文摘

Glucagon-like peptide-1 (GLP-1)是一个gut-derived肠促胰岛素激素,已经被证明可以改善2型糖尿病的葡萄糖稳态。GLP-1的生物效应是由其特定的受体GLP-1R表达在一个广泛的组织,在那里负责的extra-pancreatic GLP-1的影响。由于视网膜色素上皮(RPE),形成外层视网膜屏障,有一个关键的角色在保护糖尿病性视网膜病变(DR),我们调查了潜在的表达和功能的GLP-1R RPE细胞。ARPE-19细胞培养在DMEM / F12补充10%的边后卫。GLP-1R是评估在mRNA的表达和蛋白质的水平。然后,激活postreceptor胞内信号转导途径(细胞外signal-regulated激酶1和2 (ERK1/2)和蛋白激酶B (PKB))被评估免疫印迹在正常细胞或沉默的GLP-1R 10 nmol / L GLP-1的存在与否。潜在的胞内信号通路之间的连接由GLP-1刺激进行孵化前细胞增殖蛋白激酶的激酶药理抑制剂(MEK) 1/2, phosphatydilinositol-3kinase (PI3K)和表皮生长因子受体(EGFR)。结果表明,GLP1R ARPE-19 mRNA和蛋白表达水平的细胞。刺激和GLP-1强烈激活PKB ERK1/2磷酸化直到40分钟的曝光。GLP-1-mediated激酶的活化依赖于上游PI3K和表皮生长因子受体的激活。 Finally, treatment with GLP-1 did not affect the spontaneous release of VEGF-A from ARPE-19 cells. In conclusion, this paper showed that the presence of functional GLP-1R is expressed in RPE cells. These data might represent the rationale to further investigate the potential direct beneficial effects of GLP-1 treatment against DR.

1。介绍

Glucagon-like peptide-1 (GLP-1)是一种强有力的glucoincretin激素释放肠L-cells以应对营养摄入(1,2]。这种分子被证明不仅改善葡萄糖稳态其余glucose-dependent胰岛素释放(主要动作),但也抑制胰高糖素分泌的功能障碍和食欲增加β电池质量。最近,GLP-1被证明移植胰岛素原基因转录和胰岛素的分泌也在胰岛细胞暴露于葡萄糖,但受伤的刺激与其他介质(3- - - - - -7]。这些保护作用被证明是由GLP-1绑定到其同源的高亲和性受体(GLP-1R),糖基化的蛋白G-protein-coupled受体超家族的成员(8]。GLP-1绑定GLP-1R激活各种细胞内信号通路,主要确定在胰岛细胞(9- - - - - -11]。然而,最近的证据显示,GLP-1R也表达了在外围组织,包括中央和周围神经系统、心脏、肾、肺、胃肠道(12),这表明GLP-1可能直接保护不仅在葡萄糖体内平衡,还在周边器官糖尿病并发症。最近,治疗exedin-4 (GLP-1R的长效兴奋剂)可以减少糖尿病性视网膜病变的发展((博士),最常见的糖尿病并发症之一)在糖尿病动物模型,(13- - - - - -15]。博士被认为是神经退行性疾病,表现为神经细胞的损失与视网膜微脉管系统的逐步改变,血管通透性增加,和病理眼内新生血管形成16- - - - - -18]。博士的发病机理与变化相关联的活动视网膜色素上皮(RPE),高度专业化的单层细胞位于视网膜光感受器和脉络膜的脉管系统(19,20.]。自RPE细胞在视网膜内稳态中发挥核心作用形成外层视网膜屏障和支持光感受器的功能,在目前的研究中,我们调查是否glp - 1在RPE / GLP1R轴是表达和功能细胞。

2。方法

2.1。细胞培养和实验条件

人类细胞系ARPE-19(美式文化收藏、马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)是生长在一个1:1的比例DMEM / F12 (Cambrex生物科学,Walkersville,医学博士,美国)与10%的边后卫,补充2更易与谷酰胺(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)和抗生素青霉素G (100 U /毫升和100年μg / mL硫酸链霉素)(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)。细胞被维持在37°C调湿有限公司5%2空气孵化器。细胞培养基是每2天更换一次。细胞生长汇合,删除与trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich、米兰、意大利),然后在多井菜种子的刺激。根据最近的出版物(3,4的10 nmol / L),剂量GLP-1(美国AnaSpec, Fremont, CA)被选中,在这项研究中使用。这个浓度对应于一个最大有效浓度,广泛用于文学和血浆浓度的肠促胰岛素(后碳水化合物的食物8,21,22]。

