1。介绍
克罗恩病(CD)的发展由于粘膜免疫反应特异表达基因易感个体对肠道微生物区系(
1 - - - - - -
3 ]。白介素(IL) 17-A-producing T辅助(Th17细胞已报告中诱发疾病中发挥重要作用的发展CD [
4 - - - - - -
7 因为他们的促炎细胞因子的生产,除了标志IL-17A包括IL-21和细胞因子il - 22生成(
8 ]。然而,这些细胞因子也有保护和再生影响上皮细胞(
9 - - - - - -
11 ]。因此,Th17细胞可能在CD矛盾的角色,这或许可以解释的低效anti-IL-17A抗体治疗CD [
12 ]。增加IL-17-producing T辅助细胞和更高的频率IL-17 mRNA表达已经观察到粘膜水平在CD患者感染性结肠炎患者相比
13 )以及健康对照组(
6 ,
13 - - - - - -
17 ]。最近的一项研究报道,Th17细胞数量的增加与内窥镜相关疾病活动在CD和溃疡性结肠炎的病人,和Th17细胞偏向伴随生产干扰素-
γ (
15 ]。生产IL-21 il - 22生成并不是特定于Th17细胞也被归因于其他CD4 T细胞亚群,如卵泡辅助T细胞(
18 )和Th22细胞(
19 ),分别。增加粘膜IL-21表情一直在观察活跃的CD患者相比,溃疡性结肠炎患者和健康对照组。IL-21——增多和IL-22-producing固有层(LP) T细胞也被报道在CD患者与健康对照组(
16 ,
20. ]。
治疗用抗体中和炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(anti-TNF至关重要
α )已成为一个主要的治疗CD [
21 ]。然而,anti-TNF的机制
α 功效只有部分阐明。它提出了LP T细胞的诱导凋亡对anti-TNF很重要
α 疗效在治疗CD [
22 - - - - - -
24 ]。
我们以前报道,26周anti-TNF
α 治疗与循环的频率上升IL-17A——IL-21-producing T细胞(
25 ]。来自中国的两项研究报道,anti-TNF 10周
α 治疗与基因表达降低粘膜相关IL-17A IL-21和减少频率IL-17A——IL-21-producing LP细胞(
26 ,
27 ]。然而,由于anti-TNF的临床效果
α 经常出现治疗一到两周治疗开始后,很难破译这些观察是否一个旁观者现象的差别一般对这些炎症反应或直接治疗机制。
我们假设anti-TNF
α 治疗早期(即。,within 4 weeks of treatment initiation) effect on the mucosal IL-17A, IL-21, and IL-22 gene expression and the frequencies of mucosal IL-17A-, IL-21-, and IL-22-producing T cells in active CD. We aimed to test this hypothesis by measuring the mucosal gene expression of IL-17A, IL-21, and IL-22 as well as the cellular protein production of these cytokines in LP T cell subsets before and after 4 weeks of induction treatment with adalimumab. To clarify whether the cytokine levels were specific for the presence of active CD inflammation, we also included observations from areas of noninflamed tissue in the present study.
