文摘

肿瘤微环境中富含多种细胞类型影响肿瘤的发展。巨噬细胞浸润肿瘤,最丰富的人口免疫细胞和分泌细胞因子。阿司匹林是一种chemopreventive代理与癌症发展。本研究调查了阿司匹林是否调节乳腺癌细胞和巨噬细胞之间的串扰。研究这些相互作用在肿瘤微环境,条件媒体采用使用4 t1乳腺癌细胞培养在原始264.7 cell-conditioned介质(RAW-CM)和cocultured模型使用的细胞。RAW-CM 4 t1细胞培养时,细胞有增加生存能力和细胞因子的分泌VEGF, PAI-1, TNF -α,il - 6。用阿司匹林治疗抑制4 t1细胞生长和迁移和MCP-1 PAI-1, il - 6生产。的coculture细胞,阿司匹林抑制分泌MCP-1, il - 6, TGF -β。此外,M2巨噬细胞标志CD206阿司匹林显著减少,但增加M1标记CD11c表达式。总之,阿司匹林治疗的串扰抑制4 t1和生264.7细胞通过调节血管生成和炎性介质生产和M1 / M2巨噬细胞亚型的影响。这突出显示,阿司匹林抑制肿瘤的微环境和可能是一个有前途的代理对三阴性乳腺癌。

1。介绍

乳腺癌是女性中最常出现的癌症在世界范围内,特别是在发达国家,全球发病率增加。2015年,世界卫生组织进行了统计分析,揭示每年大约有570000妇女死于乳腺癌,表明多达15%的女性是由于癌症死亡人数(1]。乳腺癌有多个组件组成的异构病理,包括肿瘤细胞和邻近的基质细胞,如脂肪细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞,发挥基础作用在正常乳腺发展以及乳腺癌致癌作用[2,3]。此外,肿瘤微环境的变化,如细胞外基质的变化,可溶性因子,和信号分子,刺激致癌作用和抗免疫反应(2]。这些不同的微环境在肿瘤进展和转移扮演关键角色。

复杂的肿瘤和免疫系统之间的相互作用已经引起了科学家的注意在过去的十年。简单地说,天然免疫与适应性免疫之间的动态交互发挥重要作用在肿瘤进展和抑制(4]。单核吞噬细胞是先天免疫细胞,保护个人免受有害的病原体和修复受伤的组织。然而,在肿瘤微环境中,恶性肿瘤招募循环等生产tumor-derived趋化因子单核细胞巨噬细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)和巨噬细胞集落刺激因子(MCSF),然后诱导单核细胞分化成肿瘤相关巨噬细胞(tam) [5]。在肿瘤微环境中,多个介质分泌和促进细胞增殖、迁移、血管再生,重塑内皮细胞(4),为肿瘤的生长和转移提供了有利条件,和适应性免疫的抑制6]。

巨噬细胞产生的慢性炎症介质发起者是至关重要的肿瘤微环境。巨噬细胞异质性包括分类到M1和M2巨噬细胞基于两个不同的表型,巨噬细胞极化的结果和不同特点的发展7]。M1巨噬细胞产生炎性细胞因子,唤起了适应性免疫反应。相反,M2巨噬细胞促进血管再生和伤口愈合,抑制自适应免疫反应(7]。有趣的是,tam像M2巨噬细胞和protumor属性在肿瘤微环境。几个研究小鼠肿瘤模型表明,tam促进肿瘤(8)和产生细胞因子和趋化因子,维持和扩大炎症状态(9]。因此,代理人有可能调整这种微环境已经被提议作为有效的未来癌症治疗(3,8]。

阿司匹林、阿司匹林、是一种非甾体类抗炎药物通常用于减少炎症和防止心脏病和中风10,11]。然而,在过去的二十年里,研究表明,定期使用阿司匹林对癌症中额外的有前途的角色(12]。这种炎症反应癌症的化学预防的阿司匹林被报道如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、和卵巢癌(10]。此外,越来越多的流行病学证据表明阿司匹林对乳腺癌(影响使用时13,14]。虽然阿司匹林是一种很有前途的chemopreventive代理,胃肠道副作用和最佳剂量是临床应用的重要考虑因素。因此,选择使用阿司匹林,如低剂量或组合治疗,一直不断提出。

