分子反应人类视网膜细胞感染登革热病毒

文摘

最近的临床报告表明,感染登革病毒(DENV)常见的眼部表现。愿景是登革热视网膜病变最严重的威胁,包括视网膜血管病变、黄斑水肿。患者视网膜病变机制是自然的,但观察表明视网膜色素上皮细胞和视网膜内皮细胞。人类视网膜细胞注射DENV-2和监控长达72小时。上皮和内皮细胞支持DENV复制和发布,但上皮细胞仅展示了明显的细胞病变效应,并在这些细胞感染更有效率。感染诱导的I型干扰素反应细胞,但这是在上皮细胞。内皮细胞粘附分子的表达增加,血管粘连molecule-1持续过度。对单层上皮Transcellular阻抗降低,但不是内皮单层膜,恰逢细胞病变效应。减少细胞内filamentous-actin伴随着混乱和联接的分子的表达减少,zonula occludens 1和连环蛋白-β1。内皮细胞粘附分子的表达变化符合视网膜血管病变的患者感染DENV;在上皮交界蛋白表达减少,并联失去上皮细胞的完整性,提供分子依据DENV-associated黄斑水肿。这些分子过程为该登革热视网膜病变提供潜在的治疗靶点。

1。介绍

人感染登革病毒(DENV)传播伊蚊物种蚊子和提供了一个广泛的疾病,包括亚临床“严重”登革热,特点是危及生命的等离子体泄漏,出血和/或器官衰竭(1,2]。最近的研究,涉及复杂的统计建模的数据来自超过8000个事件记录,预测,全世界每年大约有3.9亿DENV感染(3]。2015年全球疾病负担研究4)强调DENV感染作为例外,死亡率下降的总趋势与被忽视的热带疾病有关:从2005年到2015年,全世界DENV感染的死亡人数从12300年到18400年上升了近50%。

例病毒学DENV证实感染的流行是历史上从1940年代5),但很少有识别登革热眼疾,直到2000年代。多种形式的登革热眼疾近日报道,影响轨道,眼部表面和/或眼内组织(6]。眼内表现,特别是那些涉及视网膜,很好地描述和视觉上最有可能产生不利影响。登革热视网膜病变视网膜血管病变可能采取的形式,与临床上明显或假定亚临床视网膜血管炎,视网膜出血和/或血管闭塞(7- - - - - -9]。这个血管病变优先影响中央视网膜黄斑区,但其他黄斑责任人也观察到。黄斑水肿是最普遍的形式的黄斑病变;另一个黄斑病变,称为“foveolitis”,不太常见,但登革热视网膜病变的特点,诊断的基础上的黄橙色的黄斑点局部的边境neuroretina和视网膜色素上皮眼科成像(10- - - - - -13]。脉络膜新生血管形成在黄斑也是可能的14]。登革热视网膜病的预后高度变量,从全面解决永久性视力丧失,无论医疗干预措施减轻炎症(6]。

而系统性登革热的细胞和分子机制都进行了广泛的调查,导致登革热视网膜病变的基本过程仍然有待研究。我们启动了这个调查研究DENV之间的相互作用和人类视网膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞,利用细胞线和主细胞,建立和实验室和病人DENV隔离。我们的理由关注这些细胞亚群是双重的。首先,视网膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞构成血视网膜屏障(15),因此它们是第一个细胞DENV遇到当进入视网膜。其次,患者的临床表现(8- - - - - -14视网膜血管病变和maculopathy-implicate这些眼部病变的细胞亚型。我们现在观察有关细胞感染的易感性DENV, I型干扰素(IFN)抗病毒和DENV-infected细胞炎症反应,以及DENV感染屏障的影响细胞的功能。

