文摘
芒柄花黄素是一种异黄酮化合物,据报道具有抗炎作用。在本研究中,我们旨在探索芒柄花黄素的保护作用在葡聚糖硫酸酯钠(DSS)诱导急性结肠炎。芒柄花黄素腹腔注射对小鼠,结肠炎疾病严重程度的减毒剂量依赖性的方式,主要表现为减轻结肠炎的临床症状,减轻结肠上皮细胞损伤,upregulations结肠紧密连接蛋白的水平(ZO-1、claudin-1和occludin)。与此同时,我们的研究发现,芒柄花黄素显著预防急性损伤引起的结肠细胞的肿瘤坏死因子-α体外,具体体现为增加结肠紧密连接蛋白的表达(ZO-1, claudin-1, occludin)。此外,结果表明,芒柄花黄素可以降低NLRP3通路蛋白水平(ASC NLRP3, il - 1β体内和体外,MCC950 NLRP3特定抑制剂,可以缓解DSS-induced小鼠急性结肠炎。此外,在管理的基础MCC950抑制激活NLRP3 inflammasome,我们未能观察到芒柄花黄素在急性结肠炎小鼠的保护作用。总的来说,我们的研究首次证实了芒柄花黄素的保护作用DSS-induced通过抑制急性结肠炎NLRP3 inflammasome途径激活。
1。介绍
炎症性肠病(IBD)是一种非感染性炎症性疾病,主要包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。流行病学数据显示,炎症性肠病已经成为一个全球性问题,在高危地区IBD的发病率在这些年中一直保持稳定,而在低风险地区,如欧洲南部,亚洲,和大多数发展中国家的发病率正在增加1]。
炎症性肠病的具体机制尚不清楚,而毫无疑问,肠道粘膜免疫功能紊乱中发挥着重要作用在炎症性肠病的发病机制2,3]。免疫抑制,如6 -巯基嘌呤、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和环孢菌素A,这可能阻止异常免疫激活,通常建议在临床治疗IBD患者(4,5]。然而,这种免疫抑制可能影响正常的免疫系统的平衡,甚至引起严重的副作用,包括myelosuppression,感染,和肝损伤。因此,寻找新型免疫调节药物,能有效地减轻粘膜炎症与最小或没有副作用似乎在炎症性肠病的临床预防和治疗至关重要。
芒柄花黄素是一种异黄酮化合物,广泛存在于自然的植物。它是主要的生物活性化合物在各种中药材,如黄芪,传统上用于治疗糖尿病在中国2000多年。目前的研究证据表明,芒柄花黄素扮演不同的效果,例如,抗炎(6,7,抗氧化8,抗肿瘤9),和促进细胞凋亡10]。利马卡文迪什等人证实,芒柄花黄素具有抗炎效果与腹膜炎大鼠(6),可以保护小鼠免受lipopolysaccharide-induced急性肺损伤(7]。然而,特定的芒柄花黄素对急性结肠炎的影响还没有很好地定义和记录。
Inflammasome宿主炎症调控的关键组成部分,提出了Tschopp研究团队首次于2002年(11]。inflammasome是胞质multimeric蛋白质复合体由nucleotide-binding域和富亮氨酸repeat-containing蛋白质(NLRs)或AIM2适配器蛋白质凋亡speck-like蛋白质包含卡(ASC)和cysteine-aspartic酸蛋白酶-(半胱天冬酶-)1。已经发现有四种inflammasome: NLRP1, NLRP3, NLRC4, AIM2 [12- - - - - -14),其中NLRP3 inflammasome是最彻底的研究。以前的研究已经表明,NLRP3 inflammasome可能在炎症性肠病的发病机制起着至关重要的作用。临床研究表明,对CD可能与NLRP3基因多态性(15),在研究中国人口(232 CD盒,56个加州大学情况下,和247名健康控制情况下),结果表明,NLRP3基因表达没有明显炎症性肠病组和对照组之间的不同;没有明显变化NLRP3 CD基因表达的亚组分析;而在加州大学亚组分析,这两个突变SNPS-rs10754558和rsl0925019 NLRP3基因与UC的发病率有关,证明NLRP3基因发挥了重要作用在加州大学在中国患者的发病机理16]。诱发小鼠在急性结肠炎模型由葡聚糖硫酸酯钠(DSS), NLRP3基因敲除或医疗抑制NLRP3 inflammasome激活都对老鼠产生保护作用[17,18]。然而,芒柄花黄素是否监管影响NLRP3 inflammasome通路仍然还不清楚。在这项研究中,我们旨在探讨芒柄花黄素的保护作用DSS-induced急性结肠炎和调查潜在的基本机制。
