抑制白介素17可以改善髓鞘脱失所致答:cantonensis通过进气阀打开抑制

文摘

摘要cantonensis(答:cantonensis)是一种重要的食源性寄生虫病。先前的研究显示,答:cantonensis感染可导致中枢神经系统脱髓鞘,但行动的机制并没有被理解。探索机制和寻找有效的治疗方法,白介素17 (IL-17A)和伊诺表达式中检测到答:cantonensis感染。此外,IL-17A-neutralizing抗体应用于治疗一个。cantonensis -受感染的老鼠。在我们的结果中,我们发现IL-17A和伊诺RNA表达逐渐增加的过程中一个。cantonensis感染。当被感染的老鼠接受IL-17A-neutralizing抗体,脱髓鞘的病理变化明显减轻,与海拔髓磷脂碱性蛋白(MBP)在大脑中。此外,伊诺表达受感染动物的大脑还显示星形胶质细胞减少。我们的研究提供了证据,IL-17A可能参加髓鞘脱失所致一个。cantonensis和抑制IL-17A表达式可以改善脱髓鞘的病理变化。此外,伊诺表达式的减少可能是关键原因造成的髓鞘脱失IL-17A抑制的影响一个。cantonensis。

1。介绍

摘要cantonensis(答:cantonensis)是一种重要的食源性疾病和人类嗜酸性脑炎(1]。答:cantonensis是一种寄生线虫从老鼠侵入中枢神经系统(CNS)和引起嗜酸性脑炎或脑膜炎2]。在这个过程中,神经元在中枢神经系统出现明显的髓鞘脱失(3- - - - - -5髓鞘的一个组成部分)(MBP) (6]。然而,相关的髓鞘脱失的原因答:cantonensis感染尚未完全清楚。

细胞因子白介素17 (IL-17)家族的独特的免疫细胞和组织之间的边界。如银屑病皮肤损伤或关节的风湿性关节炎患者,高水平的IL-17已发现在中枢神经系统炎症反应。先前的研究表明,IL-17-induced Act1-mediated CNS居民细胞信号级联(星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元)可能协调调解中枢神经系统炎症,髓鞘脱失,和神经退行性变的7,8]。但IL-17是否参与髓鞘脱失所致摘要cantonensis从来没有被研究过。

星形胶质细胞可能代表居民研究中枢神经系统细胞类型的多发性硬化症(MS)和运算单元,导致脱髓鞘的并发症。人类和小鼠星形胶质细胞(神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的特定标记星形胶质细胞)表达IL-17RA,从而允许IL-17A结扎,因此,细胞因子和趋化因子的生产,包括il - 6、TNFα,CCL2 [9- - - - - -11]。诱导一氧化氮(间接宾语)参与各种生理法规和扮演着重要的角色在某些中枢神经系统疾病,如脑缺血、脑感染和神经退行性疾病(12,13]。

在这项研究中,我们假设IL-17A表达式是在升高一个。cantonensis感染和anti-IL-17A抗体可以改善受感染动物的髓鞘脱失。在这项研究中,我们报告IL-17A表达式中检测到一个。cantonensis感染。此外,IL-17A-neutralizing抗体预防髓鞘脱失所致一个。cantonensis感染。我们的研究结果表明,IL-17A伊诺RNA表达逐渐增加的过程中一个。cantonensis感染,IL-17A抑制造成的髓鞘脱失减轻一个。cantonensis。此外,我们还报告,IL-17A抑制可能减少伊诺的生产,这可能是主要原因的疗效IL-17A-neutralizing抗体的髓鞘脱失所致一个。cantonensis。这些发现探索的角色IL-17A造成的髓鞘脱失一个。cantonensis并提供一个新的潜在替代治疗这种疾病。