目前,对阿司匹林在肿瘤免疫调节的作用,尤其在肿瘤微环境。本研究的主要目的是更好地了解乳腺癌的化学预防阿司匹林,可调节免疫反应在恶性肿瘤细胞和巨噬细胞在肿瘤微环境,以及影响这些细胞之间的串扰。这些见解可以提供潜在的策略来改善三阴性乳腺癌,如4 t1细胞,这是一种非常积极的与抵抗治疗乳腺癌15]。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和治疗

小鼠乳腺癌4 t1细胞线从美国购买类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和巨噬细胞生264.7细胞系购买从生物资源收集和研究中心(BCRC、新竹、台湾)。细胞系都在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(美国DMEM,沉箱,史密斯菲尔德,UT)含10%胎牛血清(美国,拉斯维加斯的边后卫,Genedirex NV) 1%的青霉素、链霉素、两性霉素B(沉箱)公司在湿润的气氛中为5%237°C孵化器。两个细胞系被用来准备条件培养基和cocultures在这项研究中。阿司匹林(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)是溶解在二甲亚砜(DMSO,σ)来生成一个股票的解决方案。汽车组的最后DMSO溶液的浓度为0.1%,相当于最高剂量阿司匹林治疗期间(2毫米)收到的细胞。

2.2。RAW-CM准备

264.7原始细胞,2.5×104细胞/嗯,被播种在6-well板块含有10%的边后卫/ DMEM和培养过夜。然后细胞培养24小时的存在与否100 ng / mL脂多糖(LPS,σ)在1%的边后卫/ DMEM根据先前的研究,与修改(16]。收集上清液,细胞碎片被离心之前,在实验中使用。

2.3。细胞生存能力分析

4 t1细胞被播种到96孔板的密度2×103细胞/(美国新泽西州,正欲富兰克林湖),同时接受0.5,1或2毫米的阿司匹林在媒体包含20、50岁或75%如果LPS-stimulated RAW-CM和1%的边后卫/ DMEM 24、48和72 h。治疗后,细胞在0.5毫克/毫升孵化3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、溴化5-diphenyltetrazolium MTT(σ)解决方案3 h。上层清液吸气,DMSO溶液添加到甲瓒晶体溶解,吸光度测量在540 nm使用光谱光度测量的标仪(美国BioTek Winooski, VT)。控制被认为是100%,细胞的可行性提出了每个样本的比例控制基于公式 ,在那里 , ,和 参考样品的吸光度,空白,分别控制在540海里。

2.4。细胞迁移试验

4 t1乳腺癌细胞迁移用愈合分析测量。来确定最优的浓度RAW-CM 4 t1细胞迁移,4 t1细胞培养在媒体包含20、50岁的边后卫RAW-CM 75%和3% / DMEM 24 h。细胞被播种在24-well盘子和孵化,直到80%融合。这种细胞单层使用20轻轻挠μL吸管,和媒体取代0.5,1或2毫米阿司匹林在新鲜培养基,50%如果RAW-CM,或50% LPS-stimulated RAW-CM 24 h。细胞被认为,通过显微镜成像配备照相机(WS500、涂白、桃园、台湾)100 x放大。然后,疗愈的图像与微尺度的图像测量软件(漂白的)。

2.5。细胞因子的生产以ELISA

4 t1细胞,2×104细胞/好,一夜之间被播种在48-well板然后在完全培养基处理2毫米阿司匹林或50% RAW-CM 72 h。文化收集上层清液,细胞因子的水平,包括MCP-1 (BioLegend、圣地亚哥、钙、美国),VEGF(美国新泽西Peprotech,落基山),PAI-1, TNF -α、il - 6和TGF -β(研发、明尼阿波利斯,美国),通过ELISA测定根据制造商的指示。一夜之间,短暂,盘子被涂捕获抗体,然后洗和阻塞。洗后,文化上层清液添加到盘子,盘子孵化2 h。洗后,板块首先被孵化检测抗体,与辣根peroxidase-conjugated下链霉亲和素,最后与衬底的解决方案。吸光度测量使用标(分子器件、桑尼维尔,美国)。细胞因子水平计算基于细胞因子标准曲线。

