文摘

识别巨噬细胞对凋亡细胞的决议是至关重要的炎症,免疫耐受和组织修复。Cyclooxygenase-2 (cox - 2) /前列腺素E2(铂族元素₂)和肝细胞生长因子(HGF)在组织修复过程中发挥了重要的作用。我们研究了巨噬细胞cox - 2和铂族元素的特点₂表达介导的凋亡细胞,然后决定如何巨噬细胞暴露于凋亡细胞在体外和在活的有机体内编排cox - 2 /铂族元素之间的交互₂和HGF信号通路。曝光264.7原始细胞和主要腹膜巨噬细胞凋亡细胞导致感应cox - 2和铂族元素₂。cox - 2抑制剂ns - 398抑制凋亡cell-induced铂族元素₂生产。ns - 398和COX-2-siRNA以及铂族元素₂EP2受体拮抗剂,阻塞HGF表达凋亡细胞的反应。此外,HGF受体拮抗剂抑制cox - 2的增加和铂族元素₂归纳。的在活的有机体内cox - 2 /铂族元素之间的相互作用的重要性₂和HGF通路通过积极的反馈回路所示的肺泡巨噬细胞在活的有机体内暴露bleomycin-stimulated肺凋亡细胞。我们的结果表明,upregulation cox - 2 /铂族元素₂和HGF在巨噬细胞暴露于凋亡细胞代表一个机制来协调抗炎和antifibrotic凋亡细胞识别的结果。

1。介绍

凋亡细胞的清除组织巨噬细胞和非专业吞噬细胞是一个重要的过程,在组织内稳态,免疫,炎症和分辨率。凋亡细胞识别积极导致生产抗炎介质如TGF -、il - 10和铂族元素₂(1,2]。凋亡和吞噬细胞之间的相互作用中扮演重要的角色的再生和修复受损组织的感应growth-maintenance因素,如VEGF, HGF和铂族元素₂,重建受损组织导致减少fibroproliferative后遗症[3,4]。

cox - 2酶产品,铂族元素₂是一种脂质介质,类似于TGF -已被证明有赞成或消炎的特性在不同的情况下。在肺,铂族元素₂在组织修复过程中扮演的角色和在限制免疫炎症反应5]。铂族元素₂,这是通过转换PGH花生四烯酸的生成₂通过COX-1或cox - 2酶,是肺成纤维细胞产生的主要类二十烷酸和许多其他肺细胞,包括肺泡巨噬细胞。通过E-prostanoid受体2 (EP2)介导的细胞内环腺苷酸的增加,铂族元素₂直接抑制成纤维细胞的几个主要pathobiologic功能,包括趋化作用、扩散(6),胶原蛋白合成7],和分化成myofibroblasts [8]。减少铂族元素₂生产和/或信号中可以观察到人类和动物肺纤维化(9,10]。

在Fadok和他的同事们的研究1),铂族元素的外源性补充₂LPS-stimulated巨噬细胞减少促炎细胞因子的生产,如肿瘤坏死因子-,il - 1,引发。添加吲哚美辛恢复抑制促炎细胞因子的生产引起的凋亡细胞巨噬细胞与LPS刺激。最近,我们展示了在体外,凋亡cell-induced HGF减少炎性细胞因子表达在巨噬细胞11]。此外,我们发现在活的有机体内暴露在细胞凋亡诱导抗炎作用通过感应cox - 2 /铂族元素₂bleomycin-stimulated肺,HGF信号,使用药物的方法(11,12]。我们以前的研究也表明,在活的有机体内暴露在细胞凋亡导致增强HGF的表达(11)和cox - 2和铂族元素的分泌₂(12]直到纤维化阶段bleomycin-induced肺损伤。这些数据表明,抗炎和antifibrotic效应后的肺凋亡细胞滴注法与协调增加HGF和cox - 2 /铂族元素₂信号。然而,机制HGF和cox - 2的长期诱导凋亡细胞并不为人明白在细胞模型在体外。因此,一个关键问题是识别巨噬细胞的凋亡细胞能否直接向协调信号通路诱导的抗炎和growth-maintenance因素。在目前的研究中,我们第一次感应cox - 2和铂族元素的特点₂通过在体外264.7暴露原始细胞和小鼠原发性腹膜巨噬细胞凋亡细胞。然后我们决定如何巨噬细胞程序性凋亡细胞编排cox - 2 /铂族元素之间的交互₂和HGF信号。

