抗TNF的影响αIL-17A，IL-21和IL-22粘膜表达的处理和克罗恩病中细胞因子产生的T细胞亚群

摘要

T辅助17（TH17）细胞产生白细胞介素（IL）17-A。此外，Th17细胞产生IL-21和IL-22。Th17细胞在克罗恩病（CD）中具有疾病促进作用。我们调查了抗TNF的影响αIL-17A，IL-21和IL-22的粘液基因表达（QPCR）以及在12个活性CD患者中产生这些细胞因子（流式细胞术）的薄层丙蛋白（LP）T细胞亚群的频率经过4周的抗TNFα用Adalimumab治疗。在基线，在发炎的粘膜中，我们发现与非血清粘膜相比，IL-17A和IL-22的基因表达增加而不是IL-22。产生IL-21产生的LP T细胞的频率增加，但是在基线上对发炎与非致血性粘膜进行发炎而产生的IL-17A-或IL-22或IL-22或IL-22的频率没有差异。IL-17A，IL-21和IL-22的粘液基因表达或IL-17A-，IL-21和IL-22的频率没有变化，基线之间的LP T细胞亚群和以下4athatimalimab的几周开始。我们的结果不支持反TNF的假设α治疗对CD中这些细胞因子的IL-17a，IL-21和IL-22或LP T细胞产生的早期影响。

1.介绍

Crohn的疾病（CD）由于围绕遗传易感个体的肠道微生物群体的失调粘膜免疫应答而进行了进展[1-3.］．据报道，白细胞介素（IL）17-A产生的T辅助剂（TH17）细胞在CD的进展中发挥着重要的疾病促进作用[4.-7.]，因为它们产生促炎细胞因子，除IL-17A标志细胞因子外，还包括IL-21和IL-22 [8.］．然而，这些细胞因子对上皮细胞具有保护性和再生作用[9.-11.］．因此，Th17细胞可能具有CD中的矛盾作用，这可以解释抗IL-17A抗体作为CD的治疗的效率[12.］．与感染性结肠炎患者相比，在CD患者的黏膜水平上观察到产生IL-17的T辅助细胞频率增加和IL-17 mRNA表达水平升高[13.]以及健康的控制措施[6.那13.-17.］．最近的一项研究报告说，增加数量的Th17细胞与CD和溃疡性结肠炎患者的内窥镜疾病活性相关，并且Th17细胞倾斜地伴随干扰素的产生 -γ[15.］．IL-21和IL-22的产生不是TH17细胞的特异性，并且也归因于其他CD4 T细胞亚群，例如滤泡T辅助细胞[18.]和th22细胞[19.]， 分别。与溃疡性结肠炎患者和健康对照组相比，在活性CD患者中观察到粘膜IL-21表达增加。与健康对照相比，CD患者还报告了增加IL-21-和产生IL-22和IL-22和IL-22的胶质馅目（LP）T细胞的数量[16.那20.］．

用抗体治疗，中和必要的炎性细胞因子肿瘤坏死因子α（抗TNFα)已成为治疗乳糜泻的中流砥柱[21.］．但是，抗TNF的机制α功效只是部分阐明。已经提出，LP T细胞中凋亡的诱导对于抗TNF是重要的α乳糜泻治疗的疗效[22.-24.］．

我们之前报告说26周的反TNFα治疗与循环IL-17A-和IL-21产生T细胞的频率的升高有关[25.］．中国的两项研究报告称，10周的抗TNFα治疗与IL-17A和IL-21的粘液基因表达降低，也有关IL-17A-和IL-21产生的LP细胞的频率[26.那27.］．但是，因为抗TNF的临床效果α治疗经常发生在治疗开始后一至两周，难以破译这些观察结果是否是抗炎反应的一般下调或直接治疗机制的旁观者现象。

我们假设抗肿瘤坏死因子αtreatment has an early (i.e., within 4 weeks of treatment initiation) effect on the mucosal IL-17A, IL-21, and IL-22 gene expression and the frequencies of mucosal IL-17A-, IL-21-, and IL-22-producing T cells in active CD. We aimed to test this hypothesis by measuring the mucosal gene expression of IL-17A, IL-21, and IL-22 as well as the cellular protein production of these cytokines in LP T cell subsets before and after 4 weeks of induction treatment with adalimumab. To clarify whether the cytokine levels were specific for the presence of active CD inflammation, we also included observations from areas of noninflamed tissue in the present study.