2。材料和方法

2.1。人类眼部细胞系

人类视网膜细胞主要是隔绝尸体捐赠者来自南澳大利亚的眼库(澳大利亚阿德莱德)在24小时内死亡的批准南方阿德莱德人类临床研究伦理委员会。

隔离主要人类视网膜色素上皮细胞,Blenkinsop发布的方法等。16之后,做了一些调整。总之,脉络与附着视网膜色素上皮细胞被解剖后洗眼杯和0.5毫克/毫升胶原酶消化IA和0.5毫克/毫升胶原酶IV (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)的解决方案。从脉络膜视网膜色素上皮细胞分离表在磷酸缓冲盐(PBS)与2%胎牛血清(Bovogen生物制品的边后卫,Keilor东部,澳大利亚,或通用电气Healthcare-HyClone,洛根,UT)和分层超过20%蔗糖的媒介。在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞:营养混合物F12 (DMEM: F12,热费舍尔Scientific-Gibco,大岛,纽约)和最小基本培养基鹰(MEM Sigma-Aldrich),比例为1:1,补充的边后卫(最初为10%,降低到2%后2天),1 x N1中补充0.25毫克/毫升牛磺酸,0.02毫克/毫升氢化可的松,和0.013 ng / mL三碘甲状腺氨酸(所有从Sigma-Aldrich),和1 x MEM非必需氨基酸溶液,1 x GlutaMAX补充,青霉素和100 U /毫升- 100μg / mL链霉素(从热费舍尔Scientific-Gibco) 37°C和5%的公司₂在空气中。

隔离主要人类视网膜内皮细胞,我们跟着我们以前发表的方法(17]。视网膜解剖后洗眼杯,和消化0.25到1毫克/毫升II型胶原酶(热费舍尔Scientific-Gibco)。经过7天的文化mcdb - 131中(Sigma-Aldrich)与2%的边后卫和血管内皮生长因子(EGM-2 SingleQuots补充,省略的边后卫,氢化可的松和庆大霉素;Clonetics-Lonza Walkersville, MD),内皮细胞纯化使用Dynal磁珠(热费舍尔Scientific-Invitrogen,奥斯陆,挪威)涂上鼠单克隆抗体反CD31(圣地亚哥BD Biosciences-Pharmingen CA),和生长在修改mcdb - 131中有10%的边后卫在37°C和5%的公司₂在空气中。

ARPE-19人类视网膜色素上皮细胞系(美式文化集合(写明ATCC),马纳萨斯,弗吉尼亚州)(18]在DMEM培养:F12补充5%的边后卫在37°C和5%的公司₂在空气中。人类视网膜内皮细胞生成和内部特征,正如我们已经详细报道(17]。总之,内皮细胞、孤立如上所述,扩大了与鼠标amphotropic重组逆转录病毒转导,LXSN16E6E7(天才由丹尼斯·a·洛韦博士西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心的WA) (19]。这细胞系保留一个内皮细胞表型,包括表达内皮标记和形成capillary-like管基底膜替代(17]。视网膜内皮细胞培养在mcdb - 131中补充5%的边后卫和血管内皮生长因子在37°C和5%的公司₂在空气中。

2.2。登革病毒

DENV菌株包括Mon601(全身感染重组克隆的DENV血清型2 (DENV-2)新几内亚C株,最初从老鼠克隆brain-adapted隔离)(20.年青一代)和- 312 (DENV-2应变孤立的领域在1980年泰国登革热疫情,并提供由彼得·j·赖特博士(澳大利亚墨尔本莫纳什大学)21,22]。年青一代Mon601和- 312菌株为人类细胞系和初级细胞取向(23- - - - - -25]。Mon601株病毒转染的生成在体外RNA转录DENV婴儿仓鼠肾BKH-21成纤维细胞和放大C6/36蚊子细胞。年青一代的- 312株病毒持续传播在C6/36蚊子细胞。维罗细胞病毒股票被空斑实验滴定(写明ATCC),斑块被中性红叠加,表示为点状单位(pfu) /毫升。

2.3。人类眼部细胞的病毒感染

镀,除非另有说明,视网膜细胞融合在表面适当的试验改良DMEM: F12或修改mcdb - 131培养基,分别隔夜37°C和5%孵化有限公司₂在空气中。单层细胞注射DENV 1感染复数,或mock-infected FBS-free中90分钟间歇摇摆,洗3次用新鲜FBS-free介质,并返回修改DMEM: F12或修改mcdb - 131中型postinoculation孵化项目72小时。病毒效价在文化上层清液是由空斑实验,如上所述。

