文摘

Thiopurines广泛应用免疫抑制剂治疗炎症性肠病(IBD)。的多态性thiopurine S-methyltransferase(硫代嘌呤甲基转移酶)影响thiopurine新陈代谢和治疗结果。我们使用硫代嘌呤甲基转移酶击倒(kd)模型的人类Jurkat t淋巴球细胞研究治疗6 -巯基嘌呤(6 -巯基嘌呤)的影响和6-thioguanine (6-TG)。法在蛋白质组和组织磷酸化蛋白质组我们确定了13个蛋白质表达水平改变了和9个蛋白质磷酸化信号改变。三种蛋白质(含硫的TXD17和GSTM3)与假定的功能在细胞氧化应激反应被6-TG治疗和改变另一个蛋白质PRDX3不同硫代嘌呤甲基转移酶的磷酸化kd细胞。此外,活性氧(ROS)测定结果符合显著诱导氧化应激的硫代嘌呤甲基转移酶击倒和thiopurine治疗。免疫印迹分析显示治疗关键抗氧化酶的表达(即改变。,年代OD2 and catalase) in both wt and kd groups, while SOD1 was downregulated by 6-TG treatment and TPMT knockdown. Collectively, increased oxidative stress might be a mechanism involved in thiopurine induced cytotoxicity and adverse effects (i.e., hepatotoxicity) and an antioxidant cotherapy might help to combat this. Results highlight the significance of oxidative stress in thiopurines’ actions and could have important implications for the treatment of IBD patients.

1。介绍

Thiopurines(如硫唑嘌呤(AZA), 6 -巯基嘌呤(6 -巯基嘌呤),和6-thioguanine (6-TG))是嘌呤类似物诱导免疫抑制和减少癌细胞的扩散1]。不同机制的行动已报告thiopurines包括阻塞复制由公司并入DNA和转录成RNA,阻塞Rac-1-mediated信号转导,antimetabolic效应通过三磷酸鸟苷合成抑制6-methyl thioinosine一磷酸(6-MeTIMP) [2]。

Thiopurines高活性化合物,进行广泛的代谢,以发挥他们的细胞毒性作用3]。这些代理的复杂的代谢进行了广泛的调查,试图阐明它们的疗效和毒性作用的机制(3]。有三个竞争thiopurine代谢途径,也就是说,转化为6-thioguanine核苷酸(6-TGN)次黄嘌呤鸟嘌呤phosphoribosyl转移酶(产生HPRT)、肌苷一磷酸脱氢酶(IMPDH),以及各种激酶和还原酶甲基化酶多态,thiopurine S-methyltransferase(硫代嘌呤甲基转移酶)和分解代谢thiouric酸通过黄嘌呤氧化酶(XO) [3]。6-TGN都纳入非酶的甲基化后的DNA S-adenosylmethionine转换为6-meTGN [4]。在复制而不是胞嘧啶,6-meTGN优先碱基对与胸腺嘧啶(4]。6-meTGN: T碱基对像复制错误和引起处理错配修复(MMR)和导致细胞死亡4]。

硫代嘌呤甲基转移酶催化芳香族化合物的S-methylation;没有已知的内源性底物和thiopurine药物是唯一已知的基板(5]。硫代嘌呤甲基转移酶酶活性的展品在红细胞(三峰分布6]。硫代嘌呤甲基转移酶基因多态性导致酶活性几乎50倍变异个体间(7]。thiopurine药物治疗反应的变化主要是由硫代嘌呤甲基转移酶基因多态性(了8])。6 -巯基嘌呤/阿扎的副作用包括骨髓抑制的主要问题,发生在2 - 5%的炎症性肠病(IBD)患者thiopurines [9]。的风险thiopurine诱导myelosuppression增加患者的硫代嘌呤甲基转移酶缺乏症。纯合子缺失发生在0.3%(水平很低或没有)和杂合性发生在11%(与中级水平相关)的一般人群(10]。肝毒性发生在3 - 10%的阿扎暴露过敏症患者,一个特殊的胆汁郁积的反应,或内皮细胞损伤,导致停药(11]。许多不同的因素已报告与这个thiopurine诱导肝毒性包括更高浓度的甲基化代谢物和线粒体损伤与谷胱甘肽耗竭(12]。

