文摘

背景。过度自噬是心肌缺血再灌注损伤的主要机制(I / RI)与增强氧化应激在糖尿病。抗氧化剂防治(NAC)降低心肌I / RI。未知如果抑制自噬可能代表一种机制,NAC授予在糖尿病心脏保护。方法和结果。糖尿病在Sprague-Dawley诱导大鼠治疗链脲霉素和他们没有或NAC(1.5克/公斤/天)四个星期之前接受冠状动脉闭塞30分钟和2小时再灌注。结果表明,心脏15-F2t-Isoprostane水平增加,自噬被证明为增加的比率LC3 II /我和蛋白质P62 AMPK和mTOR表达式在糖尿病和非糖尿病的老鼠相比,显著增加伴随增加缺血后心肌梗塞的大小以及释放但Akt减少和以挪士激活。糖尿病也与增加缺血后凋亡细胞死亡有关表现为增加TUNEL阳性细胞,cleaved-caspase-3,比伯灵顿/ bcl - 2蛋白表达。NAC显著减毒I / RI-induced增加氧化应激和心肌细胞凋亡,在糖尿病预防缺血后自噬形成,减少缺血后心肌梗死(所有)。结论。NAC授予对糖尿病心脏保护心脏I / RI主要通过抑制过度自噬这可能是一个主要的机制为什么糖尿病心不太宽容I / RI。

1。介绍

缺血性心脏病是最严重并发症的糖尿病,从而增加发病率和死亡率(1]。缺血性心脏血流量恢复,也就是说,再灌注,是唯一以挽救缺血心肌的决议。然而,缺血性心脏再灌注本身也会造成额外伤害,被称为缺血再灌注损伤(I / RI)。大量研究表明缺血和再灌注诱导的生产活性氧(ROS)的氧化损伤和炎症(2]I / RI的主要机制。增加ROS也有助于降低心血管保护一氧化氮的生物利用度和障碍prosurvival再灌注损伤抢救激酶通路包括PI3K / Akt(风险)和生存激活因子增强(安全)通路包括Jak /信号传感器和转录激活3 (STAT3) [3]。这些prosurvival通路的损害可能会导致损伤的分子的身份线粒体渗透性转换孔注射(mPTP药物)是决定性的对心肌细胞的生存4),包括调节细胞凋亡和自噬通过AMPK / mTOR信号(5]。高血糖是糖尿病的主要特征,导致活性氧过剩和干扰氧化剂和抗氧化剂止血和加重心肌I / RI在糖尿病。抗氧化剂防治心脏ROS (NAC)已经被证明可以减少生产过剩在糖尿病6),减少心肌I / RI和改善糖尿病大鼠缺血后心脏功能(7,8通过衰减I / RI-mediated凋亡细胞死亡。最近的研究表明,自噬是细胞死亡的主要形式之一的情况下心肌I / RI和自噬增强心肌的糖尿病患者在特定阶段的疾病,当糖尿病的心更容易受到缺血性的侮辱。未知是否衰减的自噬可能代表一种机制,NAC授予对我/ RI在糖尿病心脏保护。

自噬,自毁长寿或聚合的蛋白质和受损的细胞器,是重要的生活的基本功能主要营养体内平衡,能源打捞和退化,细胞内细胞器的故障(9]。此外,自噬可以提供免疫保护和入侵的病原体。最近的研究表明,自噬可能与II型程序性细胞死亡相关,可以启动细胞死亡在不同的情况下和在神经退行性疾病中扮演不同的角色10,癌症11),肝脏疾病(12[],心脏疾病13),代谢综合症(14),老化(15),和炎症16]。先前的研究表明,自噬调节在心肌缺血/再灌注(I / R)和暗示,它可能是心血管缺血期间,但连续激活自噬在再灌注是有害的17]。腺苷5′-monophosphate-activated蛋白激酶(AMPK)是一个传感器的能量分子ATP激活当ATP / ADP的比例是下降在运动过程中,缺氧、氧化应激、葡萄糖剥夺,和心肌I / R (18]。AMPK也是一个主要的监管机构/激活自噬的19]。另一方面,哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)抑制自噬心的报道。激活AMPK导致mTOR活动减少,增加了自噬,减毒缺血后心肌再灌注损伤(20.,21]。同样,郭等人报道,缺血后处理通过清算自噬小体减少缺血后心肌损伤和恢复自噬流(22]。然而,在糖尿病心肌,心脏自噬的程度已被证明是增强或减少根据模型和持续时间的疾病易感性缺血性侮辱是增强23,24]。因此,自噬在糖尿病心肌I / RI的作用尚不清楚。我们假设衰减I / RI-induced自噬是一个主要的机制NAC授予在糖尿病心脏保护。因此,本研究主要目的是探讨南汽在糖尿病大鼠的心脏保护与自噬的关系。