2。材料和方法

2.1。试剂

放线菌素D、环己酰亚胺、吲哚美辛买来Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯和ns - 398 ah - 6809 gw - 627368 x和铂族元素₂从开曼群岛购买化学(安阿伯市MI)。pha - 665752来自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。gene-specific相对rt - pcr设备是获得表达载体(CA)卡尔斯巴德,M-MLV逆转录酶是购自Enzynomics (Hanam、韩国)。HGF和TGF - ELISA试剂盒1从研发系统,铂族元素的酶免疫测定(EIA)包₂和15-deoxy -12日,14-PG J₂(15 d-pgj₂)从试验设计(安阿伯市MI)。本研究中使用的抗体对COX-1和cox - 2(开曼化学),HGF -(圣克鲁斯生物技术)肌动蛋白(Sigma-Aldrich)。

2.2。细胞系、文化和刺激

小鼠原始264.7巨噬细胞(位于马里兰州Rockville美式文化集合)镀在3×10⁵细胞/毫升和孵化在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM、媒体科技有限公司、华盛顿特区)补充10% heat-inactivated的边后卫,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素在37°C和5%的公司₂。在刺激之前,媒介是血清X-vivo 10所取代。巨噬细胞和凋亡刺激或可行的细胞(1.5×10⁶细胞/毫升)。

2.3。隔离和文化的主要细胞

居民腹膜巨噬细胞被分离出6 - 7-week-old无菌雄性C57BL / 6小鼠(东方生物,国军,韩国)重- g。动物保健委员会梨花医学研究所(韩国首尔)批准试验协议(11号- 0171)。居民腹膜巨噬细胞被灌洗5毫升的冰冷的无菌隔离哈佛商学院后小鼠安乐死与有限公司₂。灌洗液离心,居民腹膜细胞被镀在1×10⁶细胞/ 5%和培养湿润有限公司₂气氛在37°C和10% heat-inactivated DMEM补充的边后卫,2毫米l谷氨酰胺,100μ克/毫升的链霉素和100 U /毫升的青霉素。孤立的巨噬细胞和凋亡刺激Jurkat T细胞(3×10⁶细胞/毫升)。暂停腹膜巨噬细胞是可行的95%以上,由台盼蓝染料排斥。个人还是小鼠胸腺细胞被分离出3 -通过一个70剁胸腺μ米孔隙大小细胞过滤器(BD生物科学,贝德福德,MA)。人类中性粒细胞从正常健康的捐赠者按照协议进行审核和批准的机构审查委员会。使用endotoxin-free试剂和塑料制品,人类中性粒细胞分离血浆Percoll方法之前(13]。

2.4。诱导细胞凋亡

人类Jurkat T淋巴细胞、海拉上皮细胞和小鼠胸腺细胞受到紫外线照射在254 nm 10分钟后跟孵化rpmi - 1640年10%胎牛血清在37°C和5%为2 h有限公司₂。人类中性粒细胞(纯度> 95%)要么是在9×10培养过夜⁵/毫升RPMI 1640 37°C的5%股份有限公司₂或紫外线照射过的10分钟,其次是孵化2 h后除了巨噬细胞(3×10⁵/毫升)。评价核形态上使用光学显微镜Wright-Giemsa彩色样本表明,辐照细胞凋亡(约70 - 80%14]。细胞凋亡证实了膜联蛋白V-FITC /碘化propidium (BD生物科学,圣何塞,CA)染色后通过流式细胞术分析FACSCalibur系统(BD生物科学)15]。岁人类中性粒细胞凋亡通常被证明是60 - 70%的评估核凝结Wright-Giemsa染色样品和坏死被台盼蓝排斥(不到2%16]。

2.5。核转染

264.7原始细胞和居民腹膜巨噬细胞和1是暂时性的转染μ克/毫升的siRNA专门针对cox - 2或COX-1或控制核(Bioneer,首尔,韩国)使用5μ小干扰rna转染试剂的L (Genlantis,圣地亚哥,CA)根据制造商的协议。序列用于cox - 2可拆卸的5′-CUA佐治亚大学UAG GAG标出三卦a - 3′(意义)和5′-UUA标出GCU部件AUC AUA情事属实者,三大′(反义)。序列用于COX-1击倒5′gag卦GGA ACU UUG ACU a - 3′(意义)和5′uag UCA亚美大陆煤层气有限公司UUC CUA情事属实者颈- 3′(反义)。小干扰rna 5′的序列控制情事属实者ACG CCA CCA AUU煤炭u - 3′(意义)和5′ACG AAA UUG贵港市GCG UAG三大′(反义)。在进一步的实验之前,采用无血清细胞培养6 h为COX-1 siRNA cox - 2核或48 h。RhoA siRNA,原始264.7暂时细胞转染10 nM RhoA-targeting siRNA(意义:5′棉酚GUC亚美大陆煤层气有限公司标出UUC UGU CTT-3′;反义:5′广汽AGA AAU GCU部件佐治亚大学CUU CTT-3′)预拌6μ克/毫升Lipofectin(表达载体)。采用无血清细胞培养24小时后进一步实验。没有一个siRNAs对细胞生存能力有重要影响。

