文摘

AMP脱磷酸作用通过ecto-5′核苷酸酶/ CD73速率限制步骤生成细胞外腺苷腺嘌呤核苷酸(ADO)释放。ADO,通过 受体( Rs),是一种神经肌肉和免疫反应的有力调制器。的关键作用ecto-5′核苷酸酶/ CD73,在控制细胞外ADO的形成,促使我们研究它的作用在老鼠模型的实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)。结果表明,CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞表达少量ecto-5′核苷酸酶/ CD73比控制。减少内源性ADO或许可以解释为什么CD4扩散形成+T细胞没有阻塞 受体的激活与ZM241385或EAMG动物的腺苷脱氨酶。赤字ADO在EAMG老鼠也导致神经肌肉传递失败。康复的 R-mediated免疫抑制和便利化的发射机释放观察孵化与核苷细胞前体,AMP。这些研究结果,结合特征MG患者的血清腺苷脱氨酶活性增加,加强我们的假设EAMG adenosinergic通路可能是功能失调的。鉴于内生ADO形成平衡ecto-5′核苷酸酶/ CD73活动 Rs施加一个双重角色恢复use-dependent neurocompetence和肌无力的免疫抑制,我们假设两种机制的刺激可能有治疗潜力毫克。

1。介绍

自身免疫性重症肌无力(毫克)是最常见的t细胞依赖获得神经肌肉障碍,这在实践中表现为骨骼肌肉无力,易疲劳性重复使用由于自身抗体针对muscle-type烟碱乙酰胆碱受体(乙酰胆)。这些抗体减少近三分之一的正常有效的受体(了1),导致神经肌肉传递的安全裕度减少,尤其在高频神经活动有关。通过减少突触后动作电位的产生,这种情况会导致肌肉无力(2,3]。虽然治疗方法必须根据病人抱怨,个性化治疗MG可分为有症状(乙酰胆碱酯酶抑制剂)和长期免疫抑制(如糖皮质激素、硫唑嘌呤、单克隆抗体、胸腺和删除)。总体目标是恢复正常的临床神经肌肉功能处理夸张的免疫反应,同时最小化的副作用。因此,理解常见功能,调节神经肌肉传播的安全系数和t细胞驱动特定的自体抗体生产可能临床相关设计新颖,统一管理MG治疗策略。

腺苷(ADO)是一种无处不在的分子作为一种强有力的调制器的神经和免疫反应的激活腺苷 受体( R) [4,5]。开创性的工作从我们组大鼠运动终板首次证明ADO可以促进通过prejunctional释放神经递质 R激活,除了古典neuroinhibitory行动由腺苷1受体(1R) [4]。后来,我们表明,主音facilitatory激活 R在运动神经终端有助于克服强直抑郁症高频通过增加Ca神经元活动2 +通过Ca涌入v1 (l型)的通道(6]。这使我们提出的操纵 R激活可能的临床兴趣维持神经肌肉传导受损(低安全系数)肌无力的运动终板。事实上,我们证明了Ca的障碍2 +通过Ca涌入v1 (l型)渠道由于赤字 R强直性痉挛导致强直性失败与toxin-induced老鼠重症肌无力(TIMG) [7]。此外, R是现在被认为是一个重要的负面调制器t细胞功能,也被认为是一个有关球员MG的免疫发病机理8]。的 R激活T细胞扮演着双重角色。这种受体抑制t细胞受体(TCR)介导的信号,因此导致2减少生产和CD25表达,,因此,t细胞增殖下降(5,9]。此外,激活的 R已经被证明可以有效的表达FoxP3在同源antigen-activated T细胞,从而促进诱导调节性T细胞的分化(T注册)[10]。

要仔细考虑,障碍重症肌无力(MG)可能受益于治疗策略针对常见分子元素参与神经肌肉和免疫损伤。损伤的 R neuromodulatory强直性最近被证明TIMG鼠模型(7]。同时,李和合作者报道的减少 CD4 R的表达+T细胞和B细胞实验性自身免疫性后居住在脾脏和淋巴结重症肌无力(EAMG)感应8]。因此,可以预测adenosinergic之一 R-mediated通路可能是一个常见的缺陷功能潜在的神经和免疫障碍发生在毫克。

AMP脱磷酸作用通过ecto-5′核苷酸酶/ CD73速率限制步骤生成细胞外ADO的腺嘌呤核苷酸释放。在大鼠运动终板,ADO源自一起发布了腺嘌呤核苷酸分解代谢的ACh优先激活facilitatory R在神经终端11- - - - - -13]。在免疫系统,形成的ADO ecto-5′核苷酸酶/ CD73的免疫抑制活性至关重要 (14]。的关键作用ecto-5′核苷酸酶/ CD73在控制细胞外ADO水平促使我们自身免疫发病机制的探讨其贡献重症肌无力(毫克)为了构思新颖的治疗策略来管理这个相对频繁,然而高度失能,疾病。在这项研究中,我们使用了一个老鼠模型的EAMG最佳繁殖人类毫克的特点,在临床和组织病理学术语。

2。材料和方法

2.1。EAMG的感应和临床评估

女性Wistar鼠,权重约100 g(查尔斯河,巴塞罗那,西班牙)保持在一个恒定的温度(21°C)和普通光(06.30 - -19.30 h)黑色(19.30 - -06.30 h)周期,提供食物和水随意和随机分为三组(天真,控制和EAMG)。在全身麻醉下,氯胺酮(75毫克/公斤)和medetomidine(100毫克/公斤),腹腔内管理,EAMG组的老鼠在四个地点被皮下注射免疫与50(两个贼后和肩膀) 克r97 - 116肽(DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI JPT肽技术GmbH),合成肽对应于一个特定的地区α亚基的老鼠烟碱乙酰胆碱受体,由完全弗氏佐剂(CFA)(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。注射进行天0和增加30天相同肽在不完全弗氏佐剂(IFA) [15]。对照组免疫CFA和IFA乳剂,分别含有磷酸盐(PBS)而不是乙酰r97 - 116肽在各自的时间点。动物在天真的组不及时治疗。评估疾病表现免疫老鼠是由测试肌肉无力。临床评分是基于地震的存在和弯腰驼背的姿势和肌肉力量握力测试(BIOSEB、法国),运动后,易疲劳性评估(重复的爪子握在笼子里网格)。疾病严重程度评分如下:年级0,正常的力量和没有易疲劳性;1级,轻度降低活动和弱控制或哭泣;二年级,临床症状出现在休息;三年级,严重临床症状在休息,没有控制,和垂死的;4级,死亡(15]。每只动物是加权和评估疾病表现每周两次,直到牺牲被斩首42天(15]。动物处理和实验按照指导方针由实验动物保健和使用委员会资源(美国国家研究委员会)和之后的欧洲共同体委员会指令(86/609 / EEC)。所有的动物都包括在本研究被提交相同的实验过程。