2。材料和方法

2.1。诱导的糖尿病

糖尿病是由单剂量(65毫克/公斤)链脲霉素(STZ) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)在雄性老鼠Sprague-Dawley(250克,6 - 8周)通过尾静脉注射,我们描述25]。所有老鼠被安置在实验室动物服务中心(香港大学)和接受标准治疗的动物保健原则按照香港大学。实验协议被委员会批准使用的动物生活在教学和研究(CULATR)。

2.2。试验协议

老鼠被随机分为四组:按Ctrl:非糖尿病的控制;D4w:四周糖尿病;D4w + I / R: 4周的糖尿病大鼠缺血/再灌注;D4w + I / R + NAC: 4周的糖尿病大鼠(NAC)和处理防治受到缺血/再灌注(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)。这些化学物质溶解在饮水4周的治疗开始后一周时间诱导糖尿病。我们选择一剂NAC 1.5克/公斤/天,正如我们先前的研究报道,南汽剂量的1.4 - -1.5克/公斤/天完全预防高血糖诱导的氧化应激在糖尿病大鼠8周的STZ-induced [26]。

I / R是通过阻碍左前降枝(小伙子)动脉30分钟紧随其后的是两个小时再灌注和心肌梗死决心用TTC(1%, 2、3、去除氯)染色[描述27]。简单地说,年底再灌注,小伙子reoccluded;5%伊文思蓝是通过正确的颈静脉注射的正常区域的左心室(LV)。完成的实验,与过量戊巴比妥注入老鼠安乐死,心中很快被删除,切成五1 - 1.5毫米的横断面切片和孵化PBS TTC 1%在室温20分钟。片然后用10%福尔马林固定过夜。TTC染色区域目标的地区生存的区域。LV的部分组织被选为免疫印迹。PowerLab监测系统(ML750 PowerLab / 4 sp MLT0380可重用的英国石油(BP)传感器;广告工具,弹簧有限公司,有限公司)被用来监测心肌I / R过程中血液动力学。

2.3。血浆和心脏水平的自由15-F2t-Isoprostane (15-F2t-IsoP)

自由15-F2t-IsoP,特定的氧化应激标记体内最初产生的随机组织磷脂的氧化,使用酶免疫分析法测定工具包(开曼化工、安阿伯、MI)作为描述(28]。酶促反应的吸光度检测在412海里。等离子体的值或心脏免费15-F2t-IsoP表示为pg / mL的等离子体。2小时后再灌注血液样本收集从颈动脉与肝素抗凝,然后离心分离血浆我们描述27]。

2.4。等离子体生化分析

血浆肿瘤坏死因子- - - - - -α(肿瘤坏死因子-α使用大鼠肿瘤坏死因子-)级别确定α酶联免疫试剂盒(加拿大安大略省eBiosource国际,伯灵顿)。血浆肌酐kinase-MB(水平)水平测定使用商用鼠酶联免疫试剂盒(研发系统、明尼阿波利斯、MN)。血浆白细胞介素- 6 (il - 6)水平是决定使用鼠il - 6酶联免疫试剂盒(加拿大安大略省eBiosource国际,伯灵顿)。分析后进行了制造商的指示。

2.5。原位检测凋亡细胞死亡

凋亡细胞死亡检测是通过使用TdT-mediated DUTP-X尼克结束标记(TUNEL染色)根据制造商的指令(罗氏应用科学,印第安纳波利斯,美国)。首先,左心室组织嵌入由石蜡切片和deparaffinized(5毫米厚的部分)。第二,部分permeabilized使用蛋白酶K(30毫克/毫升,30分钟,37°C)和在磷酸盐缓冲盐水洗(PBS)。当制造商的说明描述检测凋亡细胞,DNase我被用来诱导DNA链断裂,积极控制和负负控制从反应混合物中被省略了。