2.6。264.7 Cocultures 4 t1细胞和原始细胞

定义乳腺微环境在肿瘤发生中的作用,实验模型由4 t1小鼠乳腺癌细胞单独培养RAW-CM或cocultured 264.7原始细胞。模拟生理环境中巨噬细胞浸润到周围地区乳腺癌细胞,生264.7和4 t1细胞cocultured在同一的6-well盘子1×10的密度5和4×105细胞/。细胞被保持在1%的边后卫/ DMEM和处理2毫米阿司匹林72 h。文化上层的收获和储存在−20°C到细胞因子水平由ELISA测定。

2.7。264.7原始细胞特征

巨噬细胞的存在与否是孵化阿司匹林72 h和培养在控制中,存在的有限合伙人的最后24小时孵化,或cocultured 4 t1细胞72 h。评估表面标记表达式,原始264.7和4 t1细胞收集72 h后coculturing和彩色的孵化与荧光素FITC anti-mouse CD11c和Alexa萤石647 anti-mouse CD206单克隆抗体(索尼生物技术有限公司)在4°C在黑暗中30分钟。洗后,可行的细胞被沾染了赫斯特33342年(ChemoMetec、Allerød、丹麦)和受到FlexiCyte fluorescence-activated细胞排序分析。每个表面标记细胞表达的频率取决于NucleoCounter nc - 3000 (ChemoMetec)和分析使用NucleoView nc - 3000软件(ChemoMetec)。表达式使用平均荧光强度的量化标志的兴趣。

2.8。统计分析

结果提出了均值±SEM和编译的至少三个独立的实验。组间显著差异被单向方差分析与最小显著差事后测试使用IBM统计产品与服务解决方案(SPSS版本19)。一个 小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。生264.7 Cell-Conditioned媒体影响4 t1乳腺癌细胞生存能力和迁移

模仿巨噬细胞浸润到肿瘤组织的肿瘤生理环境和研究巨噬细胞介质的影响4 t1细胞生存能力,乳腺癌4 t1细胞培养在原始264.7 cell-conditioned媒体(RAW-CM),如图1。4 t1细胞培养在不同浓度的RAW-CM存在与否的脂多糖(LPS)刺激,并使用MTT检测细胞生存能力评估。文化条件缺乏模拟LPS刺激巨噬细胞浸润到乳腺癌微环境,而文化条件与模仿浸润LPS刺激巨噬细胞,由于炎症反应是活跃的。

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图1
4 t1细胞的生存能力在不同数量的原始264.7 macrophage-conditioned培养基培养(RAW-CM)。不同浓度的(a)如果和(b)有限合伙人100 ng / mL-stimulated macrophage-conditioned介质(RAW-CM) 25日,50,75%被用来培养4 t1细胞。细胞培养24、48和72 h,并使用MTT检测细胞活力测定。数据从至少三个独立的实验,提出了平均值±标准平均误差(SEM)。统计分析了使用单向方差分析和最小显著差(LSD)事后测试。 和 RAW-CM与控制(0%)。

累进增加4 t1细胞的数量与浓度的增加发生如果RAW-CM。细胞数量的增加,而控制RAW-CM(0%),发生在剂量依赖性的方式培养时间(图1(一)),这表明巨噬细胞促进乳腺癌细胞生长。相反的结果观察4 t1细胞培养时LPS-stimulated RAW-CM,期间4 t1细胞生存能力显著降低孵化项目24 - 72 h ( ,图1 (b))。这表明,介质被激活巨噬细胞分泌,导致毒性,从而减少癌细胞的数字。

愈合分析是用来分析细胞迁移,这是癌症转移的一项指标。细胞生长,直到汇合的单层和刮,然后愈合的细胞层的距离测量。4 t1细胞在3%的边后卫/ DMEM培养,也就是说,控制,表现出明显的愈合,而采用无血清细胞培养技术媒体,也就是说,消极的控制,没有。4 t1细胞迁移的距离超过24小时测量每个治疗条件,包括细胞孵化20、50岁和75% RAW-CM。RAW-CM收集从没有与LPS刺激的细胞自发的条件和被发现没有影响细胞迁移(图2(一个))。同时,RAW-CM从LPS-stimulated收集细胞抑制愈合后刮在剂量依赖性的方式(图2 (b))。迁移距离是衡量显微镜微尺度下,结果如图所示2 (c)。50 - 75% LPS-stimulated RAW-CM条件显著抑制细胞迁移( ),这是符合这个条件影响媒体4 t1细胞生存能力。