2。材料和方法
2.1。老鼠和试剂
8 - 12个雄性C57BL / 6小鼠从比较购买扬州大学医学中心(扬州,江苏,中国)。所有老鼠都安置在一个特定的无菌(SPF)标准间12/12 h在每个周期26°C,相对湿度45%,鉴于水随意,美联储标准实验室,并被允许适应新环境至少1周。所有方法进行按照实验动物保健原则(NIH发布85号每个,1996年修订),和所有实验协议实验动物伦理委员会批准扬州大学的附属医院。
芒柄花黄素(F141481)从阿拉丁购买生化科技公司(阿拉丁,上海,中国),和DSS从议员生物医学公司购买(MP生物医学,圣安娜、钙、美国)。ab9535主要抗体:髓过氧化酶(MPO),集群分化68 (CD68 ab955) claudin-1 (ab15098) occludin (ab31721) zonula occludens-1 (ZO-1 ab59720) interleukin-1β(il - 1β、ab9722)和GAPDH (ab8245)从Abcam购买公司(Abcam,剑桥,英国),anti-NLRP3(15101)抗体购自春秋国旅公司(细胞信号技术,波士顿,美国),和anti-ASC (sc - 22514 r)抗体购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。山羊anti-rabbit和兔子anti-mouse二级抗体购自Abcam公司(Abcam,剑桥,英国)。重组人肿瘤坏死因子-α(TNF -α)从开曼群岛公司购买(美国密歇根州开曼群岛)。5-dimethylthiazol-2-yl MTS (3 - (4), 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium)测定从Promega购买公司(WI Promega,麦迪逊,美国)。
2.2。体内实验设计和程序
实验小鼠被随机分配到五组( 每组):车辆、DSS、低剂量芒柄花黄素(25毫克/公斤,L-dose)中芒柄花黄素(50毫克/公斤,M-dose)和高剂量芒柄花黄素(100毫克/公斤,H-dose)组。除了汽车集团给予其他四组小鼠DSS的解决方案(2.5%,溶解在蒸馏水)随意诱导急性结肠炎模型;与此同时,汽车集团管理蒸馏水等价。药物干预组小鼠(L-dose、M-dose H-dose集团)是每日注射芒柄花黄素(溶解在5% DMSO)腹腔内,当车辆组和DSS模型组管理5% DMSO以同样的方式。
为了抑制NLRP3 inflammasome体内,老鼠接受MCC950(50毫克/公斤, )腹腔内(老鼠与PBS对照组治疗, 每隔一天)从之前一天到第七天的DSS管理局(18]。与此同时,高剂量芒柄花黄素(100毫克/公斤)是治疗每日1 - 8天DSS管理局( )来识别潜在的分子机制的芒柄花黄素在急性结肠炎。
急性结肠炎的严重程度是判断通过测量体重,粪便一致性,和总便血的发生在老鼠身上每一天,和疾病活动指数(DAI)得分也用于评估结肠炎的疾病严重程度。戴得分分级规模的计算使用以下参数(0到419]:失去体重(0,正常;1、0 - 5%;2、5 - 10%;3、10 - 15%;4,> 15%)、粪便一致性(0,正常;2、便溏;4、腹泻),出现便血总值(0,-;2、轻微的出血;4、严重出血)。合并后的戴打进了两个独立的调查。