2.2。细胞生存能力

为了评估细胞增殖,ARPE-19细胞被镀在96 -孔板(2×104细胞/)和培养24,72,或96小时10 nmol / L GLP-1的存在与否。可行的细胞被发现使用细胞效价96水一个解细胞增殖测定(Promega、米兰、意大利),因此制造商的指令,如前所述[23]。

2.3。反向Transcriptase-Polymerase连锁反应(rt - pcr)

总RNA提取ARPE-19细胞培养与单独控制介质RNeasy工具包(试剂盒开发。意大利米兰)根据制造商的指示。RNA浓度决心spectrophotometrically。一微克的RNA是reverse-transcripted cDNA使用GoScript逆转录系统(意大利PROMEGA,意大利米兰),然后通过PCR放大。的引物对人类GLP1R从试剂盒波斯公司购买。、米兰、意大利和PCR结果产品是98个基点。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为内部控制。GAPDH被设计根据他们的信使rna序列的引物从基因库(意义:5′tga gg TCG GAG柠檬酸ACG手枪TTG GT-3′;反义:5′猫GTG GGC猫呕吐GTC CAC CAC-3′)。结果PCR产品是558个基点。互补脱氧核糖核酸是放大使用PCR反应混合液(意大利PROMEGA,意大利米兰),每个周期组成的30年代在94°C, 60年代在62°C放大GLP1R GAPDH,最终扩展步骤10分钟在72°C。所有的样品在一个线性放大放大范围建立使用串行cDNA稀释和不同数量的周期(GAPDH和GLP1R 37周期)。 PCR products were electrophoresed onto a 1.5% agarose gel containing ethidium bromide and visualized under UV light.

2.4。RNA沉默

GLP-1R siRNA实验池4 prevalidated siRNA设计人类GLP-1R使用(Dharmacon Accell si RNA试剂,热科学、米兰、意大利)。ARPE-19细胞被播种在12-well盘子在没有抗生素的培养基和生长在一夜之间融合达到60 - 80%。混合后的第二天,Accell交付(Dharmacon Accell si RNA试剂,热科学、米兰、意大利)包含核复合体制备根据制造商的指示。细胞转染GLP-1R siRNA或控制核(对应于一个不属预定目标的23-nucleotide核设计为负控制)。转染细胞混合物被放在了72 h,然后GLP-1R蛋白质水平被免疫印迹检测。

2.5。免疫印迹分析

治疗后,ARPE-19细胞细胞溶解在里帕缓冲区(50更易与L三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7.5,150更易与L氯化钠,NP40 1%, 0.1% SDS、补充与蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒),和蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质化验设备。总细胞溶解产物(30毫克)在sds - page分离和转移到硝基。溶菌产物从胰腺胰岛素分泌细胞行HIT-T15被用作积极控制。过滤器被封锁在5% BSA和孵化一夜之间在4°C主要anti-GLP1R的特定抗体,或β肌动蛋白(从圣克鲁斯生物技术有限公司圣克鲁斯,CA,美国)。二次特定的辣根过氧化物酶与抗体被添加在室温下1 h。结合抗体检测使用一个增强化学发光照明系统(Luminata干白、微孔Billerica,妈,美国),根据制造商的指示。乐队感兴趣的被测密度术使用美国国立卫生研究院项目ImageJ量化。验证等于加载的蛋白质,膜被再次reblocked, reprobed检测β肌动蛋白。

评价细胞内信号通路可能被GLP-1激活,细胞无血清培养系统在24小时和在没有或存在10 nmol / L GLP-1不同时间点(40分钟)。细胞细胞溶解和总蛋白提取用于免疫印迹分析。在平行实验中,细胞与药理prestimulated激酶抑制剂(10μmol / l U0126对增殖蛋白激酶(MEK) 1/2;50μmol / l LY294002, Phosphatidylinositol-3kinase [PI3K]) 10分钟;或0.25μmol / l Tyrphostin AG 1478表皮生长因子受体(EGFR) 30分钟。然后,细胞被刺激的存在与否10 nmol / L GLP-1 10分钟。孵化后,细胞细胞溶解,溶解产物分离与特定的抗体通过sds - page和免疫印迹anti-phospho-p44/42 MAPK thr202 / tyr204 (ERK1/2)和磷蛋白激酶B Ser 473 (PKB)(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国)。分别膜剥离和reprobed anti-ERK1/2或PKB抗体(美国细胞信号技术,贝弗利,MA)规范化总蛋白质含量的屁股。