2.4。免疫细胞化学

融合性的层的ARPE-19视网膜色素上皮细胞或视网膜内皮细胞在gelatin-coated玻璃盖玻片,感染DENV-2或mock-infected,在4%多聚甲醛固定,在70%的乙醇冲洗,并存储在无菌PBS。单层膜与0.05% IGEPAL permeabilized ca - 630 (Sigma-Aldrich)和屏蔽4%山羊血清(热费舍尔Scientific-Gibco), 5%的边后卫,0.4%牛血清白蛋白在PBS (Sigma-Aldrich)。细胞被标记用鼠标anti-double-stranded RNA(极)单克隆抗体(SCICSONS,布达佩斯,匈牙利:描述,J2)稀释到2.5μg / mL,或从DENV-infected人类血清(莱特博士的礼物)稀释1 3000年,无论是在PBS山羊血清,2%在室温下为60分钟,随后在PBS洗。488 -标记细胞孵化与Alexa萤石山羊anti-mouse免疫球蛋白或Alexa萤石555 -山羊反人类免疫球蛋白(热费舍尔Scientific-Molecular探针,尤金或)2μ在PBS g / mL 2%山羊血清在室温下30分钟。与PBS洗涤后,细胞复染色与赫斯特33342年核酸染色(热费舍尔Scientific-Molecular探针)10分钟。层被安装在延长黄金不变色Mountant(热费舍尔Scientific-Molecular探针),共焦显微镜成像(徕卡TCS SP5共焦显微镜:徕卡微系统,曼海姆,德国)。

2.5。RNA隔离、反转录聚合酶链反应

在感染的结论,总RNA提取试剂盒试剂(Gibco)细胞溶解细胞,根据制造商的指示,并存储在−80°C的逆转录(RT)。本文用分光光度法测定RNA浓度2000年NanoDrop仪器(热费希尔科学、威明顿、德)。检查感染的宿主细胞反应,反转录都使用了iScript反向转录Supermix RT-qPCR (Bio-Rad大力神,CA), 500 ng RNA模板产生20μL的互补。定量实时PCR进行排名连接实时PCR检测系统(Bio-Rad)使用以下:2μL (cDNA、稀释1在10;4μL(智商SYBR绿色Supermix;1.5μ每个20 LμM正向和反向引物;和11μL nuclease-free水为每个反应。放大包括以下:一个就是在95°C 5分钟;40变性30秒的周期在95°C;退火30秒60°C;在72°C扩展30秒;拉伸后维持在75°C, 1秒。融化曲线,代表一个秒的维持在每0.5°C 70°C到95°C,生成确认一个峰值是每个引物组。标准曲线,用连续稀释的产品,确认PCR 85%或更高的效率。PCR证实了产品的规模在2%琼脂糖凝胶电泳。循环阈值测定,确定Cq模式设置为回归。相对表达决心使用Pfaffl[描述的方法26),归一化两个稳定参考genes-glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)和tata结合蛋白(真沸点)。胞内DENV拷贝数的量化,使用了类似的方法。反转录进行使用M-MuLV逆转录酶和随机五个一(新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA)。定量实时PCR进行Rotor-Gene 6000 (Corbett生命科学,墨尔本,澳大利亚)。DENV RNA拷贝数的标准曲线计算Mon601应变DENV-2生成在一个平行的PCR和规范化peptidylprolyl异构酶(PPIA)。引物序列记录展示在表1。

2.6。分泌β干扰素免疫测定

文化上层清液从DENV -或mock-infected ARPE-19细胞视网膜色素上皮细胞和视网膜内皮细胞是人体干扰素-化验β以AlphaLISA (PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)的检测极限1 ng / mL。人类干扰素-β标准解决方案准备中匹配的细胞群。后的执行AlphaLISA制造商的“快速”协议,与2μ每个20 L标准或文化的上层清液中使用μL分析。蛋白质浓度计算从AlphaLISA信号读取一个EnSight板阅读器(PerkinElmer)。