Thiopurines已知诱导氧化应激,特别是线粒体(13),导致线粒体功能障碍和应激活化蛋白激酶通路的激活14]。阿扎诱导氧化应激导致三羧酸循环功能障碍通过消耗至关重要的线粒体酶(15]。6-TGN也被纳入线粒体DNA (mtDNA)迅速氧化和抑制mtDNA复制。这将导致减少线粒体蛋白质浓度和线粒体功能损失(16]。最近的一项研究在培养人类淋巴母提出ROS生成,导致氧化DNA损伤和线粒体功能障碍的机制负责硫鸟嘌呤诱导细胞毒性(17]。基因表达的研究也报道thiopurine诱导基因的表达改变参与蛋白质和ATP-biosynthesis [18]。当老鼠用6 -巯基嘌呤治疗,观察到明显改变基因的表达与脂质代谢异常有关,炎症反应、氧化应激、ATP耗竭,细胞死亡19]。

研究报告中我们采用蛋白质组学方法来识别细胞thiopurine疗法和微分硫代嘌呤甲基转移酶活动的目标。减少稳定硫代嘌呤甲基转移酶击倒(> 80%蛋白质水平和酶活性水平72%)成立于培养人类t淋巴球使用序列特定成分(20.]。这些硫代嘌呤甲基转移酶可拆卸的细胞被第一次使用一个模型在蛋白质组学分析研究。我们推断,功能性监管协会的蛋白质可能有助于理解thiopurine疗法至关重要的细胞过程的影响或识别新细胞目标或潜在thiopurine药物的个性化治疗方法。

2。方法

2.1。试剂

所有细胞培养试剂、RPMI胎牛血清(FCS),磷酸缓冲盐(PBS)、青霉素、链霉素,从PAA实验室购买,Colbe,德国。乙腈(ACN)购买从Promochem Wesel,德国。家伙是来自Applichem,达姆施塔特,德国。尿素、硫脲、二硫苏糖醇(DTT),胰蛋白酶,三氟乙酸(组织),碳酸钠,碳酸氢铵,6 -巯基嘌呤,6-TG,和DMSO来自Sigma-Aldrich, Steinheim,德国。两性电解质、蛋白质分析工具和固定化pH梯度带(IPG条)获得Bio-Rad,德国慕尼黑。蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒从罗氏公司购买,德国曼海姆。甘油、铁氰化钾和硫代硫酸钠从默克公司购买,达姆施塔特,德国。甲酸是巴斯夫,德国路德维希港。溴酚蓝和Trizma基础来自卡尔罗斯,德国卡尔斯鲁厄。十二烷基硫酸钠(SDS)是购自美国赛瓦,德国海德堡。

2.2。细胞培养

目标t淋巴球thiopurines是免疫抑制药物,所以我们选择Jurkat细胞系(t淋巴球)我们的研究。野生型Jurkat细胞系(wt)获得了德国的微生物和细胞培养(DSMZ),德国布伦瑞克。细胞被维护在RPMI补充10% (v / v) heat-inactivated FCS, 100 U /毫升青霉素,和0.1毫克/毫升链霉素37°C,湿度95%,20%₂,5%的公司₂在75厘米²培养瓶(Sarstedt, Nuembrecht,德国)。Jurkat击倒(kd)细胞保持在潮霉素(Cayla、法国)诱导选择性压力(200μg / mL)。为了避免任何选择性剂对实验结果的影响,细胞被播种前24小时thiopurine治疗和保持不潮霉素直到实验结束。确保相同级别的硫代嘌呤甲基转移酶击倒在整个研究中,文化经常被重新冷冻细胞早期的段落。此外,硫代嘌呤甲基转移酶水平运行的文化被确认使用实时PCR或酶活性分析。