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图2
迁移4 t1细胞培养在不同数量的RAW-CM。移民模式4 t1细胞参与了挠领域培养细胞在20日24小时50,75% (a)或(b)如果LPS-stimulated RAW-CM然后监控伤口愈合。(c)距离测量通过显微镜下的微尺度和抑制百分比相对于控制。数据显示为±SEM和来自三个独立的实验。执行统计分析使用单向方差分析和LSD事后测试。 与控制(CM) 0%。
3.2。阿司匹林抑制4 t1乳腺癌细胞生长和迁移在原始264.7 Cell-Conditioned媒体

随后,我们调查了阿司匹林治疗是否影响4 t1乳腺癌细胞生长时不同macrophage-related条件下培养。4 t1细胞培养在RAW-CM模拟微环境与巨噬细胞浸润到周围地区乳腺癌细胞,然后细胞生存能力和迁移进行了评估。4 t1细胞处理1和2毫米阿司匹林降低了细胞的生存能力,如果和孵化LPS-stimulated RAW-CM 24 h,而4 t1细胞数量没有影响阿司匹林在完全培养基(图3(一个))。手机号显示更明显减少23% ( )和40% ( )如果RAW-CM细胞控制介质相比,当细胞治疗72 h和1或2毫米阿司匹林,分别(图3 (b))。然而,只有2毫米的高剂量阿司匹林抑制细胞生存能力LPS-stimulated RAW-CM。

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图3
阿司匹林的作用在RAW-CM 4 t1细胞培养的可行性。不同剂量的阿司匹林用于治疗4 t1细胞培养在50%如果或LPS-stimulated RAW-CM。细胞培养24 (a)或(b) 72 h,并使用MTT检测细胞生存能力评估。数据显示为±SEM和来自三个独立的实验。执行统计分析使用单向方差分析和LSD事后测试。 , , 与车辆控制。

探讨阿司匹林对4 t1细胞迁移的影响在RAW-CM愈合化验使用。在新鲜培养基培养4 t1细胞(图4(一)),如果RAW-CM(图4 (b)),或者LPS-stimulated RAW-CM(图4 (c))模仿macrophage-infiltrated微环境。阿司匹林没有影响细胞迁移在新鲜培养基(图4(一))。在如果RAW-CM, 0.5 - 2毫米阿司匹林显著延迟scratch-healing形式剂量依赖性的方式( 汽车集团(数据)相比4 (b)和4 (d)),而阿司匹林治疗并不影响的LPS-stimulated RAW-CM(数字4 (c)和4 (d))。

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图4
阿司匹林对迁移的影响在RAW-CM 4 t1细胞培养。不同剂量的阿司匹林用于治疗4 t1细胞,这是培养24 h (a) 3%的边后卫/ DMEM (b) 50%如果RAW-CM,和(c) 50% LPS-stimulated RAW-CM 24 h,和愈合进行化验。距离(d)是由显微镜下测量微尺度和提出了抑制百分比相对于控制。数据显示为±SEM和来自三个独立的实验。执行统计分析使用单向方差分析和LSD事后测试。 和 与车辆控制。

因此,如果RAW-CM,模拟肿瘤微环境,促进增长4 t1细胞和适合使用未来的实验。同时,LPS刺激引发264.7原始细胞施加一种急性炎症反应,抑制增长和4 t1细胞的迁移。在这些研究的基础上,阿司匹林是一种有效的肿瘤微环境中代理chemopreventive但没有在急性炎症阶段产生的抗癌效果。

3.3。阿司匹林抑制4 t1细胞血管生成和炎性细胞因子的生产

细胞因子与乳腺癌致癌作用在培养上清液通过ELISA测定。细胞因子水平列出补充1和数据提出了相对于车辆控制图5。首先,在新鲜培养基培养4 t1细胞(控制)或RAW-CM和上层清液进行了分析(图5(一个))。RAW-CM只允许背景介质在原始的条件培养基的浓度测量。VEGF,纤溶酶原激活物inhibitor-1 (PAI-1)、肿瘤坏死因子(TNF -α)和白介素(il - 6)分泌明显高于4 t1细胞培养时在50% RAW-CM,表明macrophage-related介质条件媒体提升致癌乳腺癌细胞和炎症细胞因子的生产( )。