2.7。视网膜内皮VCAM-1免疫测定

细胞粘附分子ELISA是改编自一个协议发布的Hartwig et al。27),我们之前的描述(28]。在48小时内与DENV接种后,汇合的视网膜内皮细胞层的井的96孔板,感染DENV-2或模拟感染,洗两次在PBS 0.1% Tween-20 (PBS / Tween-20),固定在1%多聚甲醛30分钟,在PBS / Tween-20洗。30分钟后为5%w/v脱脂牛奶在PBS(屏蔽解决方案),层与鼠单克隆孵化反血管细胞粘附分子1 (VCAM-1)抗体(BD Pharmingen:目录编号555645)或鼠标单克隆免疫球蛋白(BD Pharmingen) 1μg / mL阻碍解决方案在室温下45分钟( 单层膜/条件)和PBS / Tween-20洗了5次。随后,单层膜和Alexa萤石488 -共轭二次孵化山羊反人类免疫球蛋白抗体为2.5μg / mL屏蔽解决方案中30分钟在室温和PBS / Tween-20冲洗5次。最后,单层膜处理300 nM DAPI (Sigma-Aldrich) PBS 5分钟在PBS和洗3次。所有治疗后固定步骤进行慢慢旋转的轨道振动器。单层荧光测定的维克多X3 Multilabel板读者(珀金埃尔默)使用485励磁和535年发射(Alexa萤石488)过滤器和355励磁和460年发射(DAPI)过滤器。意味着背景荧光测定小鼠IgG-incubated井为每个条件,和这个值减去从井孵化与反VCAM-1抗体,匹配条件。Alexa萤石488个读数是调整DAPI读数来自同一井井之间的细胞数量的差异。

2.8。单层通透性测定

ARPE-19视网膜色素上皮细胞或视网膜内皮细胞被播种在20000细胞/ xCELLigence E-Plate 16(直径= 5毫米)(究其生物科学,圣地亚哥,CA)修改DMEM:分别F12或mcdb - 131中。两小时后复苏的时期,一夜之间,盘子被孵化的xCELLigence RTCA仪器(究其生物科学,圣地亚哥,CA),保持细胞单层膜在37°C和5%的公司₂在空气中,在阅读电阻抗层每小时。板块暂时从仪器中删除添加DENV FBS-free介质在莫伊的又暂时从仪器90分钟后删除,删除的DENV悬挂和更换新鲜FBS-supplemented介质。随后,板块孵化了约60个小时。

2.9。细胞内肌动蛋白标记

融合性的层的ARPE-19视网膜色素上皮细胞或视网膜内皮细胞在gelatin-coated玻璃盖玻片固定和存储,并立即标签之前,为免疫细胞化学清洗和permeabilized(如上所述)。细胞被贴上TRITC-tagged phalloidin(σ)1μ在PBS g / mL 2%山羊血清在室温下30分钟。细胞被洗在PBS和复染色与赫斯特33342年核酸染色10分钟。层被安装在延长黄金不变色Mountant,共焦显微镜成像。

2.10。统计分析

DENV - mock-infected条件下生成的数据比较未配对或成对的学生的测试,使用它管理器3.1版本(Bio-Rad)或GraphPad棱镜v6.04 (GraphPad软件,拉霍亚,CA)。在所有分析,定义为一个收益率显著差异值小于0.05。

3所示。结果

3.1。人类视网膜色素上皮细胞和视网膜内皮细胞是宽容DENV感染

立案调查DENV之间的交互,人类视网膜色素上皮细胞和视网膜内皮细胞,我们首先评估了这些细胞感染病毒的易感性。我们跟着DENV-2感染过程中在ARPE-19视网膜色素上皮细胞(图1),在视网膜内皮细胞(图2)72小时标准细胞和分子的方法。在24小时内接种病毒,人类视网膜细胞的数量增加肿瘤坏死因子的转录-α(肿瘤坏死因子-α)和白细胞介素- 6 (il - 6)(数据1(一)和2(一个)),这是关键细胞因子在眼内炎症的发展。色素上皮细胞,感染显然是明显的细胞病变效应(图48小时1 (b))。免疫细胞化学鉴定dsRNA, DENV-Ag多数色素上皮细胞(图1 (c)),RT-qPCR发现高拷贝数的DENV-2 RNA在细胞(图1 (d))。相比之下,为内皮细胞,没有明显的细胞病变效应(图2 (b));相对较少的细胞被积极的标签dsRNA和DENV-Ag(图2 (c));和RT-qPCR检测到显著低拷贝数的DENV-2 RNA(图2 (d))。分析文化的上层清液空斑实验表明释放的传染性病毒从细胞类型,尽管病毒效价较高的上层的收获比单层内皮的色素上皮细胞层(数据1 (d)和2 (d)、职责)。我们也验证了易感性的细胞群通过接种感染DENV-2原发性视网膜色素上皮细胞和初级视网膜内皮细胞分离人类尸体供体的眼睛。免疫细胞化学鉴定dsRNA, DENV-Ag多数原发性视网膜色素上皮细胞,但主要相对较少(图48小时后视网膜内皮细胞3)。综上所述,这些数据表明人类视网膜色素上皮细胞和人类视网膜内皮细胞支持DENV感染,尽管过程中感染细胞群之间的可能有所不同。