2.6。rt - pcr

从培养细胞总RNA分离使用试剂盒试剂(生活技术,卡尔斯巴德,CA)。核糖核酸的浓度和纯度是评估通过光谱法260和280海里。反转录进行60分钟42岁与3°Cμ使用M-MLV逆转录酶g的总RNA。cox - 2的水平COX-1, HGF, TGF -1 mRNA使用半定量rt - pcr试剂盒测定。使用的引物序列如下:mouse-specific COX-1(意义:5′GGT TGA GGC行动GGT GGA TG-3′;反义:5′AGA CAG ACC CGT猫CTC CA-3′), mouse-specific cox - 2(意义:5′ttc AAA AGA AGT GCT GGA AAA GGT-3′;反义5′手枪猫CTC TAC CTG AGT GTC TTT-3′), mouse-specific HGF(意义:5′gga CAA手枪TGT答CGT GG-3′;反义:5′gtt手枪CAA太极拳AGT GTA GC-3′), mouse-specific TGF -1(意义:5′ctt CAG CTC CAC AGA棉酚棉酚CTG颈- 3′;反义:5′cac AAT猫GTT GGA CAA CTG CTC颈- 3′),和mouse-specific肌动蛋白(意义:5′手枪广汽手枪ATC GCT GCG CTG-3′;反义5′手枪广汽手枪ATC GCT GCG CTG-3′)。互补脱氧核糖核酸变性5分钟在94°C,然后放大使用GeneAmp PCR系统2400 (PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)。PCR产品可视化与GelRed 1 - 2%琼脂糖凝胶染色。每个基因的相对荧光对比肌动蛋白被微密度分析。

2.7。ELISA和环境影响评价

文化上层清液收集2-24 h后刺激。铂族元素的含量₂和15 d-pgj₂在上层清液使用EIA试剂盒测定。HGF和TGF -1浓度由ELISA测定,根据制造商的指示。

2.8。免疫印迹分析

细胞细胞溶解在0.5% Triton x - 100裂解缓冲和蛋白质决定10% sds - page凝胶然后electrophoretically转移到硝化纤维膜。膜被封锁的1 h与Tris-buffered盐在室温(100毫米Tris-Cl, pH值7.5,150毫米氯化钠,和0.1% Tween-20)含5%脱脂牛奶,然后用各种孵化主要抗体在一夜之间在4°C和探测鼠标anti-mouse HRP-conjugated二级抗体。膜是使用一个增强化学发光系统开发(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)。

2.9。免疫细胞化学

cox - 2蛋白表达被免疫细胞化学评估264.7原始细胞。细胞用4%多聚甲醛固定,permeabilized Triton x - 100和彩色一夜之间在4°C兔多克隆抗体anti-COX-2 (1: 400;Abcam,英国剑桥)。随后,细胞被洗了三次PBS和孵化与荧光isothiocyanate-conjugated驴anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 500;杰克逊ImmunoResearch)。幻灯片是安装与DAPI Vectashield安装介质(向量实验室,Inc .)和检查使用共焦显微镜(LSM5帕斯卡;卡尔蔡司)配备一个过滤器设置激励在488和543海里。

2.10。统计分析

数据表示为均值±SEM。组间比较用学生的以及。被设定为一个统计意义值< 0.05。Excel 2007软件(微软、西雅图、佤邦)是用于统计分析。

3所示。结果

3.1。在体外的巨噬细胞对凋亡细胞诱发mRNA和cox - 2蛋白表达

之前评估cox - 2 /铂族元素之间的交互₂和HGF在巨噬细胞信号通路在体外暴露在凋亡细胞,我们确定cox - 2表达和铂族元素的特点₂在巨噬细胞生产。首先,评估COX-1和cox - 2 mRNA表达,半定量rt - pcr进行使用总RNA提取原始264.7细胞。在2 h后cox - 2 mRNA表达是不同的在体外暴露于凋亡Jurkat T细胞和逐渐增加到6 h,在12 h和略有下降,但在24 h cox - 2 mRNA水平下降(图1(一))。相比之下,可行Jurkat并不影响细胞cox - 2 mRNA表达在这个时期(图1 (b))。没有改变COX-1 mRNA表达24 h内凋亡或可行的Jurkat细胞(图1(一))。此外,cox - 2 mRNA表达也是衡量后暴露在不同的细胞类型。暴露于凋亡中性粒细胞,海拉细胞凋亡,凋亡胸腺细胞也诱导cox - 2 mRNA表达,但表达不同峰值的时间(数字1 (c)- - - - - -1 (e))。峰值增加cox - 2 mRNA表达观察到1、2和8 h后暴露于凋亡海拉细胞,中性粒细胞,分别和胸腺细胞。为什么cox - 2 mRNA表达不同的动力学没有明确解释在这个实验设置,但可能会导致不同的细胞类型。