2.2。血清腺苷脱氨酶活性

整个血液收集斩首后,从三个不同组的老鼠和总血清腺苷脱氨酶(ADA)活性在37°C的酶分光光度方法Cobas米拉年代autoanalyser(瑞士罗氏诊断),根据Giusti的方法(16]。

2.3。肌肉收缩的录音

实验进行了使用左或右膈nerve-hemidiaphragm准备(4 - 6毫米宽)。每一块肌肉和喝醉酒的过冷(95%啊2-5%的公司2)Tyrode解决方案(pH值7.4)包含(mM) 137年氯化钠,氯化钾2.7,CaCl21.8,MgCl21,不2阿宝40.4,NaHCO30.001 11.2 11.9,葡萄糖,胆碱,在37°C。静息张力的张力响应记录同分异构地50 mN测力传感器和显示在Hugo-Sachs(德国)录音机。超大的矩形脉冲强度40 年代持续时间和电流强度8马被应用于膈神经。这样做是为了实现同步膈运动神经元发射为了减少沉默的数量单位。脉冲是由草S48生成(美国)刺激器刺激隔离耦合单元(草SIU5)操作在一个恒流模式。破伤风的失败(疲劳)的偏侧膈肌收缩是通过使用高频(50赫兹)间歇(17脉冲/秒,在3分钟)神经刺激(17]。减少收缩力的百分比计算评估的百分比变化的峰值力在最后火车(应用于180秒的刺激)相对峰值力观察到开始断断续续的刺激。

2.4。(3H]乙酰胆碱释放实验

程序用于标签准备和测量诱发(3H]乙酰胆碱([3以前描述[H]乙酰)发布4,12]。短暂,膈nerve-hemidiaphragm准备安装在3毫升容量有机玻璃室加热到37°C。神经终端与1标示为40分钟 米(32.5 H)胆碱(具体活动 Ci / nmol)在1赫兹的频率电刺激下(0.04毫秒时间8 mA)。膈神经刺激了glass-platinum吸入的电极放在第一个部门分支神经干,避免直接接触的肌肉纤维。冲刷的准备工作进行了60分钟,由过冷(15毫升/分钟)与Tyrode的解决方案补充胆碱吸收抑制剂,hemicholinium-3 (10 米)释放。3H]乙酰胆碱诱发的电刺激膈神经与750脉冲应用于5赫兹频率(见刺激条件myographic录音部分)。使用两个刺激期:在12分钟( 在39分钟)和( )结束后冲刷(时间零)。测试药物增加了15分钟 和在场的结束实验。评估了氚流出液体闪烁谱(%计算效率: %)在适当的背景减法使用2毫升浴样品每3分钟自动收集。加载和冲刷时间后,制备包含( 衰变每分钟每克金刚石/ g)组织湿重和释放 金刚石/ g ( )。部分释放计算 %的放射性物质存在于组织第一次收集样本。的诱发释放3H]乙酰胆碱被减去计算基底氚流出的总氚流出刺激期间(12]。诱发(之间的比例的变化3H]乙酰胆碱释放这两个刺激时期( )相对于观察控制情况(没有测试药物)被视作衡量测试药物的效果。

2.5。了采用高效液相色谱法测定细胞外腺苷酸的动力学分解代谢(紫外检测)

细胞外腺苷酸分解代谢评估,在37°C,对膈神经偏侧膈准备从天真,控制和EAMG老鼠。30分钟后平衡时期,器官浴和2毫升30就腾空了 米AMP加油Tyrode的解决方案添加到准备在时间为零。75年的样品 L收集浴在不同时间45分钟的高效液相色谱法与紫外检测(HPLC-UV, LaChrome精英、日立、默克公司、德国)分析衬底消失和产品的变化形成的13,18]。在所有的实验中,产品的浓度不同时间的样品收集被纠正减去相同的产品样品的浓度没有添加底物准备孵化。只小鬼,肌苷(间接宾语),次黄嘌呤(HX)自发释放浓度的准备工作不超过1 米(13]。没有自发退化AMP在37°C在缺乏准备。底物的浓度和产品策划作为时间的函数(曲线进展)。以下参数为每个进程曲线进行了分析:半衰期时间( )的初始底物、时间不同浓度的外观的产品,和底物的浓度。最后的实验,其余孵化中收集和用于量化乳酸脱氢酶活性。这种酶的微不足道的活动结束时的实验表明细胞在实验期间的完整性。

2.6。释放内源性腺苷酸的高效液相色谱(二极管阵列检测)

实验使用一个自动灌注系统对于示例收集给定的时间段,因此改善的功效高效液相色谱(二极管阵列检测)分析。30分钟后平衡期,准备孵化为1.5毫升加油Tyrode的解决方案,每3分钟自动改变的清空和邻桌的器官浴使用的解决方案。准备的电刺激一次,15分钟后开始样品收集(零),使用750脉冲交付5赫兹的频率。在这些实验中,只有在刺激之前收集的样本应用程序和两个样品收集的刺激后,保留了分析。浴整除(50 - 250 L)在液态氮冷冻后立即收集,储存在−20°C(酶稳定至少4周),1周内和分析收集通过高效液相色谱二极管阵列检测(芬尼根说热费希尔科学系统LC /他是爸爸,配备一个Accela泵耦合Accela Autosample,二极管阵列检测器,以及一个运行X-Calibur Accela PDA软件色谱经理)。色谱分离是通过海泼斯尔合金金C18柱(5 2.1米, 列(5毫米)配备了警卫 2.1米, 毫米)使用一个洗脱梯度组成的醋酸铵(5毫米,pH值6调整与乙酸和甲醇。在过程流量是200年 L / min和列温度维持在20°C。autosampler设置在4°C和50 L标准或样品溶液注入,一式两份,每一个高效液相色谱分析。为了获得色谱和定量分析与最大感性、二极管阵列检测波长为腺苷被设定为259海里。Stimulation-evoked释放腺苷释放被减去计算基底,以刺激之前收集到的样本,从总释放腺苷后决定刺激应用程序。