2。方法
2.1。病人和样品
十二个活跃的CD患者纳入本研究。病人被诊断根据临床、内镜、组织病理学和生物化学标准(
28 ]。患者基线特征如表所示
1 。在夹杂物,所有的病人表现出临床疾病活动,所估计的克罗恩病活动指数(CDAI) [
29日 大于150或Harvey-Bradshaw指数(HBI) [
30. 的4或更多。此外,所有包括患者生化炎症的迹象,例如,高c反应蛋白(CRP)或增加粪便calprotectin水平。所有患者内镜显示疾病活动包括内窥镜检查,这是使用简单的评估内镜得分为克罗恩病(SES-CD) [
31日 ]。没有anti-TNF对待病人
α 糖皮质激素或免疫抑制剂改变剂量(咪唑硫嘌呤或甲氨蝶呤)内包含前12周。患者接受标准感应剂量皮下注射adalimumab (AbbVie,北芝加哥,伊利诺斯州),在第0天组成的160毫克,80 mg 2周,4周40毫克。所有患者接受结肠镜检查在第0天又一个星期postadministration adalimumab四周的剂量。在第一次结肠镜检查,夹活检发炎和noninflamed地区,和活组织检查都取自同一解剖部分在第二次结肠镜检查。血液样本也画在每个结肠镜检查的日子。
表1
基线特征。
病人的数量
性别
免疫抑制剂
行为
位置
吸烟情况
CDAI
HBI
SES-CD
c反应蛋白
粪便calprotectin
1
米
是的
狭窄
肠阻塞的
没有
301年
6
8
8
576年
2
F
是的
穿透
结肠
没有
266年
10
8
0.6
148年
3
米
没有
Nonstricturing,非穿透
结肠
没有
153年
4
16
3所示。2
1215年
4
F
没有
Nonstricturing,非穿透
结肠
没有
299年
8
11
51.7
> 3600
5
米
是的
狭窄
Ileocolonic
没有
292年
10
17
0.8
405年
6
米
是的
Nonstricturing,非穿透
Ileocolonic
是的
315年
10
7
9.8
941年
7
米
没有
Nonstricturing,非穿透
结肠
没有
232年
12
15
1。4
失踪
8
F
是的
Nonstricturing,非穿透
结肠
没有
179年
7
18
3所示。8
342年
9
F
是的
Nonstricturing,非穿透
结肠
没有
251年
12
14
12.0
495年
10
F
是的
Nonstricturing,非穿透
结肠
没有
296年
10
10
5.7
178年
11
米
是的
Nonstricturing,非穿透
结肠
没有
238年
11
15
0.9
211年
12
米
没有
狭窄
Ileocolonic
没有
295年
9
15
36.5
> 3600
c反应蛋白:在mg / L, c反应蛋白参考< 8 mg / L;粪便calprotectin、参考< 50毫克/公斤。
2.2。生化参数
生化参数(CRP和粪便calprotectin)在《纽约时报》的血液抽样监测。所有血液和粪便样本分析的临床生物化学,奥尔胡斯大学医院,丹麦奥尔胡斯。
2.3。分析粘膜IL-17A IL-21, il - 22生成基因的表达
RNA是自动从石蜡包埋粘膜活检孤立使用QIAsymphony根据制造商的协议。RNA浓度和纯度测定使用NanoDrop 2000®200 NanoQuant(热科学)。预先设计引物和探针集IL-17A, IL-21和il - 22生成(生活技术,达姆施塔特,德国的猫。Hs00174383_m1数量,Hs00222327_m1, Hs01574154_m1 resp)贴上FAM-BHQ系统作为荧光/饮料。RT-qPCR进行一个96 - StepOnePlus™实时PCR系统(技术)用互译协议TaqMan基因表达分析。样本重复和平均周期阈值(CT )值是用于统计分析。基因表达是使用管家基因HPRT-1标准化的,和数据分析使用delta-delta-Ct方法如前所述[
32 ]。
2.4。隔离的固有层单核细胞(LPMCs)
收集活检在冰冷的PBS和立即放在冰。上皮细胞被孵化15分钟37°C的组织HBSS-EDTA (CMF hbs补充2% AB血清,1.5毫米玫瑰(Gibco生活技术,奥克兰,新西兰))和2毫米EDTA(热费希尔科学/ Ambion,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)在三个独立的时候,紧随其后的是一个洗RPMI 1640年补充10% AB血清和1.5毫米消息灵通的。LPMCs准备通过45 - 90分钟长孵化与125年在37°C
μ l(胶原酶(8毫克/毫升)(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)和50 U /毫升DNase我(Sigma-Aldrich), 5毫升稀释的RPMI 1640补充10% AB血清和1.5毫米消息灵通的。消化后,LPMCs收集过滤通过70