我们分析cox - 2 mRNA表达的水平后暴露在紫外线照射过的凋亡和老年人类中性粒细胞凋亡的标准化这些凋亡细胞的数量后,由于年龄中性粒细胞凋亡细胞的比例较低相比,紫外线照射过的中性粒细胞(61%阳性凋亡中性粒细胞岁被膜联蛋白V染色阳性80%紫外线照射过的凋亡中性粒细胞)(16]。除了紫外线照射过的凋亡细胞,在人类中性粒细胞凋亡诱导显著cox - 2 mRNA表达(图1 (c))。这些研究表明,cox - 2 mRNA表达接触引起的凋亡细胞巨噬细胞是一种全球现象的独立的细胞类型和凋亡过程。

COX-1和cox - 2蛋白的表达是通过免疫印迹分析评估培养生264.7细胞溶解产物。cox - 2表达逐渐增加24 h后的凋亡Jurkat细胞,但是COX-1表达在这个时期(图并没有改变1 (f))。暴露在可行的细胞没有影响COX-1或cox - 2表达在此期间检查(图1 (g))。264.7预处理的原始细胞与放线菌素D或环己酰亚胺1 h与凋亡细胞刺激之前完全抑制cox - 2的表达,表明cox - 2 mRNA新创合成所需的蛋白表达(图1 (h))。共焦显微镜还演示了进步增加264.7原始细胞cox - 2蛋白从2到24 h后在体外暴露在凋亡细胞(图1(我))。

3.2。在体外的巨噬细胞对凋亡细胞诱发COX-2-Dependent铂族元素₂生产

铂族元素₂分泌,以环境影响评价,显著增加264.7原始细胞接触后凋亡Jurkat细胞(图2(一个))。铂族元素的显著增加₂生产后观察2 h在体外暴露在细胞凋亡和铂族元素₂生产继续增加24 h。确认由暴露在凋亡细胞cox - 2诱导介导增强的铂族元素₂264.7生产巨噬细胞,生细胞使用高度选择性cox - 2抑制剂ns - 398 (1 ~ 50μ米)或非选择性COX抑制剂吲哚美辛(10μ米)和孵化凋亡Jurkat T细胞2或24 h。ns - 398凋亡减少cell-induced铂族元素₂分泌剂量依赖性的方式(图2 (b))。吲哚美辛也抑制凋亡cell-induced铂族元素₂生产。这些数据表明,凋亡cell-induced铂族元素的增加₂264.7生产原始细胞cox - 2表达的主要来自感应。cox - 2的表达另一种产品的通路,15 d-pgj₂同样的增强(图2 (c))。凋亡cell-induced 15 d-pgj₂分泌也减少1μM ns - 398或10μM消炎痛(图2 (d))。这些数据表明,凋亡cell-induced铂族元素的增加₂和15 d-pgj₂264.7生产原始细胞cox - 2表达的主要来自感应。

3.3。增强cox - 2 /铂族元素₂信号通过与凋亡细胞介导HGF的Upregulation生产

公园等。4264.7)报道,增强HGF mRNA表达原始细胞凋亡细胞接触后的峰值在2 h和HGF蛋白质的分泌增加曝光后24小时。在目前的研究中,cox - 2在凋亡cell-induced HGF的表达也在这些时间点评估。实验使用药理抑制剂,如ns - 398,吲哚美辛,siRNAs针对cox - 2或COX-1。264.7原始细胞使用ns - 398或消炎痛,然后被培养与细胞凋亡Jurkat 2 h评估影响HGF mRNA表达和24小时来评估对HGF蛋白质生产的影响。ns - 398(1、10和50μM)和吲哚美辛(10μ米)完全抑制凋亡cell-induced HGF mRNA(数字3(一个)和3 (b))。完全抑制HGF蛋白表达也显示了治疗10到50μM ns - 398和10μM消炎痛(图3 (c))。