九天后DSS管理、动物麻醉与戊巴比妥钠腹腔内管理(50毫克/公斤)然后牺牲;他们的远端结肠组织立即解剖。结肠组织的一部分是固定的组织学分析,其余都储存在−80°C进行进一步调查。从尾静脉和获得血液样本存储在−80°C进行分析。
2.3。组织学检查
远端结肠组织固定在4%多聚甲醛(溶解在PBS)和嵌入在石蜡和苏木精和伊红染色。两名调查人员盲目的实验治疗得分由光学显微镜结肠损伤的程度。结肠损伤的严重程度是由以下参数评估(20.]:上皮损伤(0,正常;1、最小损失的杯状细胞;2、杯状细胞的大量损失;3,最小损失的隐窝和广泛的杯状细胞的损失;4、广泛的隐窝损失);和渗透(0,正常;1,渗透在地下室基地;2,在消化道粘膜渗透;3、广泛渗透在消化道黏膜水肿;4,黏膜下层的渗透)。
2.4。体外细胞培养和治疗
人类结肠癌细胞系hct - 116购买从中国科学院上海细胞库(上海,中国),用于体外实验。hct - 116细胞培养在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)补充10%胎牛血清在37°C和湿润的气氛中含有5%的股份有限公司2。肿瘤坏死因子-α(100 ng / ml)是用于建立一个细胞损伤模型(21),hct - 116细胞与不同浓度的芒柄花黄素(25孵化μ50米,μ米)或0.1% DMSO(车辆)来验证芒柄花黄素的保护作用。十二个小时芒柄花黄素干预后,细胞蛋白提取和存储进行进一步的实验。
利用MTS试验细胞生存能力评估。后1 h (hct - 116细胞的粘附,不同剂量的芒柄花黄素(溶解在DMSO)或TNF -α(溶解在PBS)镀在96 -孔板和井只包含hct - 116在完全培养基(0.1% DMSO溶液或PBS)作为对照组。十二小时后,细胞治疗与MTS按照制造商的指示。
2.5。免疫荧光(如果)和免疫印迹(WB)
如果和世行分析进行了如前所述[22,23]。一夜之间,短暂,如果分析,幻灯片被孵化在4°C潮湿室针对MPO抗体(1:500稀释)、CD68(1: 200稀释),claudin-1(1: 200稀释),occludin(1: 200稀释),ZO-1(1: 200稀释),和NLRP3(1: 200稀释),然后通过生物素化的二次孵化抗体(1:500稀释)60分钟。世行分析,聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜被封锁了5% (w/v)牛血清白蛋白Tris-buffered盐水/ 0.05% tween-20 (TBST)在室温下2 h在密闭容器和孵化一夜之间在4°C主要抗体NLRP3(1: 1000稀释),ASC(1: 1000稀释),il - 1β(1:1000稀释),claudin-1(1: 1000稀释),occludin(1: 1000稀释),ZO-1(1: 1000稀释),和GAPDH(1: 2000稀释)阻断缓冲区。第二天,膜清洗与TBST (310分钟)和二次孵化山羊anti-mouse或山羊anti-rabbit免疫球蛋白辣根过氧化物酶(合)抗体(1:10000稀释)稀释5% (w/v)干脱脂牛奶在室温下TBST 1 h。最后,膜与TBST洗(310分钟),由使用ECL检测系统(圣克鲁斯生物技术),迅速干燥,暴露于ECL的电影。
2.6。酶联免疫吸附试验(ELISA)
ELISA分析进行了如前所述[24]。短暂,结肠组织匀浆在PBS,然后进行离心(12000转4°C, 30分钟)获得上层清液。肿瘤坏死因子-α和il - 1β水平测量商业套件(Affymetrix ebioscience,圣地亚哥,美国)。
2.7。统计分析
统计分析是由SPSS 22.0软件。结果提出了均值±标准差(SD)。克鲁斯卡尔-沃利斯测试Mann-Whitney紧随其后U测试是用来评估组织病理学评分的差异。执行统计分析使用单向方差分析其次是Student-Newman-Keuls测试作为一种事后测试。的值 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。芒柄花黄素防止DSS-Induced急性结肠炎小鼠