2.3。为蛋白质组分析样品制备

Jurkat wt和kd细胞治疗48 h和DMSO溶液或集成电路₆₀剂量的6 -巯基嘌呤(4.6μmol / L和4.7μmol / L wt与kd resp。)或6-TG (2.7μmol / L和0.8μmol / L wt和kd,职责)。的集成电路₆₀值测定如前所述[20.];短暂的细胞治疗DMSO(控制)或0.75μ10 mol / Lμ6 -巯基嘌呤和0.25 mol / Lμmol / L - 8μmol / L 6-TG 48 h。孵化后细胞的生存能力估计使用微量培养四唑盐(MTS)试剂(Promega公司麦迪逊,WI)和IC₆₀值计算使用GraphPad棱镜软件5.01版本(GraphPad软件,Inc .)。细胞被收获,与冰冷的PBS洗了三次。洗细胞颗粒得到在1800转离心10分钟4°C,然后细胞溶解在缓冲区包含7 mol / L尿素,2摩尔/ L硫脲,w / v家伙4%,2%两性电解质(pH值3 - 10),德勤1%,15% v / v蛋白酶,10% v / v磷酸酶抑制剂鸡尾酒。溶菌产物的蛋白质含量由布拉德福德估计化验使用Bio-Rad蛋白质试剂根据制造商的指示。样品能整除的是保存在−80°C到进一步使用。

2.4。二维电泳(2 de)

如前所述执行2 de [21)和一些小的修改。简单地说,蛋白质样品(130μg)从Jurkat wt或kd细胞混合补液缓冲区(7 mol / L尿素,2摩尔/ L硫脲,4%的家伙,0.2%两性电解质(pH值3 - 10),和0.2%德勤)含有的微量溴酚蓝的总量330μl .补液(被动),样本应用于非线性IPG条(pH值3 - 10)为1 h,然后覆盖矿物油,允许站在室温下过夜。然后等电点聚焦(IEF)能源论坛在千变万化的合作执行单元(Bio-Rad)使用以下配置:1 h在100伏,500伏,1 h和2 h 1000伏特和8000伏特volts-h共有32000。之前二维电泳分离,集中IPG带平衡30分钟在室温下在一个缓冲区包含50更易与L Tris-HCL (pH值8.8),6 mol / L尿素,v / v 30%甘油、2% SDS, 10 g / L德勤其次是孵化相同的缓冲区中取代40 g / L碘乙酰胺。蛋白质的平衡条然后解决12.5% sds - page在千变万化的二室(Bio-Rad)在100 V和4°C。

2.5。Phosphospecific 2 de凝胶的染色

凝胶固定两次执行解决方案包含50%甲醇和10%醋酸45分钟紧随其后的是三个15分钟洗双蒸馏水。凝胶是沾Pro-Q钻石phosphostain(表达载体,佩斯利,英国)一夜之间在黑暗中,在室温下。使脱色进行了三次30分钟使脱色溶液中含有20% ACN和50更易与醋酸钠,紧随其后的是三个在双重蒸馏水洗5分钟。凝胶进行扫描使用成像仪器(佛罗里达州——5100年富士摄影电影,杜塞尔多夫,德国)的波长532 nm。从银凝胶切除的磷酸化蛋白,含磷的和银凝胶(主凝胶在每种情况下)被使用重叠(扭曲)δ2 d软件(Decodon GmbH,格赖夫斯瓦尔德,德国)。地标被从磷的转移到银凝胶。为了确保准确的定位,两个独立的个体也进行评估,确认软件辅助位置。

2.6。蛋白质可视化:密度测量和统计分析

短暂,凝胶是固定的,其次是洗涤和敏感。凝胶是沾着刚做好的硝酸银溶液(0.2%硝酸银和0.026%甲醛)在室温下20分钟紧随其后三20秒在双重蒸馏水洗。凝胶是沉浸在发展中解决方案包含6%的碳酸钠,0.0185%甲醛,6%硫代硫酸钠。当斑点出现,反应停止,停止(50%甲醇和12%乙酸)的解决方案。发展后,凝胶与彩色图像扫描仪扫描卡诺扫描8400(佳能、东京、日本)。五个独立的二维实验与每个治疗和细胞类型和δ2 d软件3.6版本(Decodon GmbH,格赖夫斯瓦尔德,德国)是用于光密度分析(22]。

匹配点在凝胶后,强度计算和归一化强度除以每个点的总和所有点对应的凝胶强度和合成强度被认为是特定的相对强度。Microsoft Excel是用来计算平均值,标准偏差,比,褶皱变化和意义(使用学生的t以及)。点显示至少1.5倍表达变化()被认为是具有统计学意义。GraphPad棱镜软件5.01版本(GraphPad软件,Inc .)是用于生成图表。