3.2。DENV感染诱发更强的I型干扰素反应由人类视网膜色素上皮细胞比人类视网膜内皮细胞

I型干扰素反应是主要的抗病毒机制影响人类细胞(29日]。研究这种反应在人类视网膜色素上皮细胞和人类视网膜内皮细胞,我们测量干扰素-β蛋白质在文化上层清液从DENV-2-infected收集和mock-infected细胞在24日,48岁,postinoculation和72小时,使用一种免疫测定,我们研究了诱导转录本编码选择IFN-stimulated基因(isg) RT-qPCR在同一时间点(图4)。Mock-infected细胞产生干扰素-β蛋白质的检测极限1 ng / mL。然而,感染后ARPE-19视网膜色素上皮细胞分泌干扰素-β在浓度超过10 ng / mL的时间点(图4(a))。感染视网膜内皮细胞也分泌干扰素-β,但细胞因子是48小时才被发现,浓度大大降低,接近检出限的测定(图4(b))。两个细胞群调节isg应对病毒感染,包括因素抑制病毒进入宿主细胞(IFN-induced跨膜蛋白1 (IFITM1)),细胞内复制的病毒(真核翻译起始因子2α激酶2 (EIF2AK2)和激进的山姆domain-containing 2 (RSAD2),也称为viperin),从细胞和病毒的出口(IFN-stimulated基因15 (ISG15))(数据4(c)和4(d),职责)。这些结果表明,人类视网膜色素上皮细胞和视网膜内皮细胞两山抗病毒I型干扰素反应,但他们认为这种反应更激烈的上皮细胞。

3.3。DENV感染影响人类视网膜内皮细胞粘附分子的表达

视网膜血管病变的特点是视网膜vasculitis-inflammation视网膜血管是登革热的常见表现视网膜病变(6]。人类视网膜内皮细胞表达高水平的粘附分子,和表达进一步诱导条件下的炎症,促进白细胞游走到视网膜(17]。我们检查了记录水平的高度表达视网膜内皮细胞粘附分子在24,48岁和72小时postinoculation DENV-2: E-selectin,细胞间粘附分子1 (ICAM-1) VCAM-1,激活白细胞细胞粘附分子(ALCAM)和CD44(图5(一个))。病毒感染导致显著增加内皮记录的所有粘附分子的表达,除了E-selectin,在一个或多个测试时间间隔。褶皱增加VCAM-1最高记录,这是持续72小时,特别是VCAM-1暗示一个关键的角色,白细胞贩卖在登革热视网膜病变视网膜。VCAM-1的因此,我们证实了表达的免疫分析法检测细胞的膜结合在视网膜内皮单层膜上粘附分子在48小时postinoculation: VCAM-1 DENV-2-infected视网膜内皮细胞明显增加,相比mock-infected细胞(图5 (b))。