2.7。免疫荧光染色法和共焦显微镜观察

的一个主要限制关于immunolabelling哺乳动物的神经肌肉接头的存在丰富的肌内结缔组织,隐瞒导致突触地区贫困标记抗体进入组织的渗透。为了规避这一问题,我们使用肌肉碎片与Tyrode的解决方案不断加油95%啊2-5%的公司2,含0.1%胶原酶(I型;西格玛奥德里奇)30分钟,以增加抗体对神经肌肉接头的访问。然后,肌肉部分延伸到各个方向,固定到培养皿Sylgard涂层。组织,最后,固定在PLP解决方案(多聚甲醛2%,赖氨酸0.075 M,磷酸钠0.037米,和高碘酸钠0.01米)一夜之间在4°C和存储在一个cryoprotector解−20°C。使用低温恒温器(徕卡CM1950;徕卡微系统、胡桃胡同、德国)保持在−25°C,串行横截面上的肌肉条(45 m)被削减。

切片后,一夜之间,组织碎片被孵化与阻塞缓冲溶液在4°C,由10%胎牛血清,1%牛血清白蛋白在PBS和特里同x - 100 1%。之后的样品被孵化与孵化主要抗体稀释缓冲(5%胎牛血清,0.5%血清白蛋白,PBS和特里同x - 100 0.5%),在4°C, 48 h。immunofluorescent染色的 R,兔子anti-canine R多克隆抗体(1:75;A2aR21-Aα诊断International Inc .)和鼠标反 R单克隆(1:50;05 - 717,克隆7 f6-g5-a2 Chemicon)与大鼠 R,一夜之间被孵化。孵化后,部分被洗在PBS补充Triton x - 100 0.3%(3周期10分钟)。然后,一夜之间,特有的二次抗体被应用于组织样本,在4°C,在黑暗中样本的孵化在室温下15分钟 金环蛇毒素( -BTX)(1: 1500)共轭tetramethylrhodamine (TMR-BTX)(分子探针)提供乙酰检测。最后,组织样本被安装在光学质量玻璃幻灯片使用抗衰落代理VectaShield (VectorLabs)和储存在4°C。用激光扫描共焦显微镜进行观察与分析(奥林巴斯FluoView FV1000,东京,日本)。

的 R单克隆抗体(05 - 717,克隆7 f6-g5-a2 Chemicon)承认一个第三胞内抗原决定基循环。它检测到 R paraformaldehyde-fixed老鼠大脑纹状体部分;没有观察到的信号 R基因敲除小鼠(见http://www.emdmillipore.com/PT/en/product/Anti-Adenosine-Receptor-A2a-Antibody%2C-clone-7F6-G5-A2 mm_nf - 05 - 717)。测试特异性的抗体 R (AlphaDiagnostics A2aR21-A),有些部分处理的主要与相应控制抗原抗体preadsorbed 30-amino-acid序列的胞内糖基犬A2aR /图(基因加入# P11617) (A2aR21-Pα诊断International Inc .,圣安东尼奥,TX,美国、http://www.4adi.com/objects/catalog/product/extras/A2aR21-S-A-P.pdf)。Preadsorption是由孵化 在4°C R主要抗体隔夜10倍摩尔过剩的抗原肽序列。部分被加工如前所述的preabsorbed抗血清和正常的抗血清,并行执行。在文档的 R preabsorption控件,设置在共焦显微镜适当调整 R-immunoreactivity部分是处理正常(没有preabsorption)和这些设置时保持记录pre-absorption控制减少偏见,在数字图像的捕获和印刷。

2.8。CD4+T细胞浓缩

腘和腹股沟淋巴结从天真,控制和EAMG动物和均质单细胞悬浮体。CD4+T lymphocytes-enriched悬浮液被孵化的总淋巴结细胞准备anti-CD4磁性微(Miltenyi生物技术),进一步分离LS列(Miltenyi生物技术)根据制造商的建议。CD4细胞的比例+细胞浓缩悬浮液通常从90%到80不等。

2.9。t细胞通过流式细胞术分析

不同的抗体被用来描述细胞组合来自不同群体的动物。 /毫升的CD4细胞+T富含悬浮液被封锁,10% (V / V)鼠标和兔血清与以下主要抗体:孵化之前FITC-conjugated anti-rat CD4 (eBioscience 1: 100年,克隆OX35), PE-conjugated anti-rat CD25 (1: 100;eBioscience克隆OX39)和兔anti-rat CD73抗体(1:750;请提供教授Jean科洛大学拉瓦尔,魁北克,QC,加拿大;可以获得的http://www.ectonucleotidases-ab.com在30分钟在黑暗中在4°C。anti-CD73抗体显示了biotin-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白(Fc具体)(σ1:750年,奥尔德里奇)其次是孵化与链霉亲和素PE-Cy7 (1: 100;eBioscience)。抗体的特异性anti-rat CD73证实了免疫印迹,流式细胞术和免疫组织化学(19]。

分析FoxP3的表达,细胞被固定和permeabilized使用固定/透化作用FoxP3工具包(eBioscience)和贴上PE-Cy5-conjugated anti-mouse /鼠FoxP3 (eBioscience 1: 100年,克隆FJK-16s)。同形像与荧光染料共轭马伯不相干的特异性被用作消极的控制。史诗的样本分析XL流式细胞分析仪使用EXPO32ADC软件(贝克曼库尔特、迈阿密、FL)。收集到的数据文件(100年000事件/样本)转换进行分析,与CELLQUEST软件,v3.2.1f1通过使用流式细胞仪转换,v1.0(,正欲从圣何塞,CA)。