2.7。胰蛋白酶的消化

差异表达斑点切除从银染色凝胶,其次是根据修改后的凝固态消化方法所描述的早些时候舍瓦和他的同事们(23]。短暂,切除凝胶点洗了30更易与L / L铁氰化钾和100更易与硫代硫酸钠使脱色,其次是洗涤ACN 50%和100更易与L碳酸氢铵和干燥在真空离心(UNIVAPO, uniEquip, Martinsried,德国)。干燥后,胰蛋白酶的消化与胰蛋白酶消化缓冲区(0.1执行μ克/μL胰蛋白酶,1 mol / L氯化钙,1 mol / L碳酸氢铵)在冰上了45分钟,然后孵化一夜之间在没有胰蛋白酶消化缓冲37°C。缩氨酸提取ACN浓度的增加和组织提取的多肽被真空离心干燥。肽在FA 0.1%注射重组成nanoflow高效液相色谱。

2.8。肽序列分析使用Nano-LC ESI Q-TOF MS / MS和数据库搜索

肽样品(1μ介绍了L)到两个连续C18-reversed相色谱柱(C18 PepMap: 300μm×5毫米;5μ米粒子大小和C18 PepMap100 nanoanalytical列:75μm×15厘米;3μ米粒子大小;LC包装,germer完成,德国)使用nanoflow CapLC autosampler(水域,德国的埃施博恩)。肽的筛选了与ACN梯度的增加和分析Q-TOF天涯全球质谱仪(Micromass,曼彻斯特,英国)配备nanoflow ESI Z-spray源在正离子模式下,如前所述[24]。数据分析与MassLynx(4.0版)软件。峰列表吉祥物在线搜索使用的搜索引擎(http://www.matrixscience.com/)对UniProt / SwissProt数据库15.15版(515203项,181334896元素)。对数据库数据搜索使用以下参数:胰蛋白酶酶消化;最大的一个错过的裂解位点允许;单一同位素的质量价值和无限制的蛋白质质量;肽宽容±0.5哒和MS / MS宽容±0.5哒。蛋白质被识别的基础上的两个或两个以上的肽离子得分超过了阈值,和反映了95%的置信水平匹配的肽。

2.9。功能分类

生物功能被分配使用诉讼代理人所确定的蛋白质(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)[25]。

2.10。西方墨点法

短暂,蛋白质12.5% sds - page分离并涂抹到PVDF膜(微孔、Schwalbach、德国)用半干的Trans-Blot系统(SD Trans-Blot Bio-Rad,慕尼黑,德国)。膜阻止了5%的脱脂奶粉准备TBS-T缓冲区(50更易与L Tris-HCl (pH值7.5),200更易/ L氯化钠,和0.05%渐变20)在室温下1 h。与TBS-T缓冲洗涤三次后,细胞膜是孵化1:1000稀释;兔子anti-stathmin(细胞信号技术,丹弗斯,MA)或兔子anti-SOD1 (Abnova、台北、台湾)或兔子anti-SOD2 (Abcam,剑桥,英国)或兔子anti-CAT(罗克兰Gilbertsville, PA)和1:10000鼠标beta-actin (Sigma-Aldrich、Steinheim、德国)一夜之间在4°C。完成后孵化膜的清洗和进一步孵化适当HRP-conjugated二级抗体在室温下1 h。蛋白质检测使用一个增强化学发光(ECL)试剂(通用电气医疗集团,慕尼黑,德国)。墨迹是发达Amersham Hyperfilm(通用电气医疗集团,慕尼黑,德国)。四个独立的实验从每个免疫印迹stathmin和信号强度的量化使用LabImage软件2.71版本(Kapelan、莱比锡、德国)。三个独立实验SOD1, SOD2,猫。

2.11。ROS化验

活性氧的水平是决定如前所述[26)做了一些调整。治疗后细胞的IC₆₀剂量的6 -巯基嘌呤和6-TG 48 h,媒体被离心分离去除。细胞在PBS resuspended包含10μmol / L DCFDA (Sigma-Aldrich、Steinheim、德国)和孵化在37°C 1 h。荧光强度是决定λ氟320荧光板读者(MWG生物技术,潘茨堡,德国)激发和发射波长设置在485和530海里,分别。最后,细胞计数为每个样本进行归一化。细胞ROS化验重复在四个独立的准备,每一式三份。