2.方法

2.1。患者和样品

本研究包括12名患有活性CD的患者。根据临床，内窥镜，组织病理学和生化标准诊断患者[28.］．基线患者特性如表所示1。在包容性时，所有患者都表现出临床疾病活动，估计由CROHN疾病活动指数（CDAI）估计[29.]大于150或HARVEY-BRADSHAW指数（HBI）[30.4或以上。此外，所有纳入的患者都有炎症的生化体征，例如c反应蛋白(CRP)升高或粪便钙保护素水平升高。所有患者在包含性内窥镜检查时均显示内窥镜疾病活动，采用简单内窥镜克罗恩病评分(SES-CD)进行评估[31.］．没有患者用抗TNF治疗α或在纳入前12周内改变皮质类固醇或免疫抑制剂剂量(硫唑嘌呤或甲氨蝶呤)。患者接受标准诱导剂量，皮下给予阿达木单抗(艾伯维，北芝加哥，伊利诺斯州)，包括第0天160 mg，第2周80 mg，第4周40 mg。所有患者在第0天接受结肠镜检查，并在给药第四周阿达木单抗剂量后一周再次接受结肠镜检查。在第一次结肠镜检查中，从炎症和非炎症区域获得钳夹活检，在第二次结肠镜检查中从相同的解剖节段获得活检。每次结肠镜检查当天也抽取血液样本。

2.2。生物化学参数

在采血时监测生化指标(CRP和粪钙保护素)。所有血液和粪便样本由丹麦奥胡斯大学医院临床生物化学系进行分析。

2.3。粘膜IL-17A，IL-21和IL-22基因表达分析

根据制造商的协议，使用Qiasymphony自动从石蜡包埋的粘膜活检中自动分离出RNA。使用NanoDrop 2000纳米夸构（Thermo Scientific）测定RNA浓度和纯度。IL-17A，IL-21和IL-22（Life Technologies，Darmstadt，Germany Cat的预测底漆和探头集。用FAM-BHQ系统标记为荧光/猝灭器，HS00222327_M1和HS01574154_M1，HS00222327_M1和HS01574154_M1。被使用了。使用具有Taqman基因表达测定的1步方案，在96孔StepeOnPlus™实时PCR系统（Life Technologies）上进行RT-QPCR。样品被复制，平均周期阈值（C_T.）值用于统计分析。使用管家基因HPRT-1标准化基因表达，并使用如前所述的Delta-Delta-CT方法分析数据[32.］．

2.4。椎相黄素单核细胞（LPMC）分离

活检在冰冷的PBS中收集，并立即放在冰上。用HBSS-EDTA (CMF HBSS中添加2% AB血清、1.5 mM Hepes (Gibco Life Technologies, Auckland, New Zealand))和2 mM EDTA (Thermo Fischer Scientific/Ambion, Waltham, Massachusetts)在37℃下孵育15分钟，去除上皮细胞。然后用含有10% AB血清和1.5 mM Hepes的RPMI 1640洗涤。lpmc通过在37°C和125°C孵育45- 90分钟制备μL胶原酶（8mg / ml）（Sigma-Aldrich，ST路易斯，密苏里州）和50U / mL DNA酶I（Sigma-Aldrich），其在补充有10％AB血清和1.5mM HEPES的5ml RPMI 1640中稀释。在消化后，通过过滤通过70次收集LPMC μM尼龙网（BD Biosciences，San Jose，California）和使用流式细胞术分析。