2.6。免疫印迹分析

蛋白质从冷冻LV组织均质在1 x从细胞裂解缓冲信号技术(贝弗利,MA)和离心速度为1320030分钟。上层清液的收集总心肌蛋白质。上层清液的收集总心肌蛋白质。蛋白质的浓度被确定使用布拉德福德蛋白质分析。

等量的蛋白质的老鼠心脏匀浆是由7.5 - -12.5% sds - page,随后转移到解决聚偏二硝基乙烯膜和加工如前所述28]。主要抗体AMPKα,磷酸化AMPKα、一种蛋白激酶磷酸化Akt (ser - 473), LC3, P62, mTOR,磷酸化PTEN、伯灵顿,bcl - 2、半胱天冬酶3 cleaved-caspase-3, GAPDH从细胞信号技术购买(贝弗利,MA)。蛋白质乐队被检测到一个标准的ECL密度计测量方法和图像。

2.7。统计分析

所有的值表示为意味着±标准平均误差(SEM)。单向方差分析(方差分析)是用于统计分析(美国GraphPad棱镜)获得的数据在同一组和组之间,分别,紧随其后的是图基组的多个测试比较的意思。值小于0.05被认为是表明统计上显著的差异。

3所示。结果

3.1。南汽的影响一般人物,缺血后心肌侵害大小(),并在糖尿病大鼠心脏功能

首先,我们观察到的影响南汽在糖尿病大鼠一般人物。如表所示1,STZ-induced糖尿病大鼠血糖、水的摄入量,和食品消费显著增加与非糖尿病患者相比(所有的老鼠)。NAC治疗后,食品消费和水的摄入量相比显著降低糖尿病组(所有),但南汽在糖尿病大鼠的血糖无显著影响()。在糖尿病大鼠体重显著降低,NAC对体重没有显著影响。

如图1(一),NAC显著降低缺血后心肌梗塞大小(是)在糖尿病大鼠(,南汽+ D4w + I / R和D4w + I / R)。和缺血后血浆水平水平2小时再灌注后虚假的操作相比明显高于糖尿病组(D4w + I / R和D4w)。南汽显著降低缺血后水平,按照低()。

如表所示2组之间,基线血液动力学日期是相同的。心率(HR)基线不是4中不同的群体。冠状动脉闭塞(缺血)降低平均动脉压(MAP)和速压力乘积(RPP)在所有组与基线相比地图。之间没有显著差异在人力资源或RPP观察组缺血和再灌注期间。NAC治疗促进复苏的地图再灌注后与对照组相比,糖尿病组。

3.2。NAC对等离子体的影响15-F2t-Isoprostane (15-F2t-IsoP)、白细胞介素- 6 (il - 6)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)水平

我们确定等离子体15-F2t-IsoP(特定的氧化应激标记),il - 6和TNF -α水平控制和糖尿病大鼠有或没有NAC治疗。如数据所示2(一个),2 (b),2 (c)、血浆il - 6和TNF -α水平增加大鼠糖尿病患者以及15-2t-IsoP显著增加(所有D4w与非糖尿病患者组),这些都进一步加剧了心肌I / RI (D4w + I / R和D4w)。NAC治疗显著降低但并没有阻止糖尿病大鼠血浆il - 6水平的增加。相比之下,NAC显著降低血浆TNF -α和15-F2t-IsoP水平相比,糖尿病大鼠受到I / R(所有)。

3.3。NAC对缺血后心肌细胞凋亡的影响,伯灵顿/ bcl - 2,和Caspase-3表达式

如图3(一个)显示,STZ-induced糖尿病大鼠有显著更多的TUNEL-staining阳性细胞与非糖尿病患者相比集团(),同时增加的比率伯灵顿/ bcl - 2、cleaved-caspase-3和心肌I / R凋亡细胞的数量进一步增加,而NAC治疗显著减毒引起的凋亡细胞I / R ()。NAC显著减毒的增加比伯灵顿/ bcl - 2和预防糖尿病和I / RI-induced cleaved-caspase-3表达式(所有的增加)。