3所示。结果与讨论

thiopurine治疗的影响人类t淋巴球法在蛋白质组和组织磷酸化蛋白质组(Jurkat)与正常野生型(wt)硫代嘌呤甲基转移酶表达和击倒(kd)细胞减少硫代嘌呤甲基转移酶表达研究。细胞治疗与车辆DMSO溶液或集成电路₆₀剂量的6 -巯基嘌呤或6-TG 48 h(图1(一))。治疗后,细胞收获和细胞溶解和总蛋白溶菌产物用于2 de。凝胶是沾phosphospecific染色之后,银染色(见补充图1的网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/434825)。的不同监管点≥±1.5倍的变化(由学生的t以及)切除、消化和被Q-TOF MS / MS分析。统计分析表明,共有13个蛋白质显示显著改变表达式和9显示改变蛋白质磷酸化(数字1 (b)和1 (c))。预测和实际π的蛋白质,以及分子质量与其SwissProt加入数字,和MS / MS谱信息提供了补充表1和2。重大变化被观察到蛋白质组水平法和组织磷酸化蛋白质组,由于硫代嘌呤甲基转移酶击倒和thiopurine治疗。有趣的是6 -巯基嘌呤和6-TG显示不同的蛋白质调控模式在这两种细胞类型。确定蛋白显著改变表达式和磷酸化参与多种细胞功能和大多数的蛋白质参与三个功能类别,也就是说,氧化应激反应,细胞周期调控,调控细胞骨架动力学(表1和2)。

基于这些发现,我们进一步评估细胞氧化应激使用ROS化验(图2(一个))。产生的荧光强度孵化治疗和控制细胞的荧光染料DCFDA测量和归一化总细胞数。结果显示显著增加荧光强度在wt和kd细胞由于6 -巯基嘌呤和6-TG治疗相比,DMSO治疗控制。所有硫代嘌呤甲基转移酶可拆卸的群体表现出更高的ROS水平与野生型同行相比。为了看到活性氧积累在细胞抗氧化机制的影响,然后,我们测量了三个重要的抗氧化酶的表达改变,也就是说,超氧化物歧化酶1 (SOD1),超氧化物歧化酶2 (SOD2)和过氧化氢酶(CAT)的免疫印迹分析(图2 (b))。

3.1。蛋白质由硫代嘌呤甲基转移酶击倒

比较Jurkat kd细胞wt同行在DMSO, 6 -巯基嘌呤或6-TG显示改变kd细胞(表中6蛋白的表达1;图1 (b)显示了一个代表银染色凝胶wt DMSO的这些景点标志)。这些蛋白质,四个显著调节(点2 - 5)和两个表达下调(点1和13)。异构的核糖核蛋白H3 (HNRH3),δ(3、5)-它(2、4)-dienoyl-CoA异构酶(ECH1) 5′脱氧尿苷三磷酸nucleotidohydrolase,线粒体(DUT)和cofilin 1 (COF1)调节。Ataxin 10 (ATX10,点1)比wt DMSO kd DMSO细胞中表达下调。Myotrophin (MTPN,发现13)比wt 6-TG kd 6-TG细胞中表达下调。COF1肌动蛋白动力学的关键球员,已经成为细胞内稳态的代理27];其upregulation kd (DMSO、6 -巯基嘌呤和6-TG)细胞表明硫代嘌呤甲基转移酶在细胞稳态过程的重要性。MTPN是一个多功能,锚蛋白重复蛋白在所有哺乳动物组织中广泛表达(28]。COF1 MTPN参与肌动蛋白动力学和聚合,分别。他们改变了表达kd细胞表明硫代嘌呤甲基转移酶及其底物的可能参与细胞骨架的监管。COF1 proapoptotic作用;线粒体易位COF1诱导细胞色素c的释放和细胞凋亡29日]。ROS也影响COF1活动通过促进其脱磷酸作用[30.]。因此,已知COF1在细胞骨架变化引起的氧化应激(30.)也可以参与的作用机制thiopurines(补充图2 (a)和5 (a))。phosphostained凝胶光密度分析发现(表6蛋白磷酸化水平改变了信号2;图1 (c)显示了一个代表phosphostained凝胶wt, DMSO对细胞与这些斑点)。这六个蛋白质,四个表现出增加磷酸化击倒的结果(即。,6-phosphofructokinase type C (K6PP, spot 1), T-complex protein 1 subunit zeta (TCPZ, spot 2), glutathione S-transferase Mu 3 (GSTM3, spot 8), and thioredoxin-dependent peroxide reductase (PRDX3, spot 9)). TCPZ is a subunit of TCP-1 (CCT) which contains chaperonin and is involved in the production of native actin, tubulin, and numerous other proteins required for cell cycle progression [31日]。我们观察到增加磷酸化的TCPZ 6 -巯基嘌呤治疗kd细胞相比,6 -巯基嘌呤治疗wt(补充图2 (b)和6 (a))。改变的磷酸化TCPZ亚基可能表明有条件现金转移支付对底物的亲和力的蛋白质的变化由于6 -巯基嘌呤治疗硫代嘌呤甲基转移酶缺乏细胞。