2.10。扩散分析

CD4+T细胞是孤立于腘和腹股沟淋巴结控制和EAMG动物利用磁性老鼠CD4细胞排序+微(Miltenyi生物技术公司,奥本大学、钙、美国)后,制造商的指示。的CellTrace CFSE细胞增殖工具包(分子探针,表达载体,尤金,或者美国)被用于细胞标记。CFSE(5 -二乙酸(6)-carboxyfluorescein succinimidyl酯)原液(10毫米在DMSO)存储在−20°C是解冻,在PBS稀释0.1% BSA的最终浓度10 m . CD4+T细胞是resuspended 在PBS /毫升0.1% BSA和进一步孵化与稀释CFSE同等体积的解决方案,为7分钟37°C。细胞被洗了三次完全RPMI媒介。CD4+T细胞是镀 /在u型96 -孔板与1没有刺激或刺激 g / mL plate-bound anti-CD3马伯(克隆G4.18)和1 g / mL可溶性anti-CD28马伯(克隆JJ319)(从eBioscience)。此外,细胞补充了30 或100 M AMP每12 h,在没有或存在ADA (0.5 U /毫升)或ZM241385(50海里)。未标记的刺激细胞被用来定义细胞自体荧光。每个条件设置一式三份和文化都保持在37°C和5% 72 h有限公司2。扩散决定基于CFSE荧光流式细胞术分析。代表CFSE直方图。AMP对CD4的百分比+T细胞增殖是通过使用平均扩散CD4指数计算+T细胞在缺乏药物而CD4细胞的增殖指数+T细胞与AMP孵化。当使用修饰符ADA (0.5 U /毫升)或ZM评选241285 (50 nM), AMP对CD4百分率的影响+T细胞增殖是通过使用平均扩散CD4指数计算+T细胞的ADA (0 5 U /毫升)或ZM评选241285 (50 nM)与CD4细胞的增殖指数+T细胞与AMP独自孵化。

2.11。药物和解决方案

腺苷脱氨酶(ADA、VI型,1803 U /毫升,EC 3.3.3.4)、腺苷酸(AMP),氯化胆碱,hemicholinium-3, CFA,和IFA是西格玛(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),4 - (2 - (7-amino-2 {2-furyl 1、2、4}triazolo {2, 3 1、3、5}triazin-5-yl-amino]乙基)苯酚(ZM评选241385)是从Tocris生物科学(Tocris生物科学,英国布里斯托尔)。[甲基-3H)氯化胆碱(乙醇溶液,80 Ci更易−1)从Amersham获得国际(英国Amersham)。ZM评选241385年在二甲亚砜(DMSO)。股票的解决方案都是存储为冷冻整除−20°C。稀释这些股票的解决方案是日常和适当的溶剂进行控制。没有统计上显著的差异控制实验,在没有或溶剂的存在的最大使用浓度,观察。

2.12。统计数据

结果表达的意思 扫描电镜, 指示用于一组特定的动物数量的实验。统计分析的数据进行了使用成对的或未配对的学生的 以及或单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett或Bonferroni事后测试。的值 被认为是代表显著差异。

3所示。结果与讨论

3.1。神经生理学和免疫学特性的EAMG纯种老鼠

最常见,EAMG MG模型在人类可以诱导大鼠免疫与乙酰纯化鱼雷电子琴在CFA和被动转移患者血清来自EAMG老鼠或毫克(20.]。在鼠EAMG和人类毫克,乙酰胆碱受体自身抗体的产生是依赖于t细胞帮助1]。在这项研究中,我们使用了一种合成肽r97 - 116对应序列中发现α亚基CFA诱导的鼠乙酰胆EAMG Wistar鼠(15]。这些动物筛选标记的神经肌肉和免疫失衡。老鼠EAMG临床上的特征是两个截然不同的阶段:一个短暂的急性期与软弱(主要影响前肢,头部,颈部,喉,和呼吸肌肉)大约7天开始后免疫(p)和复苏后3 - 4天,累进慢性阶段开始大约28天皮。缺点是进步的,经常在死亡的结局。

先前的研究已经表明增长之间的正相关血清腺苷脱氨酶(ADA)活性,ADO的酶灭活到伊诺,肌无力的患者的临床评分(21]。此外,症状和T细胞介导的反应被逆相关的百分比 细胞群在人类毫克(22]。在这种背景下,我们认为这将是有趣的评价总血清ADA活性和相对的比例 在细胞悬浮液从排水腘和腹股沟淋巴结EAMG的老鼠模型是否与人类疾病。图1(一)表明血清ADA活性显著( )高( U / L, )在EAMG动物相比控制( U / L, 和天真的 U / L, )同窝出生的。血清ADA活性的增加,我们这里显示第一次被认为是MG病理生理学的一个标志21),因为ADA影响淋巴细胞的增殖和分化,尤其是T细胞(23]。这种效应似乎是特定的,总血清ADA的恶化只在EAMG活动被观察到,而不是控制和天真的动物。此外,EAMG动物表现出显著( )的相对比例的减少 细胞中 获得的细胞群排水腘和腹股沟淋巴结( %, )与控制( %, 和天真的 %, )动物(图1 (b))。这些发现了免疫与r97 Wistar鼠乙酰- 116肽序列 亚基与那些验证协议EAMG刘易斯模型诱导大鼠与鱼雷乙酰胆(24]或相同的老鼠r97 - 116肽(25),以及在人类毫克(22,26]。没有显著差异( )被发现的三个动物组总CD25的百分比+细胞内CD4+T细胞群( %, %, %的天真、控制和EAMG组、职责)。有趣的是,长期的政府与聚乙二醇牛ADA酶替代疗法(PEG-ADA)有关免疫失调的表现包括自身免疫(27]。增加营业额的ADO ADA似乎干扰 自T介导免疫反应的控制注册细胞分离PEG-ADA-treated患者人数减少,显示减少活动(27]。