正如所料,结肠损伤、体重减轻、血便,和腹泻后被观察到小鼠DSS喂食。芒柄花黄素管理之后,我们发现芒柄花黄素能缓解临床症状的急性结肠炎小鼠剂量依赖性的方式。DSS组小鼠的体重下降了15%,相比之下,在H-dose管理组小鼠的体重下降了6.7% DSS喂养(图9天后1(一));与此同时,戴笠分数11和4.5两组,分别。(图1 (b))。然后,我们进一步检查结肠组织病理学损伤的程度来评估疾病严重程度的结肠炎,发现汽车组的组织病理学表现作为一个正常的结肠的外表,而在DSS集团的组织病理学特征显示为结肠上皮细胞损伤,大量炎症细胞浸润黏膜和黏膜下层的结肠;相比之下,H-dose芒柄花黄素(100毫克/公斤)明显减轻结肠黏膜损伤的组织学特征,认为低程度的上皮细胞损伤和炎症浸润。此外,芒柄花黄素的保护作用急性结肠炎似乎存在剂量依赖的相关性,我们未能证实芒柄花黄素的保护作用L-dose组(25毫克/公斤)(数据1(e)和1(f))。此外,至于结肠芒柄花黄素治疗后的平均长度的变化(数据1 (c)和1 (d)),变化趋势与组织病理学表现的结果是相一致的。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(一)
(b)
3.2。芒柄花黄素减少结肠炎症小鼠
中性粒细胞和巨噬细胞的渗透可能被视为疾病严重程度的评价参数在急性结肠炎小鼠。如图2(一个)显示,MPO和CD68染色结果是积极的在小鼠结肠炎,表明大量的中性粒细胞和巨噬细胞浸润到结肠组织。芒柄花黄素管理后,有中性粒细胞和巨噬细胞浸润较少在结肠组织受伤。此外,在小鼠的结肠炎性细胞因子的水平是由ELISA检测方法评估急性结肠炎的严重程度;正如所料,TNF -的水平α和il - 1β芒柄花黄素治疗后明显降低(图2 (b))。结果炎性浸润和炎性细胞因子表达与病理结果相一致。
3.3。芒柄花黄素缓解DSS-Induced结肠上皮紧密连接中断老鼠
紧密连接(TJ)是一种重要的结构基础,维护肠粘膜上皮细胞之间的机械屏障功能中扮演着一个关键的角色在肠上皮屏障完整性(25,26]。我们观察到紧密连接蛋白的表达,如claudin-1 occludin,和ZO-1显著降低DSS-induced结肠炎小鼠结肠组织的采用世行和免疫荧光方法,正如我们所料,紧密连接蛋白的表达在正相关与肠上皮屏障结构的完整性。不出所料,芒柄花黄素管理后,claudin-1的表情,occludin, ZO-1蛋白质中和(数字3(一个)- - - - - -3 (c)),它提供了另一个有力的证据对小鼠结肠炎芒柄花黄素的保护作用。
(一)
(b)
(c)
3.4。芒柄花黄素抑制NLRP3途径在小鼠结肠上皮细胞
先前的研究表明,NLRP3 inflammasome通路发挥了重要作用在急性结肠炎小鼠结肠组织损伤(17,18,27]。在这项研究中,通过使用免疫组织化学染色,我们首先发现,NLRP3在结肠组织的表达升高DSS-induced结肠炎和芒柄花黄素降低NLRP3通路(图的激活4(一))。接下来,我们观察到NLRP3的表情,il - 1βASC在结肠组织中蛋白质增加,这表明NLRP3 inflammasome通路被激活在小鼠结肠炎的发病机制。正如我们所料,芒柄花黄素政府减少了NLRP3的表情,il - 1β和ASC显著(数字4 (b)和4 (c)),这表明芒柄花黄素可以发挥对结肠组织损伤的保护作用抑制NLRP3通路的激活。
(一)
(b)
(c)
3.5。芒柄花黄素防止结肠上皮细胞紧密连接的破坏和抑制体外NLRP3途径