3.4。DENV感染促进人类视网膜色素上皮细胞层的渗透率,但不是人类视网膜内皮单层膜,伴随着交界分子的表达下降

黄斑地区由于过度积累细胞外液扰乱neuroretinal解剖学、黄斑水肿风险最大的愿景的登革热视网膜病变(6]。血视网膜屏障是由视网膜色素上皮,毗邻高度有窗的脉络膜的脉管系统和视网膜血管内皮细胞30.]。我们评估的影响DENV-2感染屏障功能和表型的细胞(图6)。影响屏障功能是实时评估通过测量transcellular电阻每小时的3天。尽管电阻在ARPE-19视网膜色素上皮膜感染DENV-2高于在mock-infected细胞,约36小时postinoculation,在受感染的单层膜电阻开始下降,尽管它继续爬跨mock-infected单元(图6(一))。独立确认这个改变,我们检查了丝状——(F -肌动蛋白)安排在24和48小时postinoculation phalloidin染色细胞。mock-infected细胞,组织细胞内的纤维网络维护,而在DENV-2-infected细胞,无序的网络,与聚合和细丝colocalizing损失与病毒复制、被24小时(图观察6 (b))。确定失去屏障功能的分子基础,我们检查记录编码的表达分子参与上皮adherens和紧密连接在24日,48岁和72小时postinoculation RT-qPCR:表达zonula occludens 1 (ZO-1)联接的粘附分子3 (JAM-3),和/或连环蛋白-β1 (CTNNB1)是减少在这些间隔(图6 (c))。与电阻的变化观察到DENV-2-infected视网膜色素上皮细胞层,电阻测量在视网膜内皮单层膜相当DENV-2-infected和mock-infected细胞之间,在上升大约48小时之前稳定(图6 (d))。一致,记录编码的表达分子参与内皮adherens紧密连接,包括endothelial-specific VE-cadherin,没有受感染的影响(图6 (e))。综上所述,这些数据显示故障期间血视网膜屏障的登革热视网膜病变发生在视网膜色素上皮细胞的水平。

3.5。响应DENV感染人类视网膜细胞的复制与自然隔离压力

我们的研究进行的laboratory-cloned Mon601 DENV-2压力。确认我们的发现对人类传染性疾病的相关性,我们年青一代重复选择的传染性和宿主细胞响应实验使用- 312,这是一个DENV-2应变隔离受感染的人类(21,22)(图可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/3164375)。实验分析了年青一代在48小时postinoculation - 312,这是我们观察到的时间最为明显病理变化与Mon601实验。免疫细胞化学鉴定dsRNA年青一代和DENV-Ag - 312感染ARPE-19视网膜色素上皮细胞和视网膜内皮细胞,但不是mock-infected细胞(图A和B,职责)。年青一代感染- 312导致相似的转录表达的变化和实验室所观察到的克隆:增加TNF -α视网膜色素上皮细胞和视网膜内皮细胞(内皮细胞不显著);增加干扰素-β在视网膜色素上皮细胞和视网膜内皮细胞;视网膜内皮细胞VCAM-1增加;和减少CTNNB1在视网膜色素上皮细胞,但不是视网膜内皮细胞(图C和D,职责)。这些结果提供的证据表明,观察在实验中使用Mon601代表的细胞和分子反应DENV菌株负责人类疾病。

4所示。讨论

登革热视网膜病变是最严重的眼部受累,遵循系统性感染DENV [6]。收集的数据在2005年新加坡流行[12)表明,这种情况可能会影响多达10%的患者为DENV感染需要住院治疗。没有专门针对DENV抗病毒药物,缺乏对疾病发病机理的研究,治疗登革热的视网膜病变仅限于减少宿主炎性反应是非局部或全身治疗皮质类固醇和/或静脉注射免疫球蛋白(10,11]。我们已经进行了一系列的实验旨在调查基本机制操作DENV视网膜病变过程中,基于多个临床观察,表明细胞血视网膜屏障,视网膜色素上皮细胞和视网膜内皮细胞,在眼部病变(7- - - - - -13]。

传染性研究,包括病毒dsRNA immunolabeling和DENV抗原在培养细胞,RT-qPCR DENV成绩单的细胞,细胞培养上清液和空斑实验,表明视网膜色素上皮细胞和视网膜内皮细胞被宽容的病毒感染和支持传染性病毒的释放。感染人类的视网膜细胞与DENV之前还没有被研究过,但这些视网膜细胞的数量据报道容易感染其他RNA和DNA病毒(31日- - - - - -35]。自己工作和独立研究人员23,36,37)强调,nonocular内皮细胞群,包括人类脐静脉内皮细胞和人类皮肤微脉管系统易受感染DENV,但随着细胞感染的比例相对较低;这是归因于细胞表型和细胞外环境,包括病毒的细胞表面受体的表达。一致,我们发现人类视网膜色素上皮细胞显示病毒细胞病变效应和被感染的证据更大的数字,含有较高的病毒拷贝数,释放病毒效价高于人类视网膜内皮细胞。色素上皮细胞也对感染的反应更高的生产干扰素-β,尽管这两种色素上皮细胞和内皮细胞类型影响1型干扰素反应。