2。材料和方法

2.1。感染的老鼠答:cantonensis幼虫和IL-17抗体注射

小鼠感染答:cantonensis幼虫BALB / c小鼠体重(20 - 40 g)购买了中山大学动物中心实验室(广州)。机构的动物保健和使用委员会批准了所有动物的过程。幼虫集合:III期幼虫(L3)答:cantonensis收集来自非洲大蜗牛(Achatina fulica)通过均匀化和切碎的蜗牛消化组织将被放置在一个pepsin-HCl解决方案(pH值2.0,500 IU胃蛋白酶/克组织)和孵化37°C 2 h。L3沉积物中洗了磷酸盐(PBS)和计算在解剖显微镜下观察然后给实验动物的填喂法与30 L3 /动物。动物们被分成四组:正常对照组、正常控制IL-17抗体,答:cantonensis感染组和答:cantonensis感染组处理IL-17抗体。每组至少有五只老鼠。在正常的老鼠IL-17抗体处理组和控制答:cantonensis感染IL-17抗体处理组注射IL-17-neutralizing抗体(每0.05毫克/公斤/天;美国eBioscience)在0 d进入腹腔,4 d, 8 d, 12 d, 16 d, 20 d。

2.2。透射电子显微镜观察

麻醉后,动物被transcardial使安乐死与4%多聚甲醛灌注。老鼠的视神经横切成15μ−20°C和m部分安装在玻璃幻灯片。一夜之间,视神经被快速切割和后缀在2.5%戊二醛。接下来,视神经碎片在一个解决方案包含后缀1%四氧化锇(Sigma-Aldrich),然后碎片在丙酮脱水系列和嵌入SPIN-PON树脂。树脂聚合进行了60°C三天。Semithin部分(0.5μ米厚度)被放置在玻璃幻灯片和甲苯胺蓝染色。最后,髓鞘脱失检测是通过使用一个300千伏透射电子显微镜(美国范)。

2.3。免疫荧光

用4%多聚甲醛固定后,大脑部分切成15μ−20°C和m部分安装在玻璃幻灯片。然后,部分被封锁3%牛血清白蛋白(BSA)在室温下1 h与兔子在孵化前anti-iNOS(英国Abcam)和anti-GFAP(美国Sigma-Aldrich)单克隆抗体在一夜之间1% BSA在4°C。部分在PBS洗了三次,孵化与异硫氰酸荧光素(TRITC)标记和FITC-labeled(对别人)二级抗体(Abcam,剑桥,英国),稀释1:500年1% BSA在37°C 1 h,在PBS再洗。然后,DAPI(1: 1000稀释,Beyotime生物技术)染色细胞核为5分钟。标本染色没有主要的抗体作为消极的控制。然后,幻灯片共焦显微镜下观察。

2.4。RNA隔离和实时定量PCR

从大脑中提取总RNA与试剂盒试剂按照制造商的指示(表达载体)。互补脱氧核糖核酸的合成,核糖核酸是反向转录PrimeScript RT试剂盒(豆类)。表达的基因编码IL-17A,进气阀打开,老鼠通过实时PCR SYBR预混料交货Taq工具包(豆类)。相对量化应用于检测上述基因的mRNA的表达。引物序列如下:5-TCATGTGGTGGTCCAGCTTTC-3 ,3-CTCAGACTACCTCAACCGTTCC-5IL-17A老鼠;5-CTGATGTTGCCATTGTTGGTG-3 ,3-CTTTGACGCTCGGAACTGTAG-5伊诺老鼠;和5-AAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3 ;3-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGT-5GAPDH老鼠作为内部参考。放大的cDNA ABI棱镜上执行7900年HT周期计(应用生物系统公司)。

2.5。免疫印迹分析

在不同组小鼠的脑组织洗两次冷PBS和细胞溶解提取缓冲(20毫米玫瑰,pH值7.4,2毫米EDTA, 5-glycerophosphate 50毫米,1毫米二硫苏糖醇,1毫米Na₃签证官₄、1% Triton x - 100和10%甘油)冰。溶菌产物是离心机在12000 rpm 15分钟,和上层的收集。蛋白(20 - 40μg)是由sds - page分离,然后转移到硝酸纤维素(美国笼罩在公司,安阿伯市MI)。转移墨迹顺序孵化了一种阻塞剂在TBS(5%脱脂奶),和一个anti-MBP抗体(1:125稀释,Abcam,英国)和HRP-conjugated二级抗体在室温下(1 h)开发的增强型chemifluorescence检测装备在Hyperfilm(日本富士)根据制造商的指示。相同的墨迹随后被剥夺和reblotted与内部引用抗体β肌动蛋白和β微管蛋白(美国Sigma-Aldrich)。图表的印迹了检测的线性范围和被ImageJ量化为具体的水平感应系统。