μ 米尼龙网(BD生物科学,圣何塞,加州)和使用流式细胞术分析。
2.5。流式细胞术染色和分析
新孤立LPMCs调整的最终浓度2×106 LPMCs培养基/毫升(RPMI 1640年10%汇集heat-inactivated人类AB血清100 U /毫升青霉素和100年
μ g / ml链霉素)和孵化一夜之间在37°C公司5%2 的气氛。第二天,细胞被刺激了0.1
μ g / ml ionomycin (Sigma-Aldrich、丹麦、猫。I0634数量)和5
μ g / ml佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich、丹麦、猫。P1585)在10
μ g / ml brefeldin (Sigma-Aldrich、丹麦、猫。B7651) 4小时37°C公司5%2 的气氛。然后细胞收获0.5×106 细胞在100年
μ l洗缓冲区(PBS, 2%牛血清白蛋白(BSA)和0.9%叠氮化)与优化大量的抗体surface-stained CD4 (anti-CD4-PerCP BD生物科学,猫。345770号)和CD3 (anti-CD3-FITC、生物科学、猫。555492号)和生活/死亡可以解决的近红外线死细胞染色工具包(生活技术,猫。根据制造商的协议号码L10119)。表面染色固定为1.5毫升BD流式细胞仪赖氨酸溶液(BD生物科学,猫。349202号)。细胞被permeabilized 0.5毫升流式细胞仪Permeabilizing解决方案2 (BD生物科学,猫。340973号)和阻塞heat-inactivated鼠标血清(表达载体,猫。10410号)之前与anti-IL-17A alexa染色- 647 (eBiosciences,猫。号51-7179-42)和anti-IL-21 PE (eBiosciences,猫。 number 12-7219-42) or anti-IL-22 PE (R & D, cat. number IC7821P). Finally, the cells were fixed in 250
μ l PBS 1%甲醛。五色流式细胞术在24小时内进行,105 事件forward-side散射淋巴细胞大门都被记录下来。forward-scatter-height和forward-scatter-area用于排除没有单一细胞出现的事件。生活/死亡的污点是用来排除不能存活的细胞分析。LPMCs的刺激与CD4的差别明显对这些有关,从而禁止可能CD4的识别+ CD3细胞。相反,我们只有封闭CD3+ 事件的分析细胞内IL-17A IL-21,和il - 22生成生产。IL-17A浇注,IL-21, il - 22生成是基于同形像和fluorescence-minus-one控制(补充图
1 )。流式细胞仪进行使用FACSCanto流式细胞分析仪(BD生物科学)和数据分析使用流式细胞仪天后5.1软件(BD生物科学)。染色过程失败的四个包括患者在基线和四周的三个病人随访的约会。配对样本(基线/星期4)因此只能在七包括病人,他们都对anti-TNF作出回应
α 治疗。
2.6。统计分析
数据表示为中位数和四分位范围(差)。一个Wilcoxon符号秩测试是用来评估两组之间的差异成对样品使用GraphPad Prism 6.0(美国拉霍亚GraphPad软件)。
p
值< 0.05被认为是具有统计学意义。
2.7。道德的考虑
这项研究符合《赫尔辛基宣言》。所有参与者提供书面知情同意。研究协议是丹麦中部地区批准的生物医学研究伦理委员会(m - 20100216)》杂志上。
3所示。结果
3.1。Adalimumab治疗的临床效果
Adalimumab改善内镜治疗疾病活动的分数。SES-CD分数降低了从15(9到16)基线5(2 - 8)在周4 (
p
=
0.003
)。两个病人表现出正常粘膜(SES-CD值= 0)在星期4。的疾病活动分数降低CDAI 279(235 - 298)在基线水平到102年(61 - 133)在周4 (
p
=
0.002
)。HBI水平下降从10(8)基线在周4 (3 (1 - 5)
p
=
0.002
)。此外,c反应蛋白水平下降为4.8 mg / L(1.2 -11)从基线值的0.9 mg / L(0.6 - -4.1)在周4 (
p
=
0.01
)。从495毫克/公斤粪便calprotectin水平降低基线138毫克/公斤(30 - 770)在4周(
p
=
0.10
)。包含的一个病人(患者数7)没有回应adalimumab治疗和有经验的增加SES-CD分数(1分)4周。这个病人却只是略微减少疾病活动从基线到周4 (CDAI-score: 232 - 213;HBI-score:成员)。