(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图1
神经肌肉和免疫学的赤字有EAMG的老鼠。实验六周后免疫肽r97 - 116对应 亚基乙酰胆的CFA (EAMG),相对于年龄的天真和控制同窝出生的。(一)测量血清腺苷脱氨酶(ADA)活性。结果均值±9 SEM天真,13控制和12 EAMG老鼠。 (单向方差分析Dunnett后修改 以及)天真和控制动物相比,分别。(b)流式细胞术分析细胞内FoxP3的表达 腘窝和腹股沟淋巴结细胞来自从天真,控制和EAMG老鼠。控制策略来划 细胞显示在左边点阴谋。点右边的情节显示封闭内FoxP3的表达 细胞。门在这些点阴谋与FoxP3相对应+细胞。点情节代表每个显示组的例子。数字里面点情节对应意味着±SEM FoxP3的百分比+细胞内 人口。EAMG之间统计上的显著差异( )和天真的( )和控制( )组织表示( ;单向方差分析和Bonferroni事后测试)。(c)共焦显微镜显微图显示I型和II型电动机侧偏侧膈部分贴上咯 -BTX(红色)从天真、控制和EAMG动物。比例尺:10 m。(d)减少收缩强度的孤立的偏侧膈准备从天真,控制和EAMG动物在一段3分钟的间歇膈神经刺激(17脉冲每秒50赫兹频率)交货。结果意味着 扫描电镜的天真,6控制,5 EAMG老鼠。 (单向方差分析Dunnett后修改 以及)天真和控制动物相比,分别。

神经肌肉传导失败在自身免疫性MG结果从抗体攻击到突触后肌肉乙酰胆数量减少,导致受体集群的无序运动终板(了1])。因此,我们决定评估类似的形态变化的发生隔膜运动终板EAMG老鼠的免疫荧光共焦显微镜。先前的研究从我们和许多其他实验室表明突触后的免疫荧光标记 1-subunits的乙酰胆 金环蛇毒素共轭与tetramethylrhodamine工具来评估组织修改肌无力的动物的神经肌肉接头(见例如,[7])。隔膜被选中,是因为它是一个高度活跃的骨骼肌(工作周期 25 - 40%)的混合纤维组成。图1 (c)显示典型的缓慢运动终板(I型)和快速(II型)肌肉纤维从天真,控制和EAMG老鼠贴上tetramethylrhodamine共轭 金环蛇毒素。平面(二维)面积测量显示预期的大小差异。那些在I型隔膜的肌肉纤维相比较小和较旺盛的突触后折叠II型纤维。电机侧EAMG动物表现出显著的形态改变与天真和控制老鼠。这些变化是类似于MG病人样本的观察(28]。变化,包括显著( )减少乙酰标签/终板的面积,主要观察II型纤维(图1 (c))。数据与先前的研究一致显示有效的乙酰受体的数量的减少。最有可能,自身抗体存在于EAMG动物结合乙酰胆引起受体内化和退化。antibody-nAChR复杂还结合补充导致突触后膜的损伤,通常有更少的次级突触折叠和突触间隙扩大,导致失去功能的受体(图1 (c);看到如(29日])。

这些形态变化减少神经肌肉传递的安全裕度。考虑到减少骨骼肌在神经重复刺激强度反映了神经肌肉/免疫失衡在EAMG运营,我们执行myographic录音使用隔膜准备间接通过刺激膈神经疲劳条件下树干。这些都是由高频(50赫兹)间歇(17脉冲/秒,在3分钟)膈神经刺激(17]。图1 (d)表明,肌肉疲劳明显( )更强烈EAMG动物比天真的和控制的同胞。

总体上这些数据表明,一个老鼠的免疫肽片段同源的一个区域α亚基乙酰导致病理生理和临床特征观察人类毫克。因此,我们相信,EAMG鼠模型可能是广泛用于解开MG的发病机制和探索新的治疗策略来管理这种疾病(30.]。

3.2。改变的表达Ecto-5′核苷酸酶在CD4 / CD73+从淋巴结T细胞亚群EAMG老鼠

腺苷酸形成从发布的腺嘌呤核苷酸通过ecto-5′核苷酸酶/ CD73表示T注册细胞调节刺激T细胞的功能 R激活(14,31日]。在最近的一项研究中,李et al。8]报道的表达的减少 R T和B细胞位于淋巴结EAMG动物。在这里,我们关注的分布ecto-5′核苷酸酶/ CD73 CD25+Foxp3+和CD25+ 总CD4 T细胞中+T细胞的人口从腹股沟和腘淋巴结EAMG动物相比他们的天真和控制的同胞。图2显示一个重要( 减少的比例 细胞表达CD73腘和腹股沟淋巴结EAMG动物( , )比天真的( , )和控制( , )组。也观察到的平均荧光强度下降(MFI)由于CD73染色 EAMG细胞组( ),与其他评估组相比,天真的( )和控制(13 )(图2)。相比之下,没有发现显著差异在MFI和CD73-expressing效应的比例( )T细胞和未激活的( )T细胞,在所有组织进行了分析。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
(一)流式细胞仪分析表面CD73表情 从天真的腘窝和腹股沟淋巴结细胞,控制和EAMG动物。控制策略在左边点阴谋表示。点右边的情节显示CD73表达式中 细胞和各组表示是一个代表性的例子。数字里面点块对应的意思是百分比 扫描电镜的 细胞。(b)的百分比 细胞(左)和平均荧光强度(MFI)由于CD73(右)染色在指定的细胞群。酒吧代表意思 5的SEM实验每个动物组。 , (单向方差分析和Bonferroni事后测试)天真和控制动物相比,分别。

减少细胞的比例表达ecto-5′核苷酸酶/ CD73内 细胞群孤立淋巴结的肌无力的老鼠,可能功能的影响考虑到ecto-5′核苷酸酶/ CD73通路负责ADO的生产增加T注册细胞,这种细胞对激活T细胞的免疫抑制作用 R激活(14,31日]。减少ecto-5′核苷酸酶/ CD73表达T注册细胞从老鼠EAMG表明监管环附近的ADO积累这些细胞可能受损。这是假设,因为赤字在主音 R T的激活注册已被证明减少FoxP3 mRNA生产(10)导致的表达不足ecto-5′核苷酸酶/ CD73 [32]。事实上,Nessi et al。33]提出的假设的无能 回复正在EAMG可能是由于控制不足导致b细胞的活化T细胞激活和分化成乙酰antibody-secreting浆细胞。符合这一假说,我们报告CD4的孵化+T细胞与ZM241385 (50 nM,选择性 R拮抗剂)或与艾达(0.5 U / mL, ADO的酶灭活成肌苷)显著( )增强细胞增殖,分别 % ( ), % ( 控制动物,但切除 R强直性痉挛,内生ADO未能导致细胞类似的效果EAMG老鼠(数据未显示)。此外,T注册细胞无法维持相对高浓度的ADO血清ADA活动增加,可以进一步恶化(27]。