进一步研究cox - 2的贡献凋亡cell-induced HGF表达原始264.7细胞,使用COX-2-specific siRNA实验研究。负控制核不改变细胞刺激与凋亡细胞cox - 2蛋白水平。cox - 2蛋白表达在2和24小时完全抑制凋亡细胞暴露在细胞转染后cox - 2核,67年100%,分别为(数字3 (d)和3 (e)),但COX-1蛋白质水平不变,由免疫印迹分析。击倒的cox - 2基因阻止凋亡cell-induced HGF mRNA和蛋白表达,而不影响mRNA和蛋白表达的内源性控制,肌动蛋白(图3 (f)和3 (g))。相反,当与COX-1-specific siRNA COX-1表达式被转染沉默,HGF蛋白分泌是影响(数据3 (h)和3(我))。这些数据表明,只需要cox - 2诱导感应HGF mRNA和蛋白表达的原始细胞暴露于凋亡细胞在体外。

治疗生264.7细胞1或10纳米铂族元素₂导致增加HGF水平的蛋白质在培养基(图4(一))。然后,我们研究了铂族元素的参与₂在调停cox - 2在HGF诱导的影响。264.7原始细胞治疗铂族元素₂10与凋亡细胞的存在μM ns - 398。添加1或10纳米铂族元素₂完全恢复HGF mRNA表达抑制cox - 2抑制(图4 (b))。同样,HGF分泌减少了细胞治疗与ns - 398或转染COX-2-specific siRNA完全恢复了铂族元素₂(数据4 (c)和4 (d))。

大量的铂族元素₂特殊受体已确定,包括EP1 EP2, EP3和EP4 [17,18,据报道,巨噬细胞可以表达EP2和EP4 [19]。以确定哪些受体参与凋亡cell-induced铂族元素₂264.7细胞信号通路,生使用EP2受体拮抗剂ah - 6809或EP4受体拮抗剂gw - 627368 x 1 h在凋亡细胞补充道。EP2受体拮抗剂,但不是EP4受体拮抗剂阻断凋亡cell-induced HGF分泌(图4 (e))。当原始264.7与凋亡细胞被孵化Jurkat细胞在24小时内,动力学分析表明,铂族元素的上升₂之前的增加HGF生产(图4 (f))。关于抑制cox - 2的影响使用药物和基因的方法,这些结果表明cox - 2 /铂族元素₂/ EP2轴引起的凋亡细胞接触有助于移植HGF生产。

3.4。cox - 2 /铂族元素₂信号需要Upregulation HGF表达的小鼠腹腔巨噬细胞对凋亡细胞

除了原始264.7巨噬细胞,我们还研究了cox - 2 /铂族元素₂信号在原代细胞模型通过隔离居民从天真的小鼠腹膜巨噬细胞通过洗胃,然后孵化这些细胞凋亡或可行的Jurkat T细胞。凋亡细胞的刺激导致增加腹膜巨噬细胞cox - 2 mRNA和蛋白表达,而暴露在可行的细胞没有(数字5(一个)和5 (b))。没有COX-1 mRNA和蛋白表达的变化。HGF mRNA表达诱导凋亡细胞接触抑制通过预处理10μM ns - 398(图5 (c))。此外,抑制cox - 2 mRNA表达与ns - 398 (10μ米)和抑制EP2受体的ah - 6809 (10μ米)显著降低HGF分泌(图5 (d))。免疫印迹分析使用anti-HGF腹膜巨噬细胞溶菌产物链抗体表明细胞内蛋白表达也减少了治疗胶质瘤ns - 398或ah - 6809(图5 (e))。

需要确认cox - 2凋亡cell-induced HGF表达,腹膜巨噬细胞转染了小干扰rna或消极控制核COX-2-specific,之前的凋亡Jurkat细胞。凋亡cell-induced cox - 2蛋白表达下降了大约60%的细胞转染COX-2-specific核,但是COX-1蛋白质表达并没有改变(图5 (f))。原发性腹膜巨噬细胞凋亡细胞接触后,siRNA-mediated沉默cox - 2 mRNA表达显著地抑制HGF生产(图5 (g)264.7),在原始细胞。

