文摘
激活的n -甲基- d受体(NMDAR)在痛觉过敏的发展至关重要。Overactivation这种受体释放超氧化物和一氧化氮,反过来,形成过氧亚硝基(PN)。所有这些事件都与神经毒性有关。谷氨酸受体和酶参与处理pathway-specifically NMDARs,谷氨酸转运体,谷氨酰胺合成酶(GS)——关键酪氨酸残基的硝化过程的目标造成后续功能修改。我们的研究结果表明,热痛觉过敏引起鞘内NMDA管理与脊髓硝化GluN1 GluN2B受体亚基,GS,通常将谷氨酸转化为无毒谷氨酰胺和谷氨酸转运体GLT1。鞘内注射FeTM-4-PyP PN分解的催化剂5 +防止硝化和整体抑制NMDA-mediated热痛觉过敏。我们的研究支持了假设硝化的关键蛋白质参与谷氨酸的规定所使用的传输是一个关键途径PN调解NMDA-mediated热痛觉过敏的开发和维护。更广泛的含义我们发现强化了自由基的观念可能导致各种形式的痛苦事件和重要性的新药物的开发工具,可以直接调节谷氨酸传输没有阻碍其行动。
1。介绍
NMDARs在脊髓背侧角发挥重要作用在疼痛的传播和修改(1,2]。Glutamate-mediated激活NMDAR的基本发展的痛觉过敏的反应与各种病因相关的痛苦(2- - - - - -4]。因此,痛觉过敏的反应中发现实验模型的急性炎症和神经性疼痛被鞘内交付NMDAR拮抗剂(2,3,5- - - - - -10]。
我们有报道称NMDAR激活释放超氧化物(所以)进而是至关重要的中介NMDA-mediated痛觉过敏(2,11]。的关键机制在维护和维持高水平的,所以网站的行动是硝化内生锰超氧化物歧化酶(MnSOD),酶通常会严格控制所以[12]。硝化和随后的失活的MnSOD由PN (13- - - - - -16),一个产品的反应与一氧化氮(NO) (17]。NMDAR激活支持PN的积累形成所以2,11,18- - - - - -20.和不同时21- - - - - -23]。此外,Muscoli和同事证明如此折中硝化和脊髓MnSOD失活是小说NMDA-mediated脊髓痛觉过敏,因此中枢敏化的途径,因为它有助于保持高水平的,这反过来又导致维护疼痛的信号(2,11]。本研究的目标是阐明如何高浓度的所以保持在应对NMDA疼痛的信号。为此,我们专注于潜在的硝化作用的关键蛋白质参与谷氨酸传播,即NMDAR,谷氨酸转运体,谷氨酰胺合成酶(GS)。cDNA克隆表明NMDAR是由几个NMDAR子单元。的coexpression GluN1各种GluN2子单元需要一个功能齐全的离子通道受体和GluN1 GluN2不同亚基的表达导致通道具有不同的药理和生理特性定义NMDAR异质性(24,25]。PN交互的NMDAR导致硝化酪氨酸残基上NMDAR子单元。这是一个不可逆的反应,导致突触电流的恒定的增强作用和钙流入,最终会引起(26- - - - - -28]。它已经表明,硝化酪氨酸残基的蛋白质能充分提高改性蛋白质的蛋白酶降解在活的有机体内(29日),也可以是一个关键事件的营业额的受体。鞘内政府NMDA谷氨酸释放的突触间隙(30.- - - - - -32]。因此,热痛觉过敏,为了应对NMDA鞘内注射,结果的持久状态NMDAR由于高水平的激活谷氨酸突触间隙中(3]。一旦释放,谷氨酸不是由细胞外代谢酶,但通过谷氨酸转运蛋白被细胞吸收。GLT1,选择性神经胶质细胞,具有细胞内域富含氨基酸残基容易氧化半胱氨酸、酪氨酸等(33,34]。PN硝酸盐谷氨酸转运体降低其能力移除谷氨酸突触空间,导致神经毒素浓度的神经递质(2,35- - - - - -37]。一旦拍摄成胶质细胞谷氨酸,是转化为无毒的glia-specific谷氨酰胺酶GS (38,39]。Excitotoxic刺激似乎发生在大脑组织灭活能力GS导致降低astroglial细胞调节谷氨酸通过GS活性[营业额40- - - - - -42]。抑制GS活动增加中枢敏化与炎症痛觉过敏,神经性疼痛,阿片类药物耐受(37,43- - - - - -45]。