2.6。血管内皮细胞Growth-Activated (VEGF-A)分泌

ARPE-19细胞培养24小时的10 nmol / L GLP-1的存在与否。量化VEGF-A分泌,条件媒体收集和储存在−80°C到化验。细胞被洗两次PBS和细胞溶解里帕缓冲区,和溶菌产物储存在−80°C。溶菌产物蛋白质含量是由BCA蛋白质分析工具包(皮尔斯,罗克福德,医学博士,美国)根据制造商的指示。VEGF-A分泌是评估ELISA (Bender MedSystem,维也纳,奥地利)。VEGF-A浓度计算的总蛋白浓度的标准曲线和归一化各自的溶解产物。

2.7。统计分析

代表至少3的实验结果。所有与GraphPad Prism 4.0软件进行分析(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。数据被表示为均值±SE,然后使用学生的分析 以及。 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。GLP-1R ARPE-19细胞上表达

GLP-1R ARPE-19细胞上的表达是通过rt - pcr和免疫印迹分析。一群大约100个基点是放大通过rt - pcr证实mRNA的表达GLP-1R ARPE-19细胞(图所示1(一))。验证转导mRNA的蛋白质,与特定的抗体anti-GLP1R进行免疫印迹分析。免疫印迹显示well-detectable乐队60至70年从ARPE-19细胞胞质蛋白提取kDaltons乐队所示类似的积极控制(HIT-T15蛋白溶菌产物)(图1 (b))。

(一)
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(b)
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图1
GLP-1R ARPE-19细胞中表达。(一)rt - pcr显示GLP-1R mRNA表达人类ARPE-19细胞培养在标准的媒介。预期的rt - pcr产品尺寸是98个基点。3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是利用作为外部控制。琼脂糖凝胶的代表三个不同的实验。(b)。代表人类GLP-1R蛋白免疫印迹分析水平(~65 kD)表明GLP-1R ARPE-19细胞蛋白质表达。溶菌产物从胰腺胰岛素分泌细胞行HIT-T15被用作一个积极的控制。免疫印迹分析代表三个不同的实验。
3.2。GLP-1通过跨膜受体激活细胞内途径定义GLP-1 ARPE-19细胞

我们首先研究了与GLP-1刺激是否会影响期间ARPE-19细胞生存能力在体外协议。细胞培养的存在与否10 nmol / L GLP-1 24, 72或96个小时。没有区别的ARPE-19细胞增殖率显示标准介质和GLP-1之间在任何时间点调查(图2)。


图2
GLP-1并不影响ARPE-19细胞生存能力。细胞培养24、72或96个小时没有(CTR,白色的酒吧)或存在10 nmol / L GLP-1 (GPL-1,黑人酒吧)。细胞增殖率由比色方法基于甲瓒四唑化合物MTS的产物。结果显示吸光度CTR相比的百分比。数据表示为均值±SE 3个独立的实验。

然后我们调查了势函数的GLP-1R ARPE-19细胞。我们关注下游postreceptor细胞内信号途径的激活触发与其同源GLP-1R GLP-1绑定的。孵化GLP-1增加ERK1/2和PKB的磷酸化水平相比,控制细胞已经10分钟后(数字3(一个)和3 (b))。这些对ERK1/2和PKB磷酸化的影响依然显著增加控制媒介相比甚至40分钟的孵化(数字3(一个)和3 (b))。证明GLP-1激活细胞内激酶通过其同源受体,我们下调GLP1R通过核表达。这个方法显著降低GLP1R蛋白质含量比炒核控制数据4(一)和4 (b))。特别是,转染导致超过60%的降价GLP-1R(图4 (b))。在GLP1R沉默细胞,治疗GLP-1未能使磷酸化PKB和ERK1/2(数字4(一),4 (c)- - - - - -4 (e))。另一方面,在小干扰rna控制打乱,GLP-1-induced PKB, ERK1/2磷酸化维护(数字4(一),4 (c)- - - - - -4 (e))。