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图5
阿司匹林对致癌细胞因子的影响4 t1乳腺癌细胞培养生产的控制媒介和RAW-CM。(一)RAW-CM对细胞因子的影响生产4 t1细胞。细胞培养在50% RAW-CM 72 h,然后上层清液中细胞因子通过ELISA测定。(b)阿司匹林用于治疗4 t1细胞,培养在控制介质(1%的边后卫/ DMEM) 72 h,和上层清液中细胞因子含量测定。(c)阿司匹林用于治疗4 t1细胞,培养在50% RAW-CM 72 h,然后上层清液中细胞因子含量测定。数据显示为±SEM。使用独立的样本进行了统计分析t测试,统计上显著差异,表示 , , 与控制。

探讨阿司匹林治疗的影响这些细胞因子的分泌细胞因子水平相对于肿瘤特征分析(数据5 (b)和5 (c))。如图5 (b),当在新鲜培养基培养4 t1细胞作为控制条件,阿司匹林治疗显著降低MCP-1 ( ),PAI-1 ( )和il - 6 ( )水平和略降低VEGF水平( )。如图5 (c)当4 t1细胞培养在50% RAW-CM,阿司匹林治疗只有MCP-1和PAI-1生产下降( 和 、职责)。

3.4。阿司匹林调节巨噬细胞亚型Cocultures乳腺癌细胞和巨噬细胞

我们确定阿司匹林治疗是否会影响M1和M2巨噬细胞亚群基于表面标记表达式。集群的区别(CD) 11 c标记的M1巨噬细胞,而CD206 M2巨噬细胞的标记。RAW264.7细胞培养控制介质,LPS-stimulated RAW-CM,或cocultured 4 t1细胞然后特征。直方图和荧光强度的情节中提供数据6(一)和6 (b),而定量数据呈现在图6 (c)。CD11c表达增加了181%在原始264.7细胞LPS刺激后( ),但CD206标记表达式并没有受到影响。当原始264.7 4 t1乳腺癌细胞,细胞被cocultured CD206表达显著增加了281% ( )。与阿司匹林治疗后,CD11c显著增加了32% ( )和CD206下降了41% ( 264.7)相比,车辆控制cocultured原始细胞,表明阿司匹林改变了巨噬细胞在肿瘤细胞的存在,反对堕胎而不是LPS刺激的条件(图6 (c))。

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图6
阿司匹林对M1和M2巨噬细胞亚型的影响在LPS刺激和coculture 4 t1细胞。巨噬细胞被孵化的存在与否阿司匹林在新鲜培养基培养72 h和控制,有限合伙人的存在在过去24小时的孵化,或cocultured 4 t1细胞72 h。(一)直方图情节,(b)荧光强度的阴谋,和(c)定量数据。CD11c immunofluorescent强度(M1)和CD206 (M2)对巨噬细胞使用nc - 3000进行了分析。数据显示为±SEM。执行统计分析使用单向方差分析和LSD事后测试。通过比较不同的文化媒介t测试。统计上显著差异,表示 , , 与车辆控制。
3.5。阿司匹林抑制串扰和生产Cocultures Carcinogenesis-Related细胞因子的乳腺癌细胞和巨噬细胞

进一步确认潜在的细胞之间的相互作用在介质的生产文化上层清液,4 t1和生264.7细胞cocultured模拟肿瘤微环境的生理。细胞因子水平列出补充2,并给出了数据相对于车辆控制图7。细胞因子水平相对于肿瘤VEGF特征进行了测定,MCP-1 PAI-1, TNF -α、il - 6、转化生长因子- (TGF)β由ELISA, il - 10在72年底coculture h。只有很低的VEGF水平,MCP-1 PAI-1, TNF -α,TGF -β在个体生264.7或4 t1细胞上清液。当两种细胞类型都与2毫米阿司匹林治疗,显著抑制MCP-1, il - 6, TGF -β( , , 、职责),VEGF和趋势减少,PAI-1, TNF -α和il - 10 ( , , , 、职责)。