2.6。统计分析

单向方差分析是用于比较数据的实时PCR和免疫印迹的图表的印迹以及不同的基团。统计了使用IBM SPSS统计19 (SPSS Inc .)、美国)。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。髓鞘脱失是严重的小鼠脑组织的病理变化答:cantonensis感染

答:cantonensis侵入中枢神经系统,引起脱髓鞘。由此产生的透射电子显微镜图像显示视神经髓鞘脱失是明显的在14 d和d 21日成为严重的感染答:cantonensis(图1(一))。此外,MBP(髓磷脂碱性蛋白)表达式也逐渐在下降答:cantonensis感染(数据1 (b)和1 (c))。上述结果证明一个。cantonensis会引起大脑的髓鞘脱失。

3.2。增加IL-17A伊诺是重要的在大脑中被感染的老鼠

我们进一步探讨IL-17A的表达是否改变的过程一个。cantonensis感染。我们发现IL-17A RNA表达增加感染(图的扩展2(一个))。同时,伊诺的RNA表达也逐渐增加,达到峰值(图21 d的感染2 (b))。这些发现表明,IL-17A和伊诺可能与髓鞘脱失所致一个。cantonensis。

3.3。IL-17A抑制可以减轻大脑的髓鞘脱失的受感染的老鼠

TEM和MBP蛋白表达检测脱髓鞘改变。当一个。cantonensis受感染的老鼠21 d, TEM显示明显的髓鞘脱失。此外,MBP表达式也明显下降。IL-17A抗体注射后在实验的老鼠中,结果表明,IL-17A抑制可以恢复造成的髓鞘脱失一个。cantonensis到正常水平(图3(一个))。此外,MBP,表达水平升高后IL-17A抑制答:cantonensis受感染的老鼠,但对正常小鼠(数据没有影响3 (b)和3 (c))。这些结果显示IL-17A可能造成的髓鞘脱失的关键元素答:cantonensis。

3.4。IL-17A抑制星形胶质细胞伊诺的差别会导致对这些受感染的老鼠的大脑

从上面的结果,我们发现IL-17A抑制可以减轻髓鞘脱失所致一个。cantonensis,但机制仍然是未知的。为了解决这个问题,实时PCR和免疫荧光检查IL-17A和伊诺的表达。我们的研究结果显示,当答:cantonensis感染的老鼠21 d, IL-17A和伊诺明显升高。IL-17A-neutralizing抗体可以减少IL-17A的表达式,证明IL-17A的抑制一个。cantonensis来华的老鼠是有效的,但不能影响正常IL-17A表达的动物。更重要的是,在IL-17A抑制伊诺表达也明显降低。此外,我们发现,当IL-17A-neutralizing抗体应用,伊诺表达在正常小鼠升高(图4(一))。免疫荧光的结果也证明了一个。cantonensis感染小鼠21 d,伊诺和GFAP的双重标签(星形胶质细胞标记)都增加,而IL-17A抑制可以减少伊诺在星形胶质细胞的蛋白表达(数字4 (b)和4 (c))。上述结果表明IL-17A抑制可能缓解髓鞘脱失所致答:cantonensis通过减少伊诺在星形胶质细胞表达。

4所示。讨论

答:cantonensis是人类食源性疾病的一个重要原因。答:cantonensis感染流行在太平洋群岛、东南亚、中国、和夏威夷。零星的感染被报道在美国南部和佛罗里达(14]。嗜酸性脑膜炎疫情报告由于食用生蜗牛窝藏L3或与食用受污染的生蔬菜汁在台湾15,16]。老鼠是一个已知的终宿主可以容忍的蠕虫。大量(240),答:cantonensis造成严重的心血管和神经损伤大鼠(17]。