(一)
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(b)
(b)
图3
GLP-1 PKB细胞内信号蛋白磷酸化,ERK1/2。ARPE-19细胞无血清培养系统在24小时和刺激控制介质(0′)或10,20,并与10 nmol / L GLP-1 40分钟。然后,细胞被磷酸化和总蛋白的细胞溶解和测试PKB (a)和ERK1/2 (b)上面板:代表免疫印迹分析三个不同的实验。较低的面板:免疫印迹乐队的微。数据表示为均值±SE褶皱感应相对于总蛋白( )。 和 和时间0′。
(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
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图4
GLP-1R沉默废除GLP-1-induced信号通路激活。ARPE-19细胞转染与炒(scr)核控制或GLP-1R siRNA和处理10 nmol / L GLP-1 10分钟。细胞和抗体anti-GLP-1R被细胞溶解和测试,anti-phPKB或anti-phERK1/2。膜被剥夺,reprobed分别与反β肌动蛋白、anti-PKB或antiERK1/2-antibodies。(一)代表免疫印迹分析三个不同的实验。(b)量化微的免疫印迹GLP-1R的乐队。数据表示为±SE褶皱感应相对β肌动蛋白( )。 和小干扰rna CTR可控硅。(c)量化微的免疫印迹phPKB的乐队。数据表示为均值±SE褶皱感应相对于总PKB ( )。 与各自的点击率。(d)量化微的免疫印迹phERK1的乐队。数据表示为均值±SE褶皱感应相对于总ERK1 ( )。 和点击率。(e)量化微的免疫印迹phERK2的乐队。数据表示为均值±SE褶皱感应相对于总ERK2 ( )。 和点击率。

然后PKB之间潜在的联系,ERK1/2磷酸化途径。像预期的那样(因为PI3K是PKB的直接上游激活在几个细胞模型)(24),用药物抑制PI3K的LY294002废除GLP-1-induced PKB的磷酸化(数字5(一)和5(b))。不影响GLP-1-mediated PKB的磷酸化时观察到的细胞preincubated选择性MEK1/2抑制剂U0126(数字5(一)和5(b))。另一方面,GLP-1-induced ERK1/2磷酸化抑制了预培养的选择性抑制剂MEK1/2(上游激活ERK1/2)(数据6(一)-6(c))和PI3K抑制剂LY294002(数字6(一)-6(c)),这表明PI3K激活还需要ERK1/2 GLP-1-induced激活。据报道以来在其他模型GLP-1R可以通过transactivation激活PI3K的表皮生长因子受体(EGFR) [25,26),我们还与AG1478 preincubated细胞(选择性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂)。预处理与AG1478与抑制下游的磷酸化ERK1/2和PKB GLP-1(人物的存在5和6)。


图5
药物抑制PI3K废除GLP-1-induced PKB的激活。ARPE-19细胞无血清培养系统在24小时和刺激10分钟10 nmol / L的存在与否GLP-1 MEK1/2抑制剂U0126 (10μmol / l)或PI3K抑制剂LY294002 (50μmol / l),或表皮生长因子受体抑制剂AG) 1478 (0.25μmol / l)。(a)代表免疫印迹分析PKB磷酸化(phPKB)和总蛋白。(b)量化微的免疫印迹。数据表示为均值±SE褶皱感应相对于总PKB ( )。 ; 与细胞刺激与控制中。

图6
药物抑制PI3K阻塞GLP-1-induced ERK1/2激活。ARPE-19细胞无血清培养系统在24小时和刺激10分钟10 nmol / L的存在与否GLP-1 MEK1/2抑制剂U0126 (10μmol / l)或PI3K抑制剂LY294002 (50μmol / l),或表皮生长因子受体抑制剂AG) 1478 (0.25μmol / l)。(一)代表免疫印迹分析ERK 1/2磷酸化(phERK1/2)和总蛋白。(b)量化微的免疫印迹phERK1的乐队。数据表示为均值±SE褶皱感应相对于总ERK1 ( )。 与细胞刺激与控制中。(c)量化微的免疫印迹phERK2的乐队。数据表示为均值±SE褶皱感应相对于总ERK2 ( )。 与细胞刺激与控制中。
3.3。GLP-1并不影响自发释放VEGF-A ARPE-19细胞

RPE已被证明的主要来源有争议的调解人VEGF-A眼内(27,28]。考虑到与GLP-1受体受体激动剂治疗是改善视网膜显示糖尿病并发症在动物模型(14,15),我们调查了如果这个分子可能增加自发释放VEGF-A ARPE-19细胞。孵化GLP-1和标准介质之间无显著差异(图所示7)。