GSTM3属于谷胱甘肽S-transferase(销售税)的家庭。保护细胞免受氧化应激通过中和活性化合物(32]。转译后的修改如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化可以调节销售税的稳定性和功能(33]。销售税而闻名的作用与谷胱甘肽共轭的阿扎,一个步骤需要6 -巯基嘌呤的转换。销售税多态性之间的相关性和阿扎副作用也被报道34]。在这项研究中,6-TG治疗导致增加GSTM3磷酸化wt和kd细胞可能会减弱它的功能,进而影响细胞的氧化应激。PRDX3(硫氧还蛋白peroxidase-3)是线粒体和线粒体thioredoxin-2使用本地化(Trx2)作为电子供体,以H₂O₂(35]。PRDX3磷酸化与过氧化物酶活性降低有关,增加氧化应激,因此线粒体功能失调(36]。我们还观察到upregulation PRDX3 kd的细胞(补充图3和6 (b))。增加GSTM3 PRDX3磷酸化和硫代嘌呤甲基转移酶治疗kd差别SOD1对这些细胞与氧化应激有关建议的ROS化验结果。SOD1催化转化的超氧化物自由基过氧化氢进一步清除的猫(37]。Downregulation与氧化应激相关的已知SOD1 [38]。同样,调节SOD2的表达和猫后6 -巯基嘌呤和6-TG治疗也表明细胞应对高氧化应激及其upregulation有保护作用[39因为SOD2有助于维持活性氧平衡和产生一个更理想的细胞代谢环境(40]。在kd细胞氧化应激明显高于wt细胞相比,有或没有治疗。自硫代嘌呤甲基转移酶的自然底物仍不清楚,可以推测,硫代嘌呤甲基转移酶可拆卸的可能会影响一些内源性化合物代谢(s)这可能导致改变抗氧化蛋白的表达或转译后的修改,因此增加了氧化应激。

GDP的Rab分离抑制剂β(GDIB,点4)和mRNA出口因素(RAE1L,现货7)显示减少kd细胞磷酸化。Rab GDP分离抑制剂结合prenylated Rab-GTPases,交付Rab蛋白质特定的隔间,并检索Rab融合目标完成后的催化循环(41]。硫代嘌呤甲基转移酶击倒GDIB的磷酸化作用下降。先前的研究显示,磷酸化的GDI可能与更有效的检索Rab蛋白膜(了41])。减少GDIB磷酸化可能表明一个变更GDIB活动可能因此调节细胞周期进展。真核细胞调节基本的快速破坏关键调控蛋白的细胞过程,如细胞周期调控和转录因子,催化PRS10 [42]。研究酵母显示PRS10 atp酶活性下降,反之亦然(脱磷酸化43]。在这项研究中我们观察到减少PRS10磷酸化。

RAE1L穿梭运输因素,允许有效的出口信使rna通过核孔复合物(NPC) [44]。其磷酸化是增加由于6-TG治疗kd细胞,但与wt 6-TG相比其信号较弱。人大动力学发挥重要作用在细胞周期转换(了45])。RAE1L和其他蛋白质的磷酸化的核电站有丝分裂激酶导致改变人大动力学(综述[44])。