3.5。激活介导HGF Upregulation cox - 2 /铂族元素₂在原始264.7和原发性腹膜巨噬细胞对凋亡细胞的接触

以前的报告表明cox - 2和铂族元素₂在成纤维细胞(下游介质HGF的表达9],它鼓励我们在调停HGF的影响进行调查在体外凋亡cell-induced cox - 2和铂族元素₂巨噬细胞表达。我们评估pha - 665752的影响,HGF c-Met受体的选择性抑制剂,cox - 2 mRNA和蛋白表达。在2和6 h后在体外暴露于凋亡Jurkat细胞cox - 2 mRNA表达显著地抑制了10μpha - 665752而不是1μM pha - 665752(图6(一))。cox - 2蛋白表达显著剂量依赖性地抑制由1到10μM pha - 665752在6 - 24小时之后在体外暴露在凋亡细胞(图6 (b))。同样,铂族元素的模式₂生产后抑制HGF信号并行的cox - 2蛋白的表达。在6 - 24小时之后在体外暴露在凋亡细胞,铂族元素₂分泌抑制由1到10μM pha - 665752剂量依赖性的方式(图6 (c))。确认HGF对铂族元素的影响₂264.7生产原始细胞,c-Met抑制性抗体也使用。这种抗体抑制铂族元素₂分泌约40%在24 h后暴露在凋亡细胞(图6 (d))。此外,10μpha - 665752下降部分HGF在24 h后生产在体外暴露于凋亡Jurkat细胞,暗示的可能性cox - 2 /铂族元素之间的正反馈循环₂和HGF信号通路(图6 (e))。

HGF的参与信号增强感应cox - 2和铂族元素₂表现在凋亡细胞接触也是主要的小鼠腹腔巨噬细胞,所示1或10μM pha - 665752抑制cox - 2 mRNA和蛋白表达以及铂族元素₂生产(数据7(一)- - - - - -7 (c))。pha - 665752的抑制效应对cox - 2 mRNA和蛋白表达以及铂族元素₂生产是一致的和存在剂量依赖的相关性,表明HGF部分介导cox - 2表达和铂族元素₂生产引起的凋亡细胞。

3.6。cox - 2 /铂族元素₂信号不需要Upregulation TGF -β如果巨噬细胞对凋亡细胞

TGF -表达式也诱导凋亡细胞(1与HGF[]但相反地平衡20.]。不同的监管系统被认为是参与诱导HGF和TGF -表达式。因此,我们研究是否cox - 2 /铂族元素₂TGF -信号功能不同1生产后凋亡细胞接触。ns - 398和吲哚美辛减少凋亡cell-induced TGF -(图264.7 1 mRNA表达原始细胞8(一个))。同样,TGF -1蛋白质分泌抑制cox - 2(图后并没有大幅下降8 (b))。COX-2-specific siRNA导致有限的抑制TGF -(图1分泌(减少24%)8 (c))。相比影响HGF的表达,抑制cox - 2抑制后的基础水平,减少TGF -1分泌并不显著。从天真的老鼠,居民腹膜巨噬细胞凋亡cell-induced TGF -1 mRNA和蛋白表达影响或只有最低限度减少药物抑制cox - 2和铂族元素₂信号使用10μM ns - 398和10μah - 6809(数据8 (d)和8 (e))。同样,COX-2-specific siRNA没有抑制诱导TGF -1 mRNA和蛋白表达在腹膜巨噬细胞(数字8 (f)和8 (g))。这些发现表明cox - 2 /铂族元素₂信号不需要凋亡cell-induced upregulation TGF -在巨噬细胞1 mRNA和蛋白表达。

数据从以前的和现在的研究提供证据表明cox - 2 /铂族元素₂和HGF激活不参与TGF -264.7生产如果原始细胞对凋亡细胞(11]。因此,我们怀疑cox - 2 /铂族元素₂和HGF激活调解TGF -264.7在刺激生产原始细胞凋亡细胞的反应。巨噬细胞治疗与1.0μg / mL有限合伙人;同时,凋亡细胞补充道。类似的结果Fadok和他的同事们(1),TGF -的水平通过LPS-stimulated巨噬细胞显著增强巨噬细胞对凋亡细胞与LPS-treated相比(图8 (h))。通过添加药理抑制剂的影响,包括ns - 398 ah - 6809,或pha - 665752, TGF -生产LPS-stimulated巨噬细胞显著抑制在24 h后暴露在凋亡细胞。这些数据表明,抗炎反应介导的凋亡细胞识别之后,至少在某种程度上,通过TGF -来自cox - 2 /铂族元素之间的积极的相声₂/ EP2和HGF / c-Met信号通路。

4所示。讨论

本研究增加了新兴观点,巨噬细胞识别凋亡细胞自身可以加强信号通路对更大的生产抗炎和antifibrotic介质以前馈方式。我们第一次表明cox - 2的表达(但不是COX-1) mRNA和蛋白增加264.7原始细胞以及原发性腹膜巨噬细胞暴露于凋亡Jurkat T细胞。cox - 2 mRNA感应也观察到当264.7原始细胞暴露在其他类型的凋亡细胞,如人类中性粒细胞,海拉上皮细胞、小鼠胸腺细胞,表明这种现象的普遍性独立的细胞类型。除了紫外线照射过的凋亡细胞,也在人类中性粒细胞凋亡诱导cox - 2 mRNA的表达。这些数据表明,巨噬细胞转变了自己的功能程序以应对死亡细胞和触发COX-2-dependent途径对免疫抑制和/或再生介质的生产。