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图7
阿司匹林抑制血管生成和炎性细胞因子在上层清液cocultures 264.7 4 t1和原始细胞。4 t1细胞培养的巨噬细胞对72 h,收集上清液,细胞因子水平相对于由ELISA测定肿瘤的特征。(一)血管生成细胞因子VEGF、MCP-1 PAI-1。(b)炎症相关细胞因子TNF -αil - 6, TGF -β,il - 10。264.7空白栏显示原始细胞,点缀栏只显示4 t1细胞,灰色栏显示cocultures包含细胞和暗灰色表示cocultures用2毫米阿司匹林治疗。数据显示为±SEM。使用独立的样本进行了统计分析t测试。统计上显著差异,表示 , , 治疗与co-control车辆。

coculture模型中的阿司匹林治疗的效果是明显RAW-CM模型相比,表明cocultures包含两种类型的细胞可以有效的相声。这些数据表明,阿司匹林混乱的分泌介质在RAW-CM和cocultures致癌作用。示意图因素与阿司匹林治疗可能的积极作用提出了图8。


图8
阿司匹林的化学预防的模式可能的机制。在4 t1乳腺癌细胞环境,RAW264.7巨噬细胞浸润增加VEGF, PAI-1, TNF -α、il - 6和TGF -β水平,M2巨噬细胞表达,结果,有利于肿瘤的进展。阿司匹林治疗血管生成减少和炎症反应细胞因子VEGF, PAI-1, MCP-1, il - 6、il - 10, TGF -β生产。此外,治疗阿司匹林增加M1和M2表达减少巨噬细胞表达,沟通在这个微环境的干扰和削弱肿瘤进展。

4所示。讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤目前发现。乳房肿瘤微环境包括肿瘤、邻近的基质,并招募了免疫细胞,如巨噬细胞和淋巴细胞,这些细胞之间的串扰是参与肿瘤进展和转移(2]。有趣的是,巨噬细胞,免疫细胞类型中最丰富的固体肿瘤,渗透和分泌许多细胞因子,而肿瘤细胞形成。这导致慢性炎症,在这个微环境有利于肿瘤的发展提供了条件,血管生成(17,18]。

三阴性乳腺癌细胞系4 t1,这是一种乳腺癌与不良预后相关,因为细胞缺乏有效的治疗靶点,表现积极,伴随着过度的炎症性介质(15]。这促使科学家们识别有效的代理对这种类型的癌症。在现在的研究中,阿司匹林下定决心要成为一个潜在chemopreventive代理与反血管增生和抗炎作用在肿瘤微环境使用RAW-CM创建和cocultures生264.7巨噬细胞和4 t1乳腺癌细胞。本研究的结果表明阿司匹林这两种细胞类型之间串音干扰,因此,抑制癌细胞的生长和迁移。

通常情况下,巨噬细胞在宿主防御至关重要的作用,涉及连接先天和适应性免疫反应,以及组织修复。巨噬细胞分泌多种细胞因子,参与炎症反应,组织损伤,病原体间隙,组织内稳态,疾病发展19,20.]。有限合伙人,细菌内毒素,是一种常见的代理激活巨噬细胞参与先天免疫反应,引起免疫细胞浸润和炎症(21,22]。大量的研究表明,内毒素可能是抗癌的,可能由于其能力招募和激活免疫细胞和促炎介质生产(22]。肿瘤发生伴随着巨噬细胞浸润。因此,RAW-CM可能模仿与慢性疾病相关的微环境,包括多种炎症介质的存在(17]。RAW-CM模型中,LPS刺激引发264.7原始细胞发生急性炎症反应,因此,抑制4 t1细胞生长和迁移,这与其他证据是一致的。LPS激活肿瘤细胞TLR4信号,导致肿瘤逃避免疫监视和肿瘤生长延迟(23]。与此同时,如果RAW-CM,模拟肿瘤微环境,促进4 t1细胞生长。这表明,阿司匹林是一种很有前途的chemopreventive剂不仅抗炎还抗癌。这些抗癌属性也被展出在人类乳腺癌mda - mb - 231细胞(24]。