细胞外ADO的恢复水平可能是一个有吸引力的药理治疗恢复肌无力的动物的免疫能力。数据显示在图3证明 R-mediated抑制CD4+T细胞增殖可以恢复几乎控制水平当细胞分离EAMG老鼠补充核苷前体,AMP (30 - 100 米)。也就是说,AMP (30 - 100 米)浓度依赖性抑制CD4扩散+T细胞隔离控制和EAMG动物。AMP的免疫抑制效果(30 - 100 米)显著( )减毒的时候一起应用ZM241385 (50 nM)或ADA (0.5 U /毫升)(图3),这表明核苷酸被水解成ADO,通过行为 R抑制CD4+t细胞增殖。结果表明,激活的 R恢复AMP脱磷酸作用到ADO,通过ecto-5′核苷酸酶/ CD73,可以恢复EAMG老鼠的免疫能力,加强假设免疫抑制赤字驻留在低ADO代发布腺嘌呤核苷酸水平低于所需tonically激活 R。

(一)
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(b)
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图3
(一)流仪评价镀anti-CD3和可溶性anti-CD28马伯(1 g / mL)诱导增殖反应 CFSE-labelled CD4+腘窝和腹股沟淋巴结T细胞,排序从控制动物,培养3天没有(积极控制)或安培(100 米),AMP (100 M) + ADA (0 5 U /毫升)或安培(100 M) + ZM241385 (50 nM)表示。负控制对应如果细胞(mab)补充道。数字在直方图对应的百分比至少细胞分裂一次。结果是一个代表性的例子3 - 4所示的独立实验中执行不同的动物。(b) AMP诱导抑制CD4+腘窝和腹股沟淋巴结T细胞增殖得到控制和EAMG动物。酒吧代表意思 SEM 3控制和4 EAMG动物。 而缺乏AMP和 AMP相比效果(单向方差分析和Bonferroni事后测试)。
3.3。复苏的Facilitatory2R-Mediated强直性ADO生成通过Ecto-5′核苷酸酶/ CD73 EAMG运动终板的老鼠

的存在 R运动终板的天真的老鼠是证明了使用两种不同的商用抗体免疫荧光共焦显微镜(图4详细信息请参阅材料和方法)。α的抗体诊断International Inc . (A2aR21-A)是针对30-amino-acid肽(A2aR21-P)细胞内糖基的犬类 R,这是只有43%的老鼠 R(见http://www.4adi.com/objects/catalog/product/extras/A2aR21-S-A-P.pdf)。虽然它已被证明和河鼠交叉反应 R,我们知道特异性必须证明在淘汰赛转染细胞或动物。出于这个原因,我们使用另一种抗体从Chemicon(05 - 717),这是用来识别一个第三胞内抗原决定基循环人类重组 R(克隆7 f6-g5-a2)而大幅打老鼠受体(见例如,[34]);免疫染色的抗体被废除的纹状体 R淘汰赛鼠标(见http://www.emdmillipore.com/PT/en/product/Anti-Adenosine-Receptor-A2a-Antibody%2C-clone-7F6-G5-A2 mm_nf - 05 - 717)。数据显示,疣状模式,与抗体,A2aR21-A和05 - 717,很相似。与肽Preadsorption A2aR21-P废除与A2aR21-A抗体染色,同时保持相同的共焦显微镜采集设置。考虑到这和colocalization要求测试并行进行,其结果是超出了本研究的范围,我们继续实验与α的抗体诊断International Inc . (A2aR21-A)。

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图4
主音的激活 R明显受损的电机侧肌无力的老鼠。(一)共焦显微图显示免疫反应性 R (绿色)从老鼠在电机侧偏侧膈贴上咯 -BTX (红色的从天真、控制和EAMG老鼠。比例尺:10 m。两个不同的 R抗体,AlphaDiagnostics (A2aR21-P)和Chemicon(05 - 717,克隆7 f6-g5-a2),用表示。(b)时间的氚流出膈神经终端控制和EAMG动物来自典型的实验没有(没有药物,打开圆圈)和选择性的存在 R拮抗剂,ZM241285 (50 nM)(三角形)。(3H]乙酰胆碱释放是由刺激引起膈神经主干与750脉冲5赫兹的频率在指定的时间( 和 )。ZM241285 (50 nM)应用之前15分钟 。(c)修改的 比例由ZM241285 (50 nM)的天真,控制和EAMG老鼠。每一列代表汇集的数据5(天真和控制)和7 (EAMG)动物。垂直条代表的意思 扫描电镜。 (单向方差分析Dunnett紧随其后的修改 以及)相比,天真和控制(CFA)的老鼠。

图4(一)表明,免疫反应性对 R是位于主要在神经轴突和突触前按钮关闭反对运动终板区域,高纯度的乙酰贴上 金环蛇毒素与tetramethylrhodamine共轭。我们发现没有证据显示的本地化 R在骨骼肌纤维。没有观察到明显的区别 三个动物组之间的R免疫反应性模式,天真,控制,和EAMG(图4(一))。尽管如此,离散的表达的变化 R EAMG老鼠不能排除和值得进一步关注。