图7
VEGF-A GLP-1并不影响分泌。ARPE-19细胞培养的24 h 10 nmol / L GLP-1的存在与否。条件媒体收集,在上层清液和VEGF-A水平评估ELISA。VEGF-A浓度计算的总蛋白浓度的标准曲线和归一化各自的溶解产物。三个独立实验的结果代表(均值±SE)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们表明,GLP-1R RPE细胞中表达。一个新兴的2型糖尿病的临床兴趣管理GLP-1已被证明。这种激素可以预防糖尿病及其并发症的改善β细胞病理生理学和可能在周边器官(包括眼睛和肾脏)糖尿病并发症的目标(12]。GLP-1R示范的RPE细胞可能提出一个新颖的保护作用glp - 1在糖尿病的常见并发症,也如这糖尿病视网膜改变博士是现在被认为是一个眼睛的神经退行性疾病,blood-retina屏障的破坏和损失的神经细胞(16- - - - - -18]。最近的研究表明glp - 1在视网膜神经层受体的存在,exenatide(长效稳定类似GLP-1)可以防止细胞和维护正常的损失在糖尿病大鼠视网膜厚度(14,15]。以前的免疫组织化学研究表明,GLP-1R表达主要是在视网膜内14]。在这里,我们表明,视网膜色素上皮GLP-1R也表示,构成外blood-retinal障碍,因此对视网膜的完整性至关重要(29日]。

本研究的另一个主要结果是由证明GLP-1R ARPE-19细胞内信号转导GLP-1-mediated的能力。据报道,绑定的glp - 1在激活其同源受体导致细胞内各种不同信号通路的子集(9- - - - - -11(主要是胰岛细胞)。特别是GLP-1-triggered激活PI3K的证明是由多个集成的途径,施加不同的β细胞功能,如生存,新陈代谢,航道治理(21,30.- - - - - -32]。GLP-1-mediated PI3K的激活导致的直接下游磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶PKBβ细胞增殖和生存的关键(33,34]。类似于PKB的磷酸化ERK1/2回应glp - 1在几个治疗已经证明胰岛瘤细胞系和人类胰岛11,35,36]。在这项研究中,我们发现通过同源受体GLP-1 GLP-1R显著增加下游PKB和ERK1/2磷酸化ARPE-19细胞。发现重要的是,ERK1/2磷酸化和PKB GLP-1和10分钟后仍然升高甚至在40分钟。进一步确定GLP-1R之间的潜在联系,这些下游细胞内途径,我们进行预处理细胞的选择性抑制剂一些激酶直接激活ERK1/2和PKB,分别在其他细胞类型(37,38]。结果表明,抑制PI3K完全废除GLP-1-induced PKB的磷酸化和ERK1/2,表明激活PI3K的上游激酶。另一方面,MEK1/2并不影响PKB的抑制,但只有ERK1/2(预期),表明GLP-1可能引发通过其受体GLP-1R PI3K-dependent细胞内途径。此外,在其他细胞系(因此与先前的报道25,26),随之而来的抑制表皮生长因子受体阻止了磷酸化ERK1/2和PKB GLP-1引起的,表明GLP-1R信号可能涉及的transactivation EGFR。考虑到这些通路的激活GLP-1往往是增加受伤的细胞存活率(25,26),在我们的研究中我们没有观察细胞增殖的差异,这表明glp - 1在健康的RPE细胞增殖率没有增加。最后,我们发现GLP-1未能增加防护自发VEGF-A分泌进一步支持了假设GLP-1不会改变ARPE-19细胞的生理功能。

这项研究有一些局限性:首先我们的实验进行在体外使用一个人类细胞系。这一方面大大削弱我们的结果的相关性。然而,这项研究可能代表第一个示范和理由的额外研究调查的直接作用GLP-1博士/ GLP-1R轴,防止第二个限制是由有限数量的视网膜细胞功能研究。本研究的目的是证明存在功能性GLP-1R ARPE-19细胞。因此,我们的结果是初步的探索不同的潜在GLP-1-mediated活动视网膜细胞。

5。结论

总之,我们的数据表明,GLP-1R ARPE-19细胞上表达,这种受体直接由GLP-1激活。底层信号通路包括PI3K和EGFR-mediated激活下游PKB和ERK1/2。知识RPE细胞可能会响应GLP-1建议GLP-1 / GLP-1R轴可能有助于防止RPE细胞功能障碍,因此,这些结果代表小说博士证据的未知的机制长效受体激动剂GLP-1R(临床管理糖尿病患者)可能直接从相关的保护和常见的糖尿病并发症如博士。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

这项工作是由瑞士国家科学基金会支持格兰特(没有。32003 f . Montecucco博士b-134963/1)。