在先前发表的研究中,小鼠接种4 t1细胞植入海绵盘1 - 24天创造急性和慢性炎症环境(25]。肿瘤进展和VEGF水平和TNF -α是更大的比急性炎症的慢性炎症。此外,VEGF和TNF -α分子扩散的关键,血管生成,巨噬细胞招聘、和转移与肿瘤进展相关的(25]。的巨噬细胞、树突细胞和淋巴细胞在小鼠慢性炎症明显增大(25),这表明慢性肿瘤细胞浸润是重要的进展。在一个与肥胖相关的乳腺癌研究中,4 tl细胞增殖明显观察到细胞培养时adipocyte-conditioned中没有任何刺激,表明自发的脂肪细胞渗透导致4 t1细胞生长[16]。

我们之前的研究表明,阿司匹林治疗显著抑制4 t1细胞的增殖和迁移,以及导致MCP-1相关的减少和VEGF生产(26]。在现在的研究中,PAI-1和il - 6生产4 t1细胞也抑制了阿司匹林治疗。在RAW-CM模型中,VEGF、PAI-1 TNF -α,il - 6生产4 t1细胞显著增加,表明有致癌RAW-CM介质。阿司匹林治疗后,生产MCP-1 PAI-1下降,表明阿司匹林干扰巨噬细胞之间的相互作用和乳腺癌细胞,因此,抑制肿瘤发生的信号。此外,在一个与肥胖相关的乳腺癌研究涉及4 t1细胞培养3 t3-l1 adipocyte-conditioned介质和cocultured脂肪细胞,阿司匹林降低生产MCP-1和PAI-126]。这是符合本研究的数据,支持这两个细胞因子在肿瘤免疫细胞招聘和发展有重要的作用。

MCP-1, CCL-2,是一种员工和激活单核细胞趋化因子在炎症。在肿瘤进展,MCP-1通过促进巨噬细胞的浸润中扮演一个重要的角色,这是参与肿瘤恶化和免疫监视作用27,28]。此外,一项研究报道,阻塞MCP-1信号明显抑制4 t1细胞迁移(29日]。PAI-1是由多种细胞产生,参与一些病理条件,包括衰老、肥胖、炎症、高水平已经被证明是伴随肿瘤恶化[30.]。最近,TGF -β据报道治疗内皮细胞诱导PAI-1分泌,促进三阴性乳腺癌细胞转移(31日),说明潜在的PAI-1作为乳腺癌治疗的目标。此外,il - 6和TNF -α导体细胞因子,调节,各致病炎性疾病有多种生理功能,参与肿瘤恶化,血管生成和迁移32]。最近,据透露,血清中促炎细胞因子,il - 6等引发,TNF -α,与临床分期和淋巴结转移的乳腺癌患者(32]。这些细胞因子的水平与乳腺肿瘤发生的过程中,有关,因此,这些细胞因子癌症生物标记物有潜在的预后。

在现在的研究中,阿司匹林抑制MCP-1, PAI-1,和白介素4 t1细胞培养生产的新鲜媒介和RAW-CM,表明抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。在coculture模型中,用阿司匹林治疗显著地抑制MCP-1, il - 6, TGF -β稍微抑制VEGF, PAI-1 TNF -α,il - 10的生产。生产这些炎症和血管生成4 t1细胞介质的新鲜培养基,RAW-CM和coculture模型被阿司匹林。基于这些结果,阿司匹林community-associated因素干扰的抑制特性在乳房肿瘤微环境。此外,阿司匹林也可能通过其他途径发挥其chemopreventive属性包括炎症、环氧酶- 2 (COX),血小板,激素,或PI3激酶(33]。研究最多的阿司匹林抗癌机制之一是部分表达下调很多类型的乳腺癌细胞cox - 2的表达情况,包括MCF-7、mda - mb - 231和SK-BR-3,有助于抑制癌细胞增殖(34]。