2.5。流式细胞仪染色和分析

将新鲜分离的LPMCs调整至最终浓度为2 × 10^6.LPMCs / ml在培养基中（RPMI 1640，10％汇集热灭活人AB血清，100u / ml青霉素和100 μg / ml链霉素）和在37℃下在5％CO中孵育过夜₂的气氛。第二天，用0.1刺激细胞μg/ml离子霉素(Sigma-Aldrich, Denmark, cat.)编号I0634)和5μG / ml Phorbol 12-Myristate 13-醋酸盐（PMA）（Sigma-Aldrich，丹麦，猫。数字P1585）在出现10时 μG / ML Brefeldin A（Sigma-Aldrich，Denmark，Cat。B7651号码B7651）在37°C时为5％Co的4小时₂的气氛。然后收获细胞，0.5×10^6.细胞100 μl洗涤缓冲液(PBS, 2%牛血清白蛋白(BSA)和0.9%叠氮化)表面染色，采用优化数量的抗CD4抗体(anti-CD4-PerCP, BD Biosciences, cat)。编号345770)和CD3 (anti-CD3-FITC, Biosciences, cat。(编号555492)和活/死可固定近红外死细胞染色试剂盒(Life Technologies, cat。编号L10119)，根据制造商的协议。表面染色用1.5 ml BD FACS裂解液(BD Biosciences, cat。349202号)。然后用0.5 ml FACS渗透溶液2 (BD Biosciences, cat)渗透细胞。编号340973)，用热灭活小鼠血清(Invitrogen，猫。编号10410)，然后用anti-IL-17A Alexa-647 (eBiosciences, cat。编号51-7179-42)和抗il -21 PE (eBiosciences, cat。 number 12-7219-42) or anti-IL-22 PE (R & D, cat. number IC7821P). Finally, the cells were fixed in 250 μl pbs含1％甲醛。五色流式细胞术在24小时内进行^5.记录前方散在淋巴细胞门的事件。使用正向散射高度和正向散射面积的组合来排除不具有单细胞现象的事件。活/死染色用于排除分析中的非活细胞。LPMCs的刺激与CD4的明显下调相关，从而禁止CD4的可能识别⁺CD3细胞。相反，我们只锁定了CD3⁺事件分析细胞内IL-17A、IL-21和IL-22的产生。IL-17A、IL-21和IL-22的门控是基于同型和荧光-1联合对照(补充图)1）。使用FACScanto流式细胞仪（BD Biosciences）进行流式细胞术，并使用FACS Diva 5.1软件（BD Biosciences）分析数据。染色程序在基线的四个患者中失败，并在4周后续预约的三名患者中失败。因此，配对样品（基线/第4周）仅在七个患者中仅提供，他们都反应抗TNFα治疗。

2.6。统计分析

数据以四分位区间(IQR)的中位数表示。使用GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, USA)，采用Wilcoxon符号秩检验评估两组配对样本之间的差异。值<0.05被认为是统计学意义的。

2.7。道德考虑因素

本研究符合赫尔辛基的宣言。所有参与者都提供了一份书面知情同意书。研究议定书由生物医学研究伦理中部丹麦地区委员会批准（日志M-20100216号码）。

结果

3.1。Adalimalab治疗的临床疗效

Adalimumab治疗改善内窥镜疾病活动评分。SES-CD分数在第4周（第4周）从基线（9-16）减少到5（2-8）（ ）。在第4周，两名患者表现出正常的粘膜（SES-CD值= 0）。在第4周（第4周），疾病活动评分从基线到102（61-133）的CDai水平降低（235-298）（ ）。HBI的水平在第4周的基线（8-11）下降到3（1-5）（ ）。此外，第4周，CRP水平从基线的4.8mg / L（1.2-11）降低至0.9mg / L（0.6-4.1）（ ）。在第4周，粪便酸突蛋白水平从495mg / kg下降到138mg / kg（30-770）（ ）。其中一种患者（患者第7患者）没有响应阿达木单抗治疗，并在第4周内经历了增加的SES-CD评分（1点）。该患者仅在基线到第4周的疾病活动略微减少（CDAI-得分：232-213; HBI得分：12-10）。

3.2。增加IL-17A和IL-22的基因表达以及IL-21产生频率的增加的CD粘膜

来自发炎的粘膜区域的所有样品具有可检测的IL-17A，IL-21和IL-22基因表达。然而，对于所有无素的组织样品，这不是真的。因此，从3名患者的比较和IL-21表达数据中，我们审查了从3名患者的检测IL-17A表达数据审集，从比较图和图中提出的统计分析1（a）。与同一个人中的无血清粘膜区域相比，IL-17a和IL-22的基线基因表达较高，具有有源炎症（ 和 ，resp。，图1（a））。然而，IL-21的粘膜基因表达仅趋于更高（ ）与非血清粘膜区域的发炎粘膜区域（图1（a））。