3.4。NAC对糖尿病的影响诱导心肌自噬及其相关蛋白

自噬已被证明在I / RI扮演主要角色。作为数据4(一)和4(b)显示,道达尔和磷酸化AMPKα(p-AMPKα自噬的),一个强大的引发剂,显著提高糖尿病大鼠心肌的相比,在非糖尿病的大鼠()。I / R p-AMPK进一步增加α(AMPK),但没有显著的影响α。LC3 II /我的比例代表自噬的程度。作为数据4(c)和4(d)显示,STZ-induced糖尿病大鼠有显著更高比例的LC3 II /我比非糖尿病患者组()。P62,功能明确的自噬小体,以保持止血,还显著增加在糖尿病大鼠的心肌(,D4w与非糖尿病患者的)。I / R没有进一步大幅增加LC3 II /我和P62。NAC治疗完全预防糖尿病诱导增加LC3 II /我和p62蛋白质表达前后I / R比D4w +红外()。在糖尿病组、心肌mTOR蛋白表达显著增加(图4(e))与p-AMPK显著增加α。然而,在I / R,心肌mTOR适度和显著降低I / R诱导p-AMPK进一步增加α(所有D4w + I / R和D4w)。NAC治疗预防糖尿病和I / R诱导mTOR的增加(D4w + I / R + NAC对D4w + I / R)。

3.5。PTEN的变化,一种蛋白激酶,NAC治疗后以挪士

PTEN已被证明在心肌I / R扮演重要角色;抑制PTEN可能减少I / RI表现为减少侵害大小,增加一种蛋白激酶和以挪士激活,和改善心脏功能29日,30.]。根据先前的研究,心脏磷酸化PTEN (p-PTEN)蛋白表达(图5(一))是由高血糖显著增加(D4w与非糖尿病的老鼠)和I / R进一步增加糖尿病p-PTEN表达式。与非糖尿病患者组相比,心脏磷酸化Akt (p-Akt)和以挪士(数字5(b)和5(c))显著降低糖尿病组与显著增加心脏p-PTEN相伴。NAC治疗完全预防糖尿病和I / R诱导增加p-PTEN和显著衰减减少p-Akt p-eNOS I / R(引起的D4w + I / R + NAC对D4w + I / R)。

4所示。讨论

高血糖是糖尿病的主要特征以及增强氧化应激。在当前的研究中,15-F2t-IsoP水平显著增加了4周的糖尿病大鼠,NAC治疗减少了15-F2t-IsoP水平随着衰减I / RI。这些发现符合的结果由美国和其他组织最近的研究表明,抗氧化剂治疗NAC可以减弱心肌I / RI在糖尿病。这部小说发现当前研究自噬增加4周的糖尿病大鼠心肌的可能是糖尿病的主要机制,使心脏更容易变弱,NAC治疗心肌缺血性侮辱我/ RI在糖尿病主要通过抑制和防止过度自噬。

的心,自噬扮演着关键的角色在许多心血管疾病病理刺激,包括心脏肥厚、心力衰竭、心肌I / R。自噬被提升为指示反应ATP耗竭和活性氧积累(31日,32]。在糖尿病小鼠,autophagy-associated-gene (ATG5)淘汰赛,自噬是受损,导致线粒体功能障碍和ROS生产过剩(33),这表明维持正常功能的自噬对糖尿病心脏功能至关重要。在我们之前的研究中,我们发现抗氧化剂NAC治疗可以减少ROS水平和I / RI在糖尿病大鼠(8],在当前的研究中我们发现,NAC可以预防糖尿病和I / R过度自噬诱导大鼠糖尿病和恢复正常的自噬功能的受I / R和随后减少I / RI。心脏自噬已报道的程度是减少在[34]或者增强[35)在糖尿病疾病的不同阶段,但自噬的影响对糖尿病心脏缺血性侮辱脆弱性在很大程度上是未知的。而适度增加心肌缺血期间的自噬已被证明是有益的,但过度自噬在再灌注是有害的(24]。线粒体作为细胞的力量,心肌细胞动作电位尤其是大型能源需求的能源。线粒体通透性转换孔注射(mPTP药物)在心肌I / RI起着关键作用。ROS在I / RI的增加提高了注射的可能性mPTP药物打开后再灌注(4]。在这项研究中,过度自噬被发现在4周的糖尿病大鼠心肌I / R,伴随着高水平的15-F2t-IsoP, il - 6、TNF -α、细胞凋亡、NAC治疗4周减毒所有这些变化,这应该注射减少mPTP药物打开,虽然需要进一步的研究来证实它。之间的潜在的因果关系,糖尿病引起的过度自噬,细胞凋亡、炎症和氧化应激中心肌I / RI尚未确定。