3.2。IL-17A基因表达的增加和il - 22生成频率增加IL-21-Producing T细胞的发炎CD粘膜
所有样本粘膜发炎区域可检测IL-17A, IL-21, il - 22生成基因的表达。然而,这并不是适用于所有noninflamed组织样本。因此,我们审查以下检测数据从1病人和IL-21 IL-17A表达式和il - 22生成表达数据从3例图中给出的比较图表和统计分析
1(一) 。基线IL-17A和il - 22生成基因表达在粘膜炎症而活跃地区noninflamed粘膜地区同一个人(
p
=
0.008
和
p
=
0.03
,分别地。,Figure
1(一) )。然而,粘膜IL-21只倾向于更高的基因表达(
p
=
0.07
)粘膜发炎地区相比noninflamed黏膜区域(图
1(一) )。
图1
粘膜基因表达和LP T细胞生产IL-17A IL-21, il - 22生成基线和noninflamed粘膜发炎。基因表达是由rtPCR (a)和频率的IL-17A, IL-21和IL-22-producing LP CD3细胞+ T细胞流式细胞术测定(b)基因表达数据之间的归一化比率显示感兴趣的基因的相对表达和看家基因
HPRT-1 。Wilcoxon符号秩检验比较应用于(rtPCR: IL-17A配对样本
n
=
11
;IL-21
n
=
9
;il - 22生成
n
=
9
;流式细胞仪:
n
=
8
为每个细胞因子)。
(一)
![]()
(b)
![]()
流式细胞术分析八个病人基线。IL-17A的频率,IL-22-producing T细胞在LP细胞6.3%(4 - 12)和7.8%(5.2 - -10.8),分别在活跃的地区炎症。这些频率没有不同于基线水平noninflamed地区肠道{(IL-17A 5.5% (2.8 - -14%),
p
=
0.57
),(il - 22生成(7.4% (4.3 - -16%)
p
=
0.94
)}。有一个频率的增加IL-21-producing LP T细胞在肠道发炎地区与这些细胞的频率noninflamed地区的肠子在基线(10.3%(6.7 - -13%)和6.2% (3.2.-8.8%),
p
=
0.02
)(图
1 (b) )。流式细胞仪分析显示,生产IL-17A IL-21和il - 22生成LPMC只是出现在CD3-expressing细胞应用淋巴细胞内的门。没有LP CD3的频率的差异+ T细胞之间的地区活跃的炎症(48 - 59%)(54%)相比,noninflamed面积(51% [49 - 53%])(
p
=
0.33
)。
3.3。4周Adalimumab治疗不会改变粘膜IL-17A基因表达或LP T细胞生产,IL-21, il - 22生成
adalimumab治疗4周后,新活检获得来自同一地区的肠道发炎包容。基因表达的IL-17A在所有获得的样品检测,而IL-21和il - 22生成表达水平低于检出限在一个样本,这是后续分析的审查。没有IL-17A(粘膜基因表达的变化
p
=
0.88
)或IL-21 (
p
=
1。0
)相比,基因表达在活检获得发炎地区在基线。adalimumab治疗后,il - 22生成基因表达(
p
=
0.08
)比基线(图呈现下降趋势
2(一个) )。
图2
粘膜比较基因表达和LP T细胞表达IL-17A IL-21, il - 22生成基线和星期4 adalimumab治疗之间的关系。基因表达是由rtPCR (a)和频率的IL-17A, IL-21和IL-22-producing LP CD3细胞+ T细胞流式细胞术测定(b)基因表达数据之间的归一化比率显示感兴趣的基因的相对表达和看家基因
HPRT-1 。Wilcoxon符号秩检验比较应用于(rtPCR: IL-17A配对样本
n
=
12
;IL-21
n
=
11
;il - 22生成
n
=
11
;流式细胞仪:
n
=
7
为每个细胞因子)。
(一)
![]()
(b)
![]()
此外,没有频率的变化IL-17A, IL-21或IL-22-producing LP adalimumab治疗4周后T细胞(3.0% (2.3 -5.8%)IL-17A (
p
=
0.20
),4.5% (1.4 -10.9%)IL-21 (
p
=
0.18
4.2)和5.4% (-7.9%)il - 22生成(
p
=
0.24
)相比,炎症区域基线(图
2 (b) )(成对的流式细胞仪数据只能从7例)。相同的比较显示没有改变LP CD3的频率+ T细胞在星期4 adalimumab治疗[52% (46 - 57%)(
p
=
0.61
)]。事后审查单一病人(患者数7)谁没有回应adalimumab治疗并不影响结果的统计解释。