巨噬细胞可以分为两个不同的表型的狭义货币供应量M1及广义货币供应量M2。M1巨噬细胞是由辅助提升1型(Th1)细胞因子和细胞产生促炎细胞因子,唤起一种适应性免疫反应。同时,Th2细胞因子单核细胞分化成M2巨噬细胞,促进血管生成,清洁受伤的组织,和抑制自适应免疫反应(7]。失衡M1和M2巨噬细胞数量可能导致病变(35]。已经证明,老鼠收到7,12-dimethylbenz (a)蒽化学致癌物质有更高F4/80 +巨噬细胞招聘perigonadal脂肪组织相比,老鼠没有收到任何致癌物质,特别是,更高层次的CD11c + M1型(36]。在目前的研究中,有一个显著增加当原始264.7平方米细胞细胞cocultured 4 t1细胞,这表明这种抑制的微环境促进乳腺癌细胞的生长。在肿瘤微环境中,恶性肿瘤招募循环单核细胞分化成tam。tam像M2巨噬细胞和施加protumor功能通过免疫抑制的行动(5]。因此,修改,比如通过抑制TAM招聘,TAM表型的转换,和生产相关的介质,已经被提议作为癌症治疗策略(37]。

有趣的是,阿斯匹林治疗增加了M1标记表达式,但降低了M2标记表达cocultures目前的研究中,这表明阿司匹林影响巨噬细胞在肿瘤微环境远离抑制免疫反应,从而导致乳腺癌细胞抑制。最近,这是表明巨噬细胞表型是由阿司匹林在原始的模型264.7细胞培养在胰腺癌细胞系Panc02-conditioned媒介。阿司匹林显著降低蛋白质和RNA水平的M2 CD206标志和预防胰腺癌生成(38]。伯内特和他的同事报告说,阿司匹林THP-1细胞中il - 10基因表达上调,但不是在cocultures MCF-7和THP-1细胞(39]。在乳腺癌患者临床试验,TGF -β表达较低在疾病的早期阶段,但在后期越来越与CCL2水平相关。此外,TGF -β刺激CCL2表达式,然后诱导单核细胞/巨噬细胞分泌Th2-attracting趋化因子在乳腺癌mda - mb - 231细胞肿瘤微环境(40]。在目前的研究中,阿司匹林抑制TGF -βcoculture模型中的表达,导致减少MCP-1生产和Th2积累,抑制下游微环境中的通信。

临床试验显示,阿司匹林是一种有效的chemopreventive代理。观察性研究表明,定期服用阿司匹林可以减少一些癌症的发病率,以及远处转移这些癌症的41]。荟萃分析和系统评价也提出,阿司匹林chemopreventive属性可以用来对抗乳腺癌[13,14]。心血管学科五个大型随机试验,阿司匹林可以降低癌症死亡率的风险和转移33]。最近,一个更大的队列研究,其中包括13个前瞻性研究857831例显示长期(> 5年)定期使用阿司匹林/星期2到7次预防乳腺癌[42]。基于先前的发现,定期使用阿司匹林(75至350毫克/天)可以降低乳腺癌的发病率和死亡率的流行病学实验(13,14,33,42]。研究者需要追求全面了解阿司匹林治疗引起的问题,如胃肠道副作用,最佳剂量、持续时间、与其他化合物和组合,方便使用阿司匹林作为癌症治疗。

5。结论

越来越多的证据基础上,巨噬细胞在肿瘤微环境中发挥着至关重要的作用,其中包括涉及一系列复杂的相声炎症趋化因子和细胞因子分泌和血管生成调节肿瘤细胞和巨噬细胞浸润。本研究的结果表明,阿司匹林chemopreventive属性,函数通过4 t1乳腺癌细胞和巨噬细胞。阿司匹林干扰各种细胞减少通信之间的联系通过proinflammation和血管生成介质和调制M1 / M2巨噬细胞亚型,这表明阿司匹林是一种很有前途的代理人,以防止肿瘤恶化。

数据可用性

数据用于支持本研究的发现都是提供的手稿和补充文件。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者承认资金来自科技部、台湾(103 - 2320 - b - 003 - 003 - my3, 106 - 2311 - b - 003 - 005 - my3)。

补充材料

补充1:阿司匹林对致癌细胞因子的影响生产4 t1乳腺癌细胞培养介质和RAW-CM的控制。补充2:阿司匹林抑制血管生成和炎性细胞因子在上层清液cocultures 264.7 4 t1和原始细胞。(补充材料)