3.2。蛋白质由6 -巯基嘌呤(4.6μ2.8 mol / L)和6-TG (μmol / L)治疗Jurkat wt细胞

Jurkat wt细胞处理集成电路₆₀剂量的6 -巯基嘌呤(4.6μ2.8 mol / L)和6-TG (μmol / L)。比较治疗的6 -巯基嘌呤Jurkat wt细胞和DMSO控制三种蛋白质(表显示显著的表达变化1)。6,对应stathmin 1 (STMN1),是表达下调(图3(一个)图5 (c))和补充。监管STMN1进一步证实了免疫印迹分析(图3 (b))。现货7日确定为演员家庭蛋白质ABRACL (ABRAL)也显著下调6 -巯基嘌呤wt细胞治疗。11点,血红蛋白亚基α(HBA),是调节由于6 -巯基嘌呤治疗wt细胞(补充图4 (a)和5 (b))。Thiopurines已知诱导细胞死亡插入不匹配的DNA和激活细胞周期检查站(ATM /相关和ATR / Chk1),导致细胞周期阻滞于G2 / M期和细胞死亡4]。STMN1磷蛋白质,作为微管监管机构在有丝分裂期间(46];其表达下调6 -巯基嘌呤治疗。STMN1表达的抑制与严重的有丝分裂纺锤体异常和退出困难的有丝分裂,导致细胞G2 / M的积累阶段。这些结果与之前报道一致G2 / M期细胞造成逮捕thiopurines(了4])。这个细胞周期阻滞机制是DNA链断裂(综述(4])。STMN1的差别,对这些也可能是一种机制负责G2 / M期逮捕thiopurines所致。ABRAL,主演家族的一员,被暴露于6 -巯基嘌呤表达下调。没有功能信息可供ABRAL(或HSPC280),但一些研究表明,它有可能参与细胞周期调控和DNA损伤反应(47,48]。这一发现与相关thiopurine诱导细胞周期紊乱。

6-TG治疗七wt细胞中蛋白质的表达的影响。有upregulation COF1,硫氧还蛋白(黄),profilin 1(教授1)巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、血红蛋白亚基α(HBA),硫氧还蛋白域包含蛋白质17 (TXD17)和MTPN。这些蛋白质与点5和8日至13日,分别在一个代表性的凝胶(图1 (b))。含硫的调节在Jurkat wt 6-TG细胞的治疗。它催化可逆减少蛋白质二硫键(了49])。它主要是局部细胞溶质,但与氧化应激,把原子核(综述[49])。含硫的upregulation 6-TG诱导氧化应激可能是一个反应。教授1超表达诱导细胞周期阻滞在乳腺癌细胞和糖分会让细胞凋亡的细胞毒性刺激(50]。教授1 upregulation观察到这里也可能使敏感细胞6-TG诱导细胞凋亡。

改变也是法的组织磷酸化蛋白质组6 -巯基嘌呤和6-TG治疗后观察。5显示显著改变蛋白质磷酸化信号:6 -巯基嘌呤曝光后两个和三个6-TG后(表2,图1 (c))。Coronin-1A (COR1A)或现货3显示显著下调磷酸化wt 6 -巯基嘌呤组。减少观察磷酸化26 s蛋白酶的调节亚基10 b (PRS10,现货6)。6-TG组,肌动蛋白相关protein-2 (ARP2,现货5)磷酸化,差别显示对这些虽然RAE1L(7点)和GSTM3(现货8)显示upregulation的磷酸化。coronins影响肌动蛋白动力学通过抑制Arp2/3复杂的成核(51]。研究与Arp2/3 COR1B显示监管的互动通过磷酸化蛋白激酶C (PKC) [52]。ARP2与肌动蛋白和形式的一部分Arp2/3复杂控制肌动蛋白动力学(53]。磷酸化Arp2/3复杂的肌动蛋白丝成核是必要的。我们观察到的差别thiopurine诱导对这些ARP2磷酸化。可能造成减少Arp2/3差别这对这些复杂的活动,从而影响肌动蛋白动力学。分别COR1A ARP2影响Arp2/3成核和活动。它可以假设thiopurine治疗可能影响肌动蛋白动力学通过操纵Arp2/3复杂的成核和活动。共同调节肌动蛋白的变化观察动力学可能参与细胞凋亡的细胞毒性或感应thiopurines(补充图4 (b)和(c) 6日)。

在我们的研究中描述的所有蛋白质的目标已经研究的很透彻,但是我们报告他们第一次由于thiopurine wt和kd细胞接触。Thiopurines诱导细胞周期阻滞通过DNA损伤和氧化应激,以及通过改变这些蛋白质的目标。交替可能还不清楚这些路径之间的串扰,需要进一步调查。