各种动力自分泌介质来源于花生四烯酸代谢通过考克斯的行动。在这项研究中,我们专注于铂族元素₂合成的生理效应,包括限制免疫炎症反应和组织修复过程的控制。在体外曝光264.7原始细胞凋亡Jurkat细胞增加了铂族元素₂生产。此外,我们的时间进程研究显示快速感应和铂族元素连续增加₂生产24 h。先前的报道表明,铂族元素增加₂生产减少促炎类花生酸的表情,凝血恶烷B₂和白三烯C₄在人类monocyte-derived巨噬细胞对凋亡细胞接触表明选择性影响巨噬细胞的凋亡细胞吸收类二十烷酸代(1]。在目前的研究中,使用高选择性cox - 2抑制剂ns - 398,我们提供的证据表明,铂族元素₂生产可以增强巨噬细胞暴露于凋亡细胞,主要是通过诱导cox - 2的表达。

药物抑制cox - 2活性和siRNA-mediated击倒的cox - 2表达的减少凋亡cell-induced HGF mRNA和蛋白表达在原始264.7细胞和原发性腹膜巨噬细胞。然而,击倒COX-1表达并不影响HGF生产针对凋亡细胞接触。这些研究表明,cox - 2,但不是COX-1,专门参与HGF的生产。的铂族元素₂恢复HGF mRNA和蛋白表达,由药物抑制或抑制cox - 2的基因可拆卸的活动或表达式。这些数据提供了证据表明cox - 2在HGF诱导反应的影响凋亡细胞介导的直接影响COX-2-derived铂族元素₂巨噬细胞。此外,抑制铂族元素₂信号由一个EP2受体拮抗剂(但不是EP4拮抗剂)抑制凋亡cell-induced HGF生产。胶质瘤基因的转录和HGF生产是众所周知的刺激,增加环腺苷酸的物质,包括铂族元素₂(21,22]。因此可能COX-2-derived铂族元素₂诱发转录HGF生产由巨噬细胞对凋亡细胞通过环腺苷酸通路后同EP2受体的相互作用。然而,cox - 2 /铂族元素₂/ EP2轴不是唯一参与凋亡信号通路cell-induced HGF生产。一系列的实验在先前研究中强调的重要性RhoA /ρ激酶/ PI3K / Akt / MAPK(包括p38 MAPK、ERK和物)轴,这是需要upregulation HGF mRNA和蛋白表达的原始264.7细胞在凋亡细胞接触(8]。据说PI3K / Akt和MAPK通路也扮演一个角色的cox - 2表达,以应对各种细胞外刺激(23]。MAPK信号后,转录因子的激活,如E-26像蛋白1 (ELK-1),激活转录因子2 (ATF-2)统计,c-fos, c-Jun, AP-1 cox - 2启动子地区可以增加cox - 2表达(24]。我们的数据表明,RhoA没有参与凋亡cell-induced cox - 2表达,因为无论是击倒RhoA也与特定抑制剂抑制RhoA C3转移酶抑制cox - 2蛋白的生产(数据没有显示)。然而,PI3K / Akt的角色和MAPK通路cox - 2诱导的凋亡细胞需要进一步调查。

同样,另一个COX-2-derived PG的生产,15 d-pgj₂,也增强了在体外暴露的巨噬细胞凋亡Jurkat细胞。的确,在体外暴露的巨噬细胞凋亡细胞被证明能增加细胞内水平的铂族元素synthase1以及PGD合酶(2]。类似于铂族元素₂15 d-pgj₂分泌的反应通过诱导凋亡细胞主要是派生的cox - 2表达。此外,15 d-pgj₂通过过氧物酶体诱发HGF的表达在系膜细胞扩散者响应元件HGF通过激活启动子的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR) -。在这里,我们显示15 d-pgj₂全身HGF在巨噬细胞生产(数据没有显示)。因此,15 d-pgj₂也可能参与upregulation HGF表达的巨噬细胞暴露于凋亡细胞,尽管这种效应并没有检查在我们当前的研究。