为了进一步明确芒柄花黄素的保护作用急性结肠炎、结肠细胞线hct - 116来进行体外实验。首先,我们测试了hct - 116细胞的细胞生存能力与TNF -α和芒柄花黄素治疗(补充图S1,a - b),结果表明:芒柄花黄素施加hct - 116, TNF -没有毒性α剂量依赖性降低hct - 116细胞的细胞生存能力。根据以前的文献[21),肿瘤坏死因子-α(100 ng / ml)是用于建立体外结肠细胞损伤模型实验。接下来,治疗后与TNF -α和芒柄花黄素(25μ50米,μ米),紧密连接蛋白的表达(claudin-1、occludin ZO-1)和NLRP3 inflammasome通路(NLRP3, il - 1βWB和ASC)进行检测的方法。不出所料,芒柄花黄素结肠细胞免受损伤的增加claudin-1的表情,occludin和ZO-1(数字5(一个)和5 (b))一起NLRP3的表达减少,il - 1β和ASC(数字5 (c)和5 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.6。NLRP3抑制剂MCC950的保护作用可以消除H-Dose芒柄花黄素在小鼠急性结肠炎
进一步确定芒柄花黄素的潜在机制在小鼠急性结肠炎,根据上述结果,MCC950, NLRP3-specific抑制剂(28),而高剂量芒柄花黄素(100毫克/公斤)采用进行以下实验。实验协议芒柄花黄素和MCC950急性结肠炎模型如图6(一);MCC950(50毫克/公斤)是每隔一天腹腔注射抑制小鼠的NLRP3活动。类似于前面的文献结果(18],MCC950可以显著减轻体重的损失,减少戴分数,和减轻结肠病理损伤的老鼠,虽然政府H-dose芒柄花黄素和MCC950未能显示协同效应,这意味着减轻体重的损失的保护作用,减少戴分数和减轻结肠病理损伤的老鼠之间没有显著差异H-dose芒柄花黄素+ MCC95集团和MCC950集团(数字6 (b)- - - - - -6 (g))。此外,我们的研究结果表明,NLRP3的表情,il - 1β,ASC减少而claudin-1的表情,occludin,和ZO-1增强小鼠结肠组织MCC950政府后,但上面的表达蛋白质未能显示显著区别H-dose芒柄花黄素+ MCC95集团和MCC95集团(数字6 (h)和6(我),补充图S3)。所有这些研究结果表明,芒柄花黄素对急性结肠炎小鼠DSS-induced发挥保护作用通过抑制NLRP3 inflammasome途径。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
4所示。讨论
在这项研究中,我们首次证实,芒柄花黄素能缓解DSS-induced急性结肠炎小鼠通过抑制NLRP3通路。溃疡性结肠炎(UC)是一种非特异性炎症性肠病,主要的病理特征存在炎症反应和溃疡形成直肠或结肠黏膜和黏膜下层的。患者通常表现为腹痛、血便,和腹泻为主要症状,积极缓解阶段经常出现,最终形成一个复发的慢性疾病。DSS是用于第一次建立经典的急性结肠炎模型在1985年由Ohkusa啮齿动物29日]。这部小说DSS-induced结肠炎模型很容易准备,经济,和可以复制人类结肠炎的发病机制适当和准确,所以DSS-induced模型是最常用的动物模型之一结肠炎研究[30.,31日]。在这项研究中,我们采用2.5% DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型稳定。
本研究集中在芒柄花黄素在DSS-induced结肠炎小鼠的保护作用。之前的研究表明,20毫克/公斤芒柄花黄素能有效地防止lipopolysaccharide-induced急性肺损伤(7)和改善alloxan-induced高血糖小鼠的血糖水平(32];金等人透露,芒柄花黄素(50毫克/公斤或100毫克/公斤)剂量依赖性降低,acetaminophen-induced小鼠肝毒性(33]。因此,我们选择梯度剂量的芒柄花黄素(25毫克/公斤,50毫克/公斤,和100毫克/公斤)的动物实验。幸运的是,结果表明:芒柄花黄素减轻炎症反应的小鼠结肠炎剂量依赖性的方式,经组织病理学表现,结肠的长度,和临床症状的老鼠。此外,芒柄花黄素政府减少中性粒细胞和巨噬细胞的渗透进入结肠组织。总的来说,这些结果表明,芒柄花黄素可以有效地减轻小鼠结肠炎的炎症反应。
