助。

补充材料

补充图1:代表hTNF-Tg小鼠后肢的x射线图像。补充图2:体重增加和器官重量hTNF-Tg老鼠。补充图3:对264.7 RANKL-induced原始细胞分化的影响。补充表1:TRAP-positive跨国公司的数量在关节的关节面。(补充材料)

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