许多prosurvival因素,包括HGF和cox - 2 /铂族元素₂,通常促进上皮和内皮细胞的生存,纤维母细胞静止,正常调节细胞外基质(25]。HGF信号通过满足受体移植cox - 2的表达在不同的细胞类型,包括成纤维细胞和上皮细胞(26],胶质瘤动物模型显示一个角色作为中介的cox - 2 /铂族元素₂signaling-driven antifibrosis在活的有机体内(9]。因此,我们调查的可能性之间的相声HGF和cox - 2 /铂族元素₂由264.7暴露原始细胞信号通路和腹膜巨噬细胞凋亡细胞在体外。c-Met抑制剂pha - 665752抑制cox - 2 mRNA的表达在巨噬细胞对凋亡细胞和蛋白质。同样,这种抑制剂减少铂族元素₂以剂量依赖性的方式生产。基于时间进程的数据研究,减少铂族元素₂264.7生产原始细胞是最小的24小时减少(~ 35%)和最大接触后6 h减少(~ 60%)凋亡细胞。使用另一个c-Met抑制剂,抑制性抗体,我们也发现了相似的对铂族元素的影响₂减少生产24小时(~ 40%)。这些数据表明,HGF / c-Met信号并不能充分发挥积极作用的合成铂族元素₂暴露于凋亡细胞。此外,pha - 665752也减少部分HGF后生产在体外暴露于凋亡Jurkat细胞。总的来说,我们的数据表明,HGF / c-Met和cox - 2 /铂族元素₂信号通路是通过积极的相互关联的相声刺激巨噬细胞凋亡细胞在24小时内。这种积极的反馈回路可以提供,至少在某种程度上,更大的铂族元素₂HGF在巨噬细胞,导致抗炎和antifibrotic活动相互作用诱导的凋亡细胞(12]。然而,其他介质可能会参与其中,可能参与cox - 2和铂族元素₂表达式通过不同机制自c-Met抑制剂抑制部分中铂族元素₂HGF生产。在Freire-de-Lima和他的同事们的研究2),花生四烯酸的释放,cox - 2蛋白表达和铂族元素₂生产明显依赖于TGF -生产对凋亡细胞。实际上,巨噬细胞表达截断TGF -受体没有显示upregulation cox - 2和铂族元素₂凋亡细胞的反应。因此,尽管这里没有直接探索,它似乎是合理的假设TGF -发布导致更大的cox - 2和铂族元素₂表达,导致HGF生产。

尽管TGF -已被证明在抗炎和anti-immunogenic扮演关键角色对凋亡细胞间隙,它经常充当抗增殖和profibrotic代理人。相比之下,胶质瘤是一种重要的组织修复的分子。外源性HGF加速组织修复管理在几个器官急性损伤或缺血后(27,28]。TGF -是一个强大的负调节HGF的表达(29日],HGF似乎反对那些TGF -生物活动通过不同的机制(26]。值得注意的是,我们的数据表明cox - 2 /铂族元素₂信号是参与转录HGF的但不是TGF -1如果巨噬细胞对凋亡细胞。此外,使用anti-c-Met阻止抗体从以前的研究数据显示,HGF激活没有参与TGF -264.7生产如果原始细胞对凋亡细胞(11]。然而,在LPS-stimulated巨噬细胞,我们在体外研究使用药理抑制剂提供证据表明cox - 2 /铂族元素₂和HGF信号通路参与增强TGF -生产对凋亡细胞。因此,在这个有限的背景下,我们看到的可能性,抗炎反应介导的凋亡细胞识别之后,至少在某种程度上,通过TGF -来自cox - 2 /铂族元素之间的积极的相声₂/ EP2和HGF / c-Met炎性病变的信号通路。另一方面,长时间抑制cox - 2 /铂族元素₂或HGF信号通路逆转减少TGF -1生产和后肺组织羟脯氨酸含量在活的有机体内暴露在凋亡细胞纤维化的后期阶段(12]。因此,cox - 2 /铂族元素₂和HGF信号通路可能提供一个重要的额外控制之间的平衡HGF和TGF -,支持antifibrotic efferocytosis系统的影响。

总之,本研究的研究结果揭示了小说cox - 2 /铂族元素的函数₂在巨噬细胞暴露于凋亡细胞/ EP2信号在体外结果在增强HGF的表达。此外,cox - 2 /铂族元素₂TGF -路径显示不同的监管效果1,HGF激活了调解cox - 2和铂族元素₂表达接触引起的凋亡细胞在体外。因此,很可能cox - 2 /铂族元素的能力₂/ EP2信号促进HGF的合成是一个积极的反馈回路,导致巨噬细胞cox - 2和铂族元素的放大₂表达式(图9)。cox - 2 /铂族元素之间的这种积极的相声机制₂/ EP2和HGF / c-Met信号通路可能导致凋亡细胞识别的抗炎和antifibrotic后果。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

这项工作是国家研究基金会赠款支持(NRF)由韩国政府(MSIP) Jihee李康(批准号2010 - 0029353]。