谷氨酸途径蛋白质键可以通过PN硝化酪氨酸残基:转译后的修改的最终结果的蛋白质参与谷氨酸的严格监管体内平衡,如NMDAR GLT-1, GS提供一个统一的链接在信号事件潜在中枢敏感化。中枢敏感化是一种长期的中枢神经系统的可塑性。持续激活的主要感觉纤维提供背角能引起持久放电幅值的增加初级传入神经突触(46]。中枢敏感化是一种兴奋性的脊髓背角神经元传递痛觉由于增加响应性超阈值的和/或疼痛的信号的阈值降低;这体现行为作为有毒(痛觉过敏)和nonnoxious过敏症(异常性疼痛)刺激。这个状态是由于生理、生化和分子改变在脊髓和脊椎上的疼痛的中枢神经系统调节中心,部分原因是慢性疼痛病理47]。
我们的研究结果表明,NMDA-induced PN生产维护中枢敏感化和痛觉过敏通过调节谷氨酸传输转译后的硝化NMDAR子单元,GLT1和GS。
2。方法
2.1。动物
男性Sprague-Dawley老鼠(225 - 250 g,查尔斯河)这些研究用于购买了鞘内植入套管(32计,聚氨酯)。鞘内导管,简单地说,动物的头向前弯曲立体定位器,一个皮肤切口是在头部和颈部的后面,和池状的膜被锋利的解剖暴露。膜是轻轻刺破的小贴士# 15手术刀叶片,和长7.5厘米PE-10导管的远端是通过开放池状的膜,进入囊内的空间。导管是松散缝合皮下组织,让动物和访问外部的近端端实验者,然后皮肤近似使用4 - 0可吸收缝合线(Ethicon)。所有的动物被安置和关心依照大学的指导方针大希腊,Catanzaro,意大利、意大利以及遵守法规保护动物用于实验和其他科学(D.M. 116192),和欧洲经济共同体的规定。老鼠维持在一个被控制的环境中(12 h光/暗周期,室温下,50 - 60%相对湿度)。所有的实验都发生在上午7点到10点之间光周期在一个安静的房间。
2.2。测量的热痛觉过敏
痛觉过敏的反应热量测定哈格里夫斯所描述的方法(48),20秒的中断延迟是用来防止组织损伤动物停止响应。动物被允许适应30分钟在透明玻璃上的树脂玻璃外壳板测试在一个安静的房间。移动单元组成的高强度投影仪灯泡是能够提供一个直接热刺激个体后爪下室。左翼和右翼的戒断潜伏期爪子决心最近的0.1秒一个电子时钟电路和热电偶。如果动物20秒内未能回应,测试终止。每一个点代表了变化(sec)撤军延迟((延迟撤军的左爪+延迟撤军)/ 2)在每个时间点。结果表示为爪撤军延迟(sec)。热测试后,所有的动物都牺牲和腰椎脊髓(哈佛块从L4)被移除,立即在液态氮冷冻,是随机分布进行进一步分析。
2.3。NMDA-Induced痛觉过敏
六组。
组1。FeTM-4-PyP5 +工具+ NMDA车辆:动物收到一个鞘内注射(10μL 10紧随其后μL盐水冲洗)紧随其后的鞘内注射10μL盐水后15分钟紧随其后的是10μL盐水冲洗。
组2。FeTM-4-PyP5 + + NMDA车辆(FeTM-4-PyP5 +测试最高剂量,2 nmol):动物()收到一个鞘内注射FeTM-4-PyP5 + (2 nmol) 10μL 10紧随其后μL冲洗)紧随其后的鞘内注射10μL盐水后15分钟紧随其后的是10μL盐水冲洗。
组3。FeTM-4-PyP5 +工具+门冬氨酸:动物收到一个鞘内注射(10μL 10紧随其后μL的鞘内注射生理盐水冲洗)跟着NMDA (2 nmol 10μL, (49)15分钟后,随后10μL盐水冲洗。
组4 - 6。FeTM-4-PyP5 + + NMDA (FeTM-4-PyP5 +测试3剂量):动物收到了鞘内注射0.5,1和2 nmol (10μL 10紧随其后μL冲洗,每个剂量)FeTM-4-PyP5 +紧随其后的鞘内注射NMDA (2 nmol 10μL)后15分钟,其次是10μL盐水冲洗。
热刺激应用分别向右和左后爪和爪子延迟撤军之前被立即评估和随后在10,20,40分钟后NMDA注入。结果表示为爪撤军延迟(秒);减少爪子撤军延迟相对于基线是痛觉过敏的象征。测定镇痛效应是上午7点到10点之间评估(光周期)。在行为研究中,一个人准备药物,另,盲目的药物和剂量,跑行为观察。整个研究盲人观察者是相同的。