在基线的8名患者中进行流式细胞术分析。在LP细胞中产生IL-17A-和IL-22的频率为6.3％（4-12）和7.8％[5.2-10.8]，分别在具有活性炎症的区域。这些频率与肠道的无含有区域中的基线水平没有区别（IL-17A 5.5％[2.8-14％]， ），（IL-22（7.4％[4.3-16％] }。IL-21产生的频率增加了IL-21产生的LP T细胞在肠道发炎区域，而基线的肠道的非血压区域中这些细胞的频率（10.3％[6.7-13％]与6.2％[3.2 .-8.8％]， ） （数字1（b））。流式细胞术分析表明，LPMC中的IL-17a，IL-21和IL-22的产生仅存在于施加的淋巴细胞栅极内的CD3表达细胞中。LP CD3的频率没有差异⁺炎症活动区(54%[48-59%])与非炎症区(51%[49-53%])之间的T细胞( ）。

3.3。四周的Adalimumab治疗不会改变IL-17a，IL-21和IL-22的粘膜基因表达或LP T细胞产生

阿达木单抗治疗4周后，从包涵时发炎的肠道相同区域获得新的活组织检查。所有样本均检测到IL-17A基因表达，其中一个样本IL-21和IL-22表达水平均低于检测限，后续分析将其删除。IL-17A黏膜基因表达无变化( ）或IL-21（ ）与在基线发炎区域获得的活组织检查中的基因表达相比。遵循阿巴木单抗治疗，IL-22基因表达（ ）与基线相比，趋势较低（图2（a））。

此外，在Adalimalab治疗4周后IL-17A-，IL-21-或IL-22或IL-22或IL-22的频率没有变化[3.0％（2.3-5.8％）IL-17A（ )、4.5% (1.4-10.9%)il-21 ( )， 5.4% (4.2-7.9%) IL-22 ( ）]与基线发炎区域相比（图2（b））（配对流式细胞术数据只能从7名患者获得）。相同的比较显示LP CD3的频率没有变化⁺在Adalimalab治疗的第4周的T细胞[52％[46-57％]（ ）]。单人患者（患者第7次）未响应Adalimalab治疗的审核后的审查并未影响结果的统计解释。

4.讨论

我们的研究调查了抗TNF的影响α在活性Cd中这些细胞因子的IL-17a，IL-21和IL-22和LP T细胞产生的粘液基因表达的处理。数据显示对抗TNF的临床反应α治疗没有改变这些参数。然而，当将粘膜区域与基线的非血清粘膜区域进行比较时，我们遵守IL-17a和IL-22的增加的基因表达以及产生IL-21产生的LP T细胞的频率。

粘膜Th17细胞的存在和IL-17a的基因表达与Cd炎症有关。通常，Th17细胞被认为是在CD进展中促进疾病的疾病[4.-6.那33.］．通过报告CD患者的增加的Th17细胞水平和IL-17A基因表达水平，与健康对照（CD患者）的增加，几项研究证实了这一点[6.那13.-17.］．最近的一项研究还报告了与内窥镜疾病活动相关的粘膜Th17细胞水平增加[15.］．然而，Hueber等人发现抗il - 17a治疗与一些患者的疾病恶化有关，提示Th17细胞可能在CD中也有抗炎作用[12.］．与其他人的研究结果一致，我们观察到炎症的CD粘膜中IL-17A和IL-22基因表达水平在基线时高于非炎症粘膜[6.那9.那13.那14.那17.］．然而，这在细胞水平上没有反映，因为IL-17A-或IL-22的频率没有发炎和非征集区域之间产生的LP T细胞的频率。该观察结果表明，即使表达IL-17A和IL-22的T细胞的相同频率存在于发炎和非对粘膜中，炎症期间相对基因表达较高。这可以反映非T细胞中的细胞因子产生，例如先天淋巴细胞型3（ILC3），尽管我们的分析表明细胞因子表达限于CD3表达淋巴细胞。globig等人。[15.]和江等人。[16.研究结果显示，活动性CD与轻度/静止CD与健康对照组相比，il - 17a产生的LP T细胞均有所增加。然而，这些研究不包括炎症和非炎症性乳糜泻之间的个体比较。此外，这两项研究都没有测量纵向变化。与Globig等人和Jiang等人的研究结果类似，Leung等人在比较炎症和非炎症CD黏膜的个体水平时，没有观察到产生il -17细胞的频率的差异[34.］．此外，在比较炎症和非炎症粘膜水平时，我们没有发现产生il -22的LP T细胞的频率有任何差异。一项研究表明，产生il -22的LP T细胞的频率与CD的内窥镜疾病活动相关[16.];然而，本研究不包括此处执行的内部知识比较。根据其他研究的发现，我们观察到在基线发炎的粘膜上发炎的IL-21产生的LP T细胞更高水平的LP T细胞[34.那35.］．