使用神经化学方法,我们评估了 在[R-mediated强直性3H]乙酰胆碱释放偏侧膈准备间接刺激膈神经主干与750超大的重复脉冲频率5赫兹(数字4 (b)和4 (c))。选择性的封锁 nerve-evoked下降[R与ZM241385(50海里)3H]乙酰胆碱释放大约30%的天真和控制老鼠(数字4 (b)和4 (c)),这表明内生ADO施加主要facilitatory强直性痉挛,通过激活的 R,在神经肌肉传递(见例如,(4,12])。相反,ZM241385 (50 nM)未能减少诱发(3在EAMG动物(图H]乙酰胆碱释放4 (c))。数据从共焦显微镜和神经化学的研究表明,尽管这一事实 Rs存在的运动神经终端EAMG动物(图4(一)),激活这些受体的内生ADO明显受损(数据生成4 (b)和4 (c))。

我们以前的研究表明,放大发射机的释放所致 R变得明显在高水平的突触ADO积累(12,35]。因此,可以假设在ADO积累赤字突触间隙可能导致丧失ADO neurofacilitation肌无力的动物。图5(一个)表明EAMG动物积累少量的ADO ( nM /毫克的组织, )后膈神经刺激相比,控制动物( nM /毫克的组织, )。没有观察到变化之间关于ADO的基线水平(图组5 (b))。

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图5
ADO释放量在膈神经刺激EAMG动物低。纵坐标代表(a)诱发释放ADO在树干膈神经电刺激(750应用于5赫兹脉冲频率)和(b)基底ADO量化通过高效液相色谱(二极管阵列检测)。Nerve-evoked释放ADO被减去计算基底释放,以刺激之前收集到的样本,从总释放腺苷后决定刺激应用程序。这些数据意味着 每组13 S.E.M.动物(天真、控制和EAMG)。

考虑到ADO源自一起发布了腺嘌呤核苷酸分解代谢的ACh优先激活facilitatory R在神经终端11,12),了解监管的潜力ecto-5′核苷酸酶/ CD73腺苷酸的形成,我们认为它是重要的来比较这种酶的活性在骨骼肌肉神经接点的天真,控制和EAMG动物通过评估细胞外的时间进程分解代谢的AMP (30 米)(图6(一))。细胞外的动力学分解代谢的AMP (30 米)和ADO形成EAMG动物非常类似于观察控制老鼠(数字6(一)和6 (b)、职责)。无显著变化( )当比较被检测出降解细胞外腺苷酸(30的时间的一半 在EAMG米)( 分钟, )、控制( 分钟, )和天真的( 分钟, )大鼠(cf。13])。

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图6
AMP脱磷酸作用,通过ADO ecto-5′核苷酸酶/ CD73,有助于释放(3H]乙酰胆碱刺激膈运动神经终端的天真,控制和EAMG老鼠。(a)和(b)显示细胞外腺苷酸的动力学(30 米)分解代谢(a)和ADO +形成核苷衍生物(肌苷(间接宾语)和次黄嘌呤(HX)) (b)的偏侧膈准备天真,控制和EAMG老鼠。AMP (30 米)添加到准备时间为零;样本收集浴在横坐标表示时间和保留进行高效液相色谱分析。数据显示平均汇集从4天真,6控制和6 EAMG动物。垂直酒吧代表SEM和显示当他们超过大小的符号。(c) Facilitatory AMP(100年的影响 米)诱发(3H]乙酰胆碱释放(5赫兹,750次脉冲, 和 )从天真的偏侧膈准备、控制和EAMG老鼠。AMP (100 米)应用之前15分钟 。每一列代表汇集的数据4(天真和控制)和7 (EAMG)动物。垂直条代表的意思 扫描电镜。

相似的细胞外腺苷通过形成ecto-5′核苷酸酶/ CD73三个动物组中,我们测试了AMP能否恢复所需的ADO强直性维持发射机释放刺激的运动神经终端EAMG老鼠,我们观察到在毒理学MG鼠模型(7]。图6 (c)表明体内添加AMP (100 米)不断增强nerve-evoked [3H]乙酰胆碱释放偏侧膈EAMG动物的准备工作( %, 类似的量),得到在天真的( %, )和控制( %, )的肌肉。预处理和ADA (0.5 U /毫升),酶,从而使ADO伊诺,防止facilitatory AMP(100的效果 两控制(米) %, )和EAMG ( %, )动物。同样,选择性的封锁 R与ZM241285 (50 nM)也减毒AMP-induced便利化诱发的3H]乙酰胆碱释放控制( %, )和EAMG ( %, )动物(数据未显示)。这些结果表明,facilitatory AMP(100的效果 M)诱发发射机释放需要转换,ADO和,随后,激活的 R。

4所示。结论

ADO是一种细胞外信号核苷,具有独特的动态作用在突触神经传递的规定4,6和免疫抑制5,9,10)反应,通过激活 r . Ecto-5′核苷酸酶/ CD73是ADO的速率限制酶生产从腺嘌呤核苷酸,发布在校准中起着战略性作用的持续时间和震级purinergic信号传递给免疫细胞(32)和运动终板(11]。研究adenosinergic-based疗法作用于A2AR和CD73敦促提供新颖的策略导向simultaenously抑制免疫反应,促进神经肌肉的传播。在这个工作我们收集的信息相关的免疫学和神经失衡adenosinergic通路EAMG的老鼠模型(见图所示7人类毫克),比较病理生理和临床特征。


图7
参与adenosinergic系统的神经免疫缺陷出现在EAMG老鼠。在健康动物, R激活ADO发布核苷酸的分解代谢产生通过ecto-5′核苷酸酶/ CD73 downmodulates T效应( )细胞增殖反应特定抗原通过增加T的活动注册( )细胞表达FoxP3-dependent基因产物,比如ecto-5′核苷酸酶/ CD73。在神经肌肉接点ecto-5′核苷酸酶/ CD73活动导致ADO的形成释放ATP(来自神经和肌肉),这有助于通过prejunctional乙酰胆碱释放 R激活,抵制强直抑郁症是必要的。EAMG老鼠,增加血清腺苷脱氨酶(ADA)一起ecto-5′核苷酸酶/ CD73 T注册( )细胞导致大量细胞外ADO不足。的缺乏 R免疫抑制强直性痉挛导致的损失外围宽容乙酰胆。因此,增加抗原T效应细胞触发B细胞的增殖分化为浆细胞和分泌抗体针对汽车侧乙酰胆集群。这种抗体攻击导致乙酰内化/退化和complement-mediated形态变化的肌无力的突触后膜(如次级突触减少褶皱,突触间隙的扩大)。这些变化导致神经肌肉传递失败,由赤字进一步加剧生产细胞外,可能从发布的腺嘌呤核苷酸,即ATP。损伤的补药 R-mediated便利化发射机障碍的补药 R-mediated便利化发射器释放的肌无力的骨骼肌无力抵抗疲劳。