人类视网膜清单后病理系统性感染不同光谱的RNA和DNA病毒(38]。病毒视网膜病变随病原体的临床特征,这可能反映了因素如病毒进入眼睛的路线,具体的视网膜细胞趋向性的病毒,视网膜宿主细胞对病毒,感染宿主的免疫反应。除了DENV之外,另外两个flaviviruses-West尼罗河病毒和Zika病毒可能引起视网膜病变,与特征形式,不同于登革热的视网膜病变。西尼罗河病毒感染通常会导致多病灶的视网膜脉络膜病变发生在线性条纹后的视网膜神经纤维(39,40]。Zika病毒视网膜病变主要在描述婴儿出生时头小畸型,在子宫内感染;影响婴儿遭受视网膜色素斑点状阴影和大面积视网膜脉络膜萎缩,通常位于黄斑和鱼雷形状的41,42]。最近,其他团体所描述的反应几个视网膜细胞的人口感染西尼罗河病毒或Zika病毒(31日,33,43]。我们的工作是针对了解登革热在particular-retinal视网膜病变血管病变和maculopathy-at细胞和分子水平。

视网膜血管炎是一个杰出的登革热视网膜病变的临床特征和可能与视网膜出血和/或有关血管遮挡(6]。在分子水平,细胞粘附分子激活视网膜血管内皮调解与骨髓和淋巴白细胞的子集,从而使白细胞transendothelial迁移(17]。研究非传染性的视网膜炎症,利用小鼠实验性自身免疫性uveoretinitis或人工模拟,涉及整合蛋白,总科免疫球蛋白成员,和/或CD44在白细胞贩运到视网膜(44- - - - - -47]。我们测量的表达增加ICAM-1 VCAM-1, ALCAM, CD44成绩单感染人类视网膜内皮细胞在不同时间间隔后DENV感染。增加VCAM-1持续的表达我们研究所有间隔,这证实了检测增加VCAM-1 DENV-infected细胞表面的蛋白质。关键角色VCAM-1登革热视网膜病变的发病机理是由最近的一些研究证实DENV感染者的系统性的生物标志物。雅库巴et al。48水平)与等离子体裂解VCAM-1,但不是E-selectin或ICAM-1 microcirculatory参数的功能障碍患者的血清学证实任何DENV血清型的登革热。廖et al。49可溶性VCAM-1报道是严重的登革热的早期生物标志物与登革热感染DENV-1成年人,和曼卓林et al。50]类似的可溶性VCAM-1与儿科登革休克综合征有关,与登革热和登革出血热。

黄斑病变是登革热的其他常见表现视网膜病变,通常表现为黄斑水肿和暗示的血视网膜屏障。Velandia-Romero et al。51]演示的能力DENV在鼠标桥血管组织障碍在体外模型,transwells老鼠大脑内皮细胞填充,和transendothelial潜在测量四次每天2天:运动的病毒是伴随着渗透率的增加部分废除的单层培养的内皮细胞和老鼠星形胶质细胞。血视网膜屏障构成两个解剖分离位置,nonfenestrated视网膜血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞(30.]。我们观察到感染视网膜色素上皮细胞层的渗透性增加,视网膜内皮单层膜相比,使用一个封闭的系统,每小时的电阻抗读数超过3天。视网膜色素上皮细胞的这种反应伴随着失去细胞f -肌动蛋白的结构和减少表达式联接的分子没有记录人类视网膜内皮细胞。这说明黄斑水肿可能主要反映视网膜色素上皮细胞的感染。视网膜色素上皮细胞的参与也符合不太常见,但高特点,foveolitis临床发现,发生在感光细胞和上皮交界处。有趣的是,在一个模型视网膜感染寄生虫,刚地弓形虫曾经我们雇佣的ARPE-19视网膜色素上皮细胞,破坏视网膜色素上皮是类似的记录52]。