与我们的假设相比，我们没有观察到基因表达的任何变化，IL-17A，IL-21或IL-22导致的IL-17A，IL-21或IL-22的抗TNFα治疗。我们也没有在LP CD3中观察到这些细胞因子的蛋白质表达对细胞水平的任何差异⁺抗TNF期间的细胞α在治疗期间，尽管内镜检查后视觉有显著改善，并减少了临床疾病活动。然而，关于细胞水平的结论是基于7例患者。我们研究了产生细胞因子CD3的频率而不是绝对细胞数⁺LP T细胞检测抗TNF的任何特定效果α对这些细胞进行治疗。然而，如果我们研究了炎症细胞的绝对数量，我们会发现炎症组织和非炎症组织之间存在显著差异，因为炎症细胞的绝对数量会随着炎症的发生而大幅增加。

我们的结果与两项研究报告的数据相反，证明了10周的抗TNFα亚洲CD患者的治疗与IL-17a和IL-21的基因表达降低有关[26.那27.］．此外，这些研究之一报告了来自抗TNF的IL-17A-和IL-21和IL-21的LP细胞的频率降低α治疗，不具体限制它们对T细胞的分析[26.］．这种差异可能与亚洲患者和本研究中包括的白人患者之间的遗传差异有关;然而，一个合理的解释是研究中随访检查的时间点不同(分别为10周和4周)。我们观察到在4周的治疗后内镜下有显著的改善，这支持了这种治疗的抗炎作用在此时已经很好地确立了。因此，10周的间隔使其本质上难以解释炎症改善和抗tnf的作用之间的关系α当检查粘膜IL17-A和IL-21生产时。对于早期的治疗课程进行检查，我们最近报告了从4周的抗TNF的先天免疫应答的变化α使用相同的研究队列和调查时间点治疗[36.］．在该分析中，我们观察到含有中间HLA-DR表达的粘膜巨噬细胞数量和CD103的数量增加⁺树突状细胞(36.］．我们以前和当前的结果在一起表明反TNFα与适应性免疫相比，治疗对先天免疫具有更显着的影响。

综上所述，IL-17A、IL-21和IL-22的调节是否与抗tnf的临床疗效有关α治疗，我们的分析应该在抗TNF 4周之前和之后发炎粘膜之间的差异α。由于这不是这种情况，我们的数据不支持这一假设。

信息披露

本文的一些数据呈现在丹麦胃肠学和2017年肝脏学会。

的利益冲突

作者宣布关于本条的出版物没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了丹麦Abbvie的不受限制的补助金。

补充材料

图1：用于鉴定细胞因子的LP T细胞的门控策略。通过它们的正向和侧散射外观（a）鉴定分离的LP细胞。没有单细胞外观的事件被前进散射高度和前向散射区域的组合排除。活/死染料用于排除免疫细胞免疫分析（B）。通过它们的CD3（c）表达鉴定T细胞。通过同种型和荧光 - 减去一种对照（D）的组合设定了细胞因子产生的淋巴细胞浇口。然后将该浇口施加在用于细胞因子表达的LP细胞上（在该实施例IL-17A和IL-22中）（E）。（补充材料）

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