自噬不仅与细胞存活,但也与细胞死亡的紧密关系。报道,自噬细胞死亡是半胱天冬酶独立,显然是不同于凋亡细胞死亡,但他们可以发生在混合形式与自噬和凋亡相关的半胱天冬酶功能。我们的研究结果表明,NAC可以降低I / R诱导细胞凋亡,体现积极通过减少凋亡细胞,伯灵顿的比例/ bcl - 2,和表达cleaved-caspase-3但对自噬有更深远的影响,因为它可以减弱自噬在更大程度上。相比,这表明细胞凋亡、自噬在糖尿病I / RI,扮演主要角色,减少过度自噬可能是一个潜在的治疗在糖尿病I / RI。

AMPK serine-threonine激酶,功能主要是代谢传感器协调细胞的合成代谢和分解代谢的活动来维持细胞内稳态能量通过多个蛋白质的磷酸化参与代谢途径(36]。它对许多信号通路的影响,自噬和凋亡等(37,38]。我们的研究结果表明,在糖尿病大鼠早期,p-AMPKα是显著增加引起的糖尿病或糖尿病I / R和心脏mTOR的增加不足以对抗p-AMPK是糖尿病α促进自噬,这导致过度自噬所反映的显著增加的比率LC3 II /我和蛋白质P62表达和加重了缺血后I / RI。NAC治疗完全预防糖尿病I / R p-AMPK诱导增加α和减少了比LC3 P62 II /我和蛋白质表达水平与正常控制以及减少mTOR并存。I / R在糖尿病没有进一步增加的程度自噬尽管I / R诱导p-AMPK进一步显著增加α和伴随的温和但显著减少mTOR可能表明心脏过度自噬已经发生在糖尿病心肌I / RI的主要因素。发现NAC能减少心脏p-AMPK的激活α符合我们之前的研究(28]。在最近的研究中,NAC恢复了自噬流,防止糖尿病和I / R p-PTEN诱导增加,和减毒减少p-Akt p-eNOS I / R带来心脏保护效应引起的糖尿病大鼠。抑制p-PTEN可以减弱心肌I / RI在糖尿病大鼠(39]。然而,PTEN之间潜在的相互作用和自噬及其调节分子如mTOR的糖尿病心肌I / RI尚未报道。我们当前研究的结果或许刺激进一步深入研究这个有趣和重要的地区培育的发展有效的疗法在抗击糖尿病心肌I / RI。

总之,我们发现自噬过度在4周的糖尿病,这是不利于I / RI。抗氧化治疗NAC可以抑制自噬在4周的糖尿病大鼠和减少I / RI。NAC授予对糖尿病心脏保护心脏I / RI主要通过抑制过度自噬形成后减少氧化剂应激在糖尿病。

4.1。临床的视角

糖尿病患者更容易受到心肌I / RI。本研究旨在探讨自噬在南汽的角色赋予在糖尿病心肌I / R损伤心脏保护效应。我们的研究结果表明,自噬过度在4周的糖尿病,这是不利于I / RI。抗氧化治疗NAC可以抑制自噬在4周的糖尿病大鼠和减少I / RI。强烈建议针对抑制过度自噬可能是一个潜在的治疗策略治疗糖尿病危害心脏疾病的患者。通常急性心肌梗死患者的氧化应激水平增加与减少酶抗氧化储备尤其是在糖尿病患者,而条件治疗,如glucose-insulin-potassium解决方案没有改善这些异常患者中发生主要血管成形术(40]。发现从我们目前的研究显示抗氧化治疗NAC作为一个潜在的辅助治疗。

相互竞争的利益

没有利益冲突声明的作者。

作者的贡献

张Zhongjun Zhengyuan夏,春燕王的构思和设计实验。春燕盛Wang Wang Zhengyuan夏,李Haobo婷婷王,他完成了实验。春燕Wang Zhongjun张、梅红色燕和Zhengyuan夏分析数据。声望贡献试剂/材料/分析工具。春燕盛Wang Wang Zhongjun张,Zhengyuan夏写道。声望和春燕王同样导致了这项研究。

确认

本研究支持San-Ming项目授予市政府的深圳,中国,一般研究基金(17123915 m和17123915 m)香港研究资助委员会和由播种格兰特基础研究基础科学的香港大学。作者承认丹燕女士和技术援助Zipeng刘博士期间完成实验并承认深圳IVY-Valued生物科技有限公司对英语编辑服务。