紧密连接的破坏中起关键作用的开发和进展炎症性肠病(25,26]。在以前的动物实验(34),它已经发现,先天性与肠上皮细胞紧密连接蛋白基因敲除小鼠出现病理变化类似与IBD出生后,这意味着claudins参与炎症性肠病的发病机制。此外,采用免疫荧光和免疫印迹,它可以观察到,claudin-1的表情,occludin, ZO-1 DSS-induced急性结肠炎模型中表达下调大鼠(35,36]。大量的研究表明,恢复和维持肠道粘膜屏障功能有利于改善肠粘膜的防御功能,促进疾病康复,减少复发的炎症性肠病(37,38]。我们的结果表明,上皮细胞紧密连接蛋白的表达claudin-1, occludin, ZO-1明显降低体内DSS-induced结肠炎和TNF -α全身的细胞损伤模型体外,而芒柄花黄素管理之后,我们发现,芒柄花黄素增加claudin-1的表情,occludin,和ZO-1显著,这表明芒柄花黄素可以保护结肠粘膜的完整性和维护结肠炎的结肠上皮屏障功能。
NLRP3表现为最重要的模式识别受体NLR家庭成员和识别危险信号,细胞病原体或细胞本身39),它可以结合ASC形成multimeric蛋白质复合体是叫NLRP3 inflammasome。过度激活NLRP3 inflammasome已经证明发挥关键作用在各种炎症性疾病,如糖尿病(40),阿尔茨海默病(41),和动脉粥样硬化42]。同样,NLRP3 inflammasome发挥了至关重要的作用在炎症性肠病的发病机制17,18]。先前的研究表明,NLRP3的表情,ASC,结肠组织中,caspase-1大幅提高结肠炎患者和动物模型;与此同时,疾病的严重性NLRP3结肠炎的ASC,和caspase-1基因敲除小鼠放心的往往是与野生型小鼠相比,表明NLRP3 inflammasome通路的开发和发展产生了巨大的影响结肠炎。更重要的是,NLRP3途径的抑制可能减轻结肠炎的疾病严重程度18]。在这项研究中,芒柄花黄素表现出极大的抑制作用的表达式NLRP3, ASC和il - 1β并降低il - 1的分泌β明显在结肠上皮细胞在体内和体外。令人惊讶的是,NLRP3-specific抑制剂MCC950可以缓解DSS-induced急性结肠炎小鼠;然而,在管理的基础MCC950 NLRP3抑制激活,我们未能观察到急性结肠炎另外芒柄花黄素的保护作用。基于上述结果,我们的研究首次证明了NLRP3的抑制作用inflammasome芒柄花黄素途径。
5。结论
通过这项研究,我们得出结论:芒柄花黄素可以保护结肠上皮细胞损伤减轻疾病的严重程度通过抑制小鼠结肠炎NLRP3 inflammasome途径。芒柄花黄素可能是一个有前途的战略在未来的临床预防和治疗IBD。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
大成吴,吴柯桥柯岩,青田朱的贡献同样这项工作。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(81471547和81471547号)和江苏省的国家自然科学基金(没有。BK20161339)。
补充材料
图S1:芒柄花黄素的化学结构。图S2:细胞生存能力是衡量MTS试验在不同浓度的TNF -α(A)和芒柄花黄素(B) hct - 166细胞。数据显示为相对细胞生存能力(意思是%±S.E.酒吧)相比,在控制( )。图S3: NLRP3抑制剂MCC950消除h在急性结肠炎小鼠的保护作用。蛋白质水平的(A) claudin-1、occludin ZO-1和(B) NLRP3, ASC和il - 1β被免疫印迹分析。 , 。(补充材料)