据我们所知,这是第一次尝试解决常见的赤字影响神经肌肉不平衡传输和自身免疫反应EAMG模型。不足数量的腺苷,促进免疫细胞沟通和神经肌肉通过传播 R EAMG动物似乎激活操作,然而,潜在机制负责这些发现似乎是不同的两个系统。赤字的ADO代免疫细胞主要是由一个ADO生成酶的表达,减少ecto-5′核苷酸酶/ CD73, T注册细胞,这可能会进一步加剧的表达下降 R B和T细胞(8]。之间的协调,增加血清ADA活动(图1(一))与T的无能注册细胞维持细胞外高水平的ADO来自腺嘌呤核苷酸(图2),缓解抑制特定nAChR-T淋巴细胞导致细胞增殖和抗原B细胞活化的肌无力的动物(图7)。关于运动终板的缺乏 R活动似乎没有相关能力的变化ecto-5′核苷酸酶/ CD73腺嘌呤核苷酸代谢导致ADO的形成(图6(一))或赤字的 R受体表情运动神经终端(图4(一))。自身抗体攻击突触后乙酰可能妥协ADO的逆行版本(图为主5(一个))和/或其前体,ATP,从骨骼肌纤维的影响,导致功能丧失 R-mediated便利化的乙酰胆碱释放和神经肌肉传递失败EAMG老鼠。

高度失能的神经肌肉传递赤字与MG有关,也就是说,肌肉无力,易疲劳性,从补充系统的攻击可能导致antibody-nAChR复合物绑定到运动终板导致混乱和乙酰损失(30.]。在这项工作中,我们扩展机制相关的神经肌肉传输失败EAMG ADO暗示赤字的途径。这样的观察与toxin-induced MG动物模型(7),提出了研究数据表明内源性腺苷生成肌无力的运动终板在重复神经发射(图5(一个))可能不足以保护发射器释放在重复通过主音激活突触前facilitatory神经元活动 R(图4 (c))。这些发现与数据的结合已经bungarotoxin-induced毫克鼠模型中,在没有重大损害的证据的肌肉完整性报告(7,36)表明,减少积累腺苷导致紧张性活动不足 R在电机侧肌无力的动物可能与肌肉瘫痪造成乙酰胆的损失,而不是终板的免疫介导的破坏形态。肌肉麻痹 -conotoxin GIIIB,毒素阳性电压门控钠块+渠道而不影响神经功能(37),减少nerve-evoked ATP ( 15%)和ADO ( 90%)流出(7]。严重MG患者受损的氧化代谢和明显转向糖酵解代谢运动期间,收益率高端π/ ATP比和降低水平的突触ADO水平(38]。除了胞外分泌的ATP可能发生同步与ACh频率相关的方式(13,39)、核苷酸也可能发布的强直刺激健康动物的骨胳肌管,通过pannexin-1 hemichannels, 15秒到3分钟时间范围内(40]。总的来说,这些发现表明,ATP和最终产品的ectonucleotidase级联、ADO,可能被认为是必不可少的逆行肌肉活动和突触之间的介质适应性,这种情况可能是管制在病理条件下,如EAMG。在这一点上,一个人不能排除缺陷腺嘌呤核苷酸释放到ADO的转换(通过ecto-NTPDases)上游ecto-5′核苷酸酶/ CD73,这可能同意解释缺乏ADO的语气调节神经递质释放的运动终板。在不久的将来这一假设当然值得进一步研究。

第一次我们的结果显示,免疫抑制和神经肌肉传递赤字EAMG动物可能会恢复 R激活,可以通过简化与外生ecto-NTPDases AMP作为一个ADO前体(见图3和6)。因此,维护ecto-5′核苷酸酶/ CD73活动定义的模式可能是至关重要的细胞外ATP-derived ADO形成支持 R激活为了恢复细胞通讯在肌无力的赤字。李和合作者已经表明,管理 R受体激动剂,CGS21680C, 29天邮报EAMG感应(治疗)改善疾病严重程度和Th1、Th2细胞的数量减少而增加Treg细胞的数量(8),因此建议目标 R可能公认的治疗应用于T细胞自身免疫性疾病。潜在的重要的慢性系统性使用药物的副作用 R,以及剩余的行动 R配体在其他ADO受体亚型,推动药物设计的新时代为当地增加核苷函数由邻近的ecto-5′核苷酸酶/ CD73 [41,42]。在这种背景下,ecto-5′核苷酸酶/ CD73可能承担一个关键的角色作为药理目标微调 R的活动。的时空巧合表达式ecto-5′核苷酸酶/ CD73和 R受体提供了新的有吸引力的治疗目标免疫疗法和神经肌肉传递强化肌无力以最小的副作用。

缩写

EAMG: 实验性自身免疫性重症肌无力
MG: 重症肌无力
乙酰胆: 烟碱乙酰胆碱受体
接待员: 腺苷 受体
AMP: 腺苷酸
ADO: 腺苷
艾达: 腺苷脱氨酶
CFA: 完成Freund佐剂
IFA: 不完整的弗洛伊德佐剂
具体: Forkhead转录因子3
T注册: 调节性T细胞
LN: 淋巴结
咯, -BTX: Tetramethylrhodamine共轭与 金环蛇毒素
PEG-ADA: 聚乙二醇牛ADA, rb、兔子和ms,鼠标。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

支持的工作是FCT (PTDC / SAU-FCF / 108462/2008和PEst-OE /分/ UI0215/2014)和U。波尔图/桑坦德Totta (pp - ijup2011 - 232)。我们还要感谢m·茱莉亚里斯夫人为她从CHP-HSA技术支持ADA活性测定,芭芭拉博士奥利维拉EAMG感应她的援助,和让·科洛博士为他请提供的anti-rat CD73。