3.3。蛋白质由6 -巯基嘌呤(4.7μ0.8 mol / L)和6-TG (μmol / L)治疗Jurkat kd细胞

总共三个蛋白质不同的监管Jurkat kd细胞:一个6 -巯基嘌呤治疗后和两个6-TG治疗后(表1)。STMN1 6 -巯基嘌呤治疗后表达下调。ECH1是两个显著调节kd蛋白细胞暴露于6-TG。第二个调节MIF在kd蛋白细胞。定量分析显示四个蛋白磷酸化水平改变了:一个(表6 -巯基嘌呤和三个6-TG暴露的细胞2)。6 -巯基嘌呤暴露TCPZ磷酸化后增加相比,DMSO暴露控制细胞kd。在kd细胞暴露于6-TG K6PP显示减少磷酸化,而RAE1L和GSTM3显示增加磷酸化。图1 (c)显示了一个代表phosphostained wt DMSO组的凝胶与这些斑点明显。

蛋白质识别包括一些细胞氧化应激反应的重要目标,也就是说,含硫的,TXD17 GSTM3, PRDX3。同样,肌动蛋白细胞骨架的重要监管机构,也就是说,COF1教授1,对氧化应激(即已知敏感。、COF1活动和教授1表达受氧化应激(27,54]),也确定了wt和kd细胞。

在活的有机体内研究表明thiopurines诱导毒性通过诱导细胞凋亡和机制涉及氧化应激、线粒体损伤,和ATP耗竭,导致不可逆的断开和坏死细胞死亡的13,55]。总的来说,这些和我们的研究结果表明,增加thiopurine诱导的氧化应激可能是导致药品不良反应(adr)包括炎症性肠病和急性淋巴细胞白血病患者的肝毒性。别嘌呤醇(喂)是一种抗氧化剂,通过抑制黄嘌呤氧化酶(XO) [12]。联合治疗与别嘌呤醇thiopurines IBD患者可能导致主要临床改善,但同时也可能会增加myelotoxicity和机会性感染的机会12,56]。Cotherapy thiopurines和别嘌呤醇没有被报道用于所有患者虽然thiopurine诱导肝毒性的发生率也明显在所有的病人57]。一个逻辑策略防止thiopurine诱导肝毒性是利用抗氧化剂cotherapy,不影响thiopurine代谢的药物,可用于所有的硫代嘌呤甲基转移酶活动团体没有剂量调整。有成功使用的轶事报告草本抗氧化剂治疗结合thiopurines避免肝损伤包括病例报告的前一个34岁的女人遭受早幼粒细胞白血病联合疗法无法容忍维持治疗(甲氨蝶呤和6 -巯基嘌呤)由于肝毒性58]。据报道,这个病人是能够完成治疗,取得了正常的肝功能,当处理水飞蓟素(一种草药抗氧化产品)以及维持治疗。

4所示。结论

这是第一个基于蛋白质组学的研究调查的影响thiopurine和微分硫代嘌呤甲基转移酶活性在细胞蛋白质组。在野生型和可拆卸的细胞,6 -巯基嘌呤和6-TG治疗导致重要的蛋白质调控。调节蛋白质识别是直接或间接地参与细胞氧化应激反应。同样,显著影响细胞周期调控和细胞骨架重组机制被发现。总的来说,这些结果表明,thiopurine治疗可以诱导细胞毒性的DNA损伤(thiopurine行动的一个已知的机制)和氧化应激增加。细胞应对这些压力包括表达和活性的调控细胞周期和细胞骨架系统的重要目标。6 -巯基嘌呤和6-TG影响抗氧化的活性蛋白质导致增加氧化应激和线粒体功能障碍的迹象,以及细胞骨架和细胞周期紊乱。这些影响可能导致thiopurine诱导细胞毒性的病人包括myelotoxicity和肝毒性(图4)。蛋白质的目标可能thiopurine诱导氧化应激和细胞毒性作用被确定使用蛋白质组学和phosphoproteomic方法首次在野生型和可拆卸的人类细胞淋巴细胞细胞系。虽然这些改变的确切机制尚不清楚,进一步研究可能有助于理解复杂thiopurines或者预防的作用机制与抗氧化剂cotreatment thiopurine治疗病人。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

Misbah Misdaq巴基斯坦的立场是由高等教育委员会。作者Walson教授表示衷心的感谢,感谢批判阅读论文的实验工作和卡西姆博士的支持。他们承认德国研究基金会的支持和开放获取出版哥廷根大学的基金。

补充材料