在这项研究中,我们发现IL-17A表达式在受感染的老鼠的脑组织和应用IL-17A-neutralizing抗体治疗受感染的老鼠脑部脱髓鞘的过程进行调查。我们的研究结果表明,答:cantonensis感染促进大脑中的IL-17A表达式以及IL-17A抑制缓解造成的髓鞘脱失一个。cantonensis在老鼠身上。此外,IL-17A抑制可能减少伊诺的生产,这可能是因为IL-17A-neutralizing抗体的疗效髓鞘脱失所致答:cantonensis。证据是如下。

首先,TEM检测的视觉神经和免疫印迹MBP证明一个。cantonensis感染引起脱髓鞘。此外,RNA表达IL-17A伊诺逐渐增加后延长答:cantonensis感染。IL-17中介的免疫细胞和组织之间的沟通。IL-17是一个家庭的创始成员6细胞因子,IL-17A-F, IL-17A是最一个调查。IL-17A最近成为一个有吸引力的目标,特别是治疗T细胞介导的自身免疫性疾病(18,19]。先前的研究表明,IL-17A表达式仅能激活神经胶质细胞,增强神经炎症反应,因此显示中枢神经系统细胞表达复杂功能IL-17RA / C受体(6]。在我们的研究中,与髓鞘脱失IL-17A表达升高一个。cantonensis感染。同样,我们观察到海拔伊诺在实验动物与髓鞘脱失。这些发现表明,IL-17A连同伊诺可能参与造成的髓鞘脱失一个。cantonensis。

接下来,IL-17A-neutralizing抗体在受感染的老鼠探索管理的功能IL-17A在髓鞘脱失所致一个。cantonensis。我们的结果证明IL-17A抑制可以缓解视神经髓鞘脱失显然通过TEM观察和免疫印迹的MBP之后一个。cantonensis感染。在先前的研究中,有明显迹象显示指向一个角色,IL-17女士的发病机制和实验性自身免疫性脑脊髓炎脱髓鞘疾病的主要原因20.,21]。因此,我们应用IL-17A-neutralizing抗体治疗髓鞘脱失所致一个。cantonensis证明了我们的假设和影响。

最后,我们探讨了机制IL-17A-neutralizing抗体缓解髓鞘脱失所致一个。cantonensis。我们的研究结果表明,IL-17A-neutralizing抗体抑制RNA的表达IL-17A也减少引起的间接宾语的生产一个。cantonensis感染。此外,IL-17A-neutralizing抗体在星形胶质细胞也抑制了伊诺的蛋白表达。星形胶质细胞可能代表居民研究中枢神经系统细胞类型的女士和运算单元。人类和老鼠星形胶质细胞表达IL-17RA,从而允许IL-17A结扎,因此,细胞因子和趋化因子的生产,包括il - 6、TNFα,CCL2 [6,7]。伊诺参与各种生理法规和扮演着重要的角色在某些中枢神经系统疾病,如脑缺血、脑感染和神经退行性疾病(22,23]。因此,我们推测IL-17A-neutralizing抗体通过抑制星形胶质细胞伊诺生产缓解脱髓鞘。先前的研究表明,外生IL-17A显著诱导伊诺表达式,因此心肌细胞凋亡(24]。我们的研究在一定程度上符合这些发现。我们所知,还没有以前的报告,IL-17A抑制引起的髓鞘脱失减少伊诺的生产一个。cantonensis。在这一行中,我们将进一步研究伊诺在未来的研究中使用基因敲除小鼠。

总之,IL-17A可能扮演了一个重要的角色在髓鞘脱失所致一个。cantonensis和现在的研究表明IL-17A-neutralizing抗体可能是一种有效的方法来治疗髓鞘脱失所致一个。cantonensis。此外,伊诺抑制的可能机制是治疗效果。因此,我们的研究提供了一个新的潜在的替代治疗髓鞘脱失所致答:cantonensis。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

冯冯冯,郑Cunjing, Wan说进行了实验并进行统计分析。冯应起草了手稿。吴邦国Zhongdao和谢富康构思研究和协调项目。所有作者阅读和批准最终的手稿。冯应和郑Cunjing同样这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81401688,81401688,81261160324),中国国家研究和发展计划(没有。2016 yfc1200500),中央大学基础研究营运资金的华南理工大学(2017 ms090),华南理工大学科学研究基金(D6172910)和华南理工大学医学院的科研项目资助(yxy2016007)。

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