这次调查主要关注DENV和血视网膜屏障的细胞之间的相互作用。登革热视网膜病变的发病机制的另一个方面是DENV-infected视网膜色素上皮细胞之间的相互作用或视网膜内皮细胞,以及其他视网膜细胞群,和浸润白细胞,也可能被感染。特殊的色素上皮细胞和内皮细胞免疫功能影响的视网膜炎症。视网膜色素上皮细胞产生一系列免疫调节分子采取行动表达下调炎症活动的白细胞数量(53]。另一方面,视网膜内皮细胞持续表达的相对高水平的细胞粘附分子和趋化因子,并且他们有能力生产各种各样的其他分子,可能采取行动促进炎症(54]。leukocyte-retinal细胞相互作用的研究应进一步阐明登革热视网膜病变的机制。

一个重要的问题是单个病毒的影响表型与宿主细胞的相互作用。我们这项工作的主要目标是启动调查登革热视网膜病变的基本机制。因此,对于这些实验,我们选择Mon601应变,这是广泛应用于研究DENV感染,致病和第一个建立一个可靠的分子克隆(20.]。在新加坡两个登革热流行的比较,不同DENV血清型的形象产生了不同的肥胖盛行程度登革热黄斑病变,这表明病毒表型可能影响临床表现(55]。血清型和疾病的关联并不容易确定,然而,因为虽然在流行一种血清型占据优势,感染血清型往往没有定义,除了血清型关联,也可能是应变关联。全面调查登革热病毒表型效应的视网膜病变不仅需要考虑血清型1到4,而且多个每个4种血清型的菌株。

总之,我们已经证明,人类视网膜色素上皮细胞和人类视网膜内皮细胞感染DENV宽容,我们提供了分子相关性登革热视网膜病的共同表现。我们的工作是在体外,使用一个传染性,重组DENV-2克隆和人类视网膜细胞特征线,和我们的研究的关键发现是在主要人类视网膜细胞复制,年青一代和- 312菌株DENV-2隔离受感染人类。在体外细胞反应可能无法预测的临床疾病在活的有机体内在人类宿主。在体外与人类视网膜细胞的研究有助于了解登革热特别是黄斑病变,因为灵长类动物是唯一的哺乳动物有黄斑,和非人灵长类动物开发很少或没有临床疾病感染登革热(后56]。然而,在活的有机体内对小鼠的研究可能提供机械的见解与其他视网膜表现;我们发现DENV RNA的眼睛AG129缺少干扰素受体的老鼠和C57BL / 6小鼠们注入了系统性和颅内DENV-2感染后,分别,这表明可能提供实验模型的登革热眼疾(未发表的数据)。内细胞群血视网膜屏障,包括视网膜神经元,穆勒胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、周,也可能参与登革热视网膜病变的发病机理;小胶质细胞可能是重要的对于一个anti-DENV免疫反应,实验已经证明了脑炎(57]。潜在的这些细胞可以探索在这两个角色在体外和在活的有机体内研究。认识到需要更多的研究在这个新的领域,目前的工作为未来的研究提供了一个坚实的基础在登革热视网膜病变的基本机制,最终应该允许发展的更具体的治疗这个该条件。

5。结论

视网膜病变或疾病涉及视网膜,最严重的为那些感染DENV眼部并发症。我们的研究试图解释登革热视网膜病变的特点,如病人,在分子水平上。这个工作侧重于DENV之间的交互和两个人类视网膜细胞的数量与这种疾病通过临床观察:沿着视网膜血管病变的细胞外液和异常积累中央视网膜黄斑区视网膜影响内皮细胞和视网膜色素上皮细胞。我们发现视网膜细胞群支持DENV的复制和发布,和山抗病毒分子反应,一些不同的细胞类型之间的这些活动的水平。我们表明,分子结合感染视网膜内皮细胞白细胞增加,视网膜血管病理提供了依据。我们也确定改变感染后细胞间连接的色素上皮细胞,但不是内皮细胞,促进细胞外液渗漏到视网膜。我们的研究结果提供登革热的临床病理的相关性视网膜病变并开始解决发展中相关生物治疗的可能性。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

确认

这项工作是支持的部分资金来自澳大利亚研究理事会(FT130101648贾斯汀·r·史密斯)。AlphaLISA试验是进行细胞屏幕SA,弗林德斯创新中心癌症(澳大利亚阿德莱德)。作者要感谢Keryn威廉姆斯教授弗林德斯大学(澳大利亚阿德莱德)对她的评论的手稿。

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