4所示。讨论
我们的研究调查anti-TNF的影响
α 治疗粘膜IL-17A基因表达,IL-21, il - 22生成和LP T细胞生产这些细胞因子在活跃的CD。数据显示anti-TNF临床反应
α 治疗没有改变这些参数。然而,当比较粘膜炎症noninflamed粘膜区域活跃地区在基线,我们观察到的基因表达增加IL-17A和il - 22生成以及增加IL-21-producing LP T细胞的频率。
粘膜Th17细胞和IL-17A与CD炎症相关的基因表达。一般来说,Th17细胞被认为是疾病发展的促进CD [
4 - - - - - -
6 ,
33 ]。几项研究已经证实通过报告增加Th17细胞水平和IL-17A基因表达水平在CD患者与健康对照组(
6 ,
13 - - - - - -
17 ]。最近的一项研究也报道水平的提高粘膜Th17细胞与内窥镜相关疾病活动(
15 ]。然而,Hueber等人发现anti-IL-17A治疗一些病人与疾病恶化,表明Th17细胞也可能在CD(抗炎作用
12 ]。同意他人发现,我们观察到增加IL-17A和il - 22生成基因表达在CD粘膜发炎而noninflamed粘膜基线(
6 ,
9 ,
13 ,
14 ,
17 ]。然而,这并不反映在细胞水平上没有差异的频率IL-17A——或者IL-22-producing LP T细胞发炎和noninflamed之间的地区。这个观察表明,即使相同频率的T细胞表达IL-17A和il - 22生成中存在和noninflamed粘膜发炎,炎症期间相对基因表达较高。这可能反映了细胞因子等non-T细胞生产先天淋巴细胞类型3 (ILC3),虽然我们的分析表明,细胞因子表达仅限于CD3表达淋巴细胞。Globig et al。
15 和江等。
16 )每个演示IL-17A-producing LP的增加T细胞活跃CD与轻度/静CD与健康对照组。然而,这些研究没有包括个体比较发炎和noninflamed CD执行。此外,这些研究测量纵向变化报告。相比Globig江等人,et al .,但与我们的研究结果相似,梁等人没有观察到不同的频率IL-17-producing细胞相比个人水平的发炎和noninflamed CD粘膜(
34 ]。另外,我们没有发现任何差异的频率IL-22-producing LP T细胞相比的水平与noninflamed粘膜发炎。一项研究表明,IL-22-producing LP T细胞的频率与内窥镜疾病活动在CD [
16 ];然而,这项研究没有包括个体内的比较在这里执行。按照发现在其他的研究中,我们观察到更高层次的IL-21-producing LP T细胞在基线和noninflamed粘膜发炎(
34 ,
35 ]。
与我们的假设,我们没有观察到任何基因表达的变化,在粘膜发炎,IL-17A, IL-21或il - 22生成anti-TNF的结果
α 治疗。我们观察任何差异也在细胞水平上对这些在LP CD3细胞因子的蛋白表达+ 细胞在anti-TNF
α 在内镜检查和治疗,尽管明显改善视觉降低临床疾病治疗期间的活动。然而,有关细胞水平的结论是基于7个病人。我们调查了频率而不是绝对cytokine-producing CD3细胞+ LP anti-TNF T细胞探测到任何特定的影响
α 在这些细胞治疗。如果我们研究了绝对数字,然而,我们希望找到一个显著区别发炎和noninflamed组织炎症细胞的绝对数量大大地扩展与炎症。
我们的结果与报道的数据是两个研究证明anti-TNF 10周
α 在亚洲CD患者治疗与基因表达降低IL-17A和IL-21
26 ,
27 ]。此外,这些研究报告之一IL-17A频率降低,从anti-TNF IL-21-producing LP细胞
α 治疗,没有特别限制他们的分析T细胞(
26 ]。这种差异可以遗传差异有关亚洲病人和高加索患者纳入本研究;然而,一个合理的解释的不同时间点是在研究随访检查(10和4周,职责)。我们观察到显著改善内镜治疗4周后,支持的抗炎作用治疗建立在这个时间点。因此,10周间隔之间本质上使它难以破译改善炎症和anti-TNF的影响
α 当检查黏膜IL17-A IL-21生产。符合之前需要执行检查治疗,我们最近报道先天免疫反应的变化来自anti-TNF 4周
α 治疗使用这个相同的队列研究和临床实验的时间点(
36 ]。在这个分析中,我们观察到粘膜巨噬细胞数目减少中间HLA-DR表达式和CD103数量的增加+ 树突状细胞(
36 ]。我们之前和现在的结果表明anti-TNF一起
α 在先天免疫治疗效果更加突出短间隔与适应性免疫。
总之,如果调制IL-17A, IL-21, il - 22生成的机械化负责anti-TNF的临床疗效
α 治疗,我们的分析显示差异粘膜发炎anti-TNF之前和之后4周
α 。由于这并非如此,我们的数据不支持这一假说。