2.4。组织准备胞质提取
胞质提取、组织与裂解缓冲与均质1:3 w / v比率。裂解缓冲(20 mM Tris-base, 150毫米氯化钠,10%甘油、0.1% triton - x - 100, 1%的皮套裤,2毫米EGTA)含有1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒(v / v)。随着提取物是用(5分钟)使用超声发生器(费舍尔科学)10分钟后,孵化在冰溶解产物离心(12500克,30分钟在4°C)。这些上层清液存储立即−80°C和被用来评估GS表达式和活动。蛋白质浓度测定使用Bicinchoninic酸(BCA)蛋白质化验(皮尔斯)。所有的实验都重复至少两次为每个不同的动物。
2.5。突触体的制备
P2膜像之前描述的那样得到[50]。脊髓的短暂,腰束均相在一个冰冷的缓冲区(0.32蔗糖,100μ米原钒酸钠,甘油磷酸盐0.02米,和1%的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,σ)玻璃均质器。10分钟的匀浆离心机在800 g在4°C。由此产生的颗粒rehomogenized和离心机。浮在表面的结合,离心机在4°C 12500 g为30分钟获得P2颗粒。这种颗粒在同质化resuspended缓冲区和蛋白质浓度测定用BCA蛋白质化验(皮尔斯)。样本存储在−80°C,并用于确定NMDAR子单元和GLT1表达蛋白免疫印迹协议如下所述。所有的实验都重复至少两次为每个不同的动物。
2.6。免疫沉淀反应和免疫印迹分析
胞质膜分数和P2获得如前所述用于免疫沉淀反应和免疫印迹分析。免疫沉淀反应300μ孵化了10 g的可溶性蛋白质μ克agarose-conjugated anti-nitrotyrosine抗体(北部生物技术)在一夜之间在4°C。通过离心收集琼脂糖珠(1分钟12000×g在4°C)和PBS洗(pH值7.4)三次。的混合beads-antibody和结合蛋白resuspended 50μL样品缓冲(2 x, 0.5三·盐酸(pH值6.8)2.5%甘油/ 0.5% SDS / 200毫米2-mercaptoethanol / 0.001%溴酚蓝)和加热在95°C(5分钟)。确定GS、GLT-1 NMDAR子单元是硝化,免疫印迹免疫沉淀反应蛋白质的复杂和总溶解产物都是使用特定于这些蛋白的抗体。总之,样本加载10% sds - page minigels GS检测和7.5% sds - page minigels NMDAR和GLT1检测(Bio-Rad)。
分离后SDS /页面,蛋白质被转移electrophoretically硝化纤维素膜(Bio-Rad)。朱红色红色(σ)染色法是用于确保成功的蛋白质转移。膜被封锁(1小时,室温)与1%牛血清白蛋白(BSA) / 0.1%硫柳汞在50毫米三·盐酸、氯化钠(pH值7.4)/ 150毫米/ 0.01%渐变20 (TBS / T)。膜与鼠单克隆anti-GS孵化(O / N, 4°C, 1: 1000稀释;转导实验室),鼠标单克隆GluN1抗体和兔多克隆GluN2B (O / N, 4°C, 1: 1000稀释;生物技术),北部和兔多克隆GLT1 (O / N, 4°C, 1: 1000稀释;我们的生物)。洗后TBS / T,膜与anti-mouse孵化辣根peroxidase-conjugated二级抗体或anti-rabbit辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:15000稀释或1:10000职责。Amersham)和特定的复杂探测到一个增强化学发光检测系统(ECL Amersham)。定量硝化水平是由微使用ImageQuant 5.2软件通过分子动力学(分子动力学)。平等的蛋白质加载决心使用β肌动蛋白表达看家基因。使用40 SDS /页面了μ克可溶性蛋白质和随后转移到硝酸纤维素(Bio-Rad)。膜被封锁(1 h,室温)屏蔽解决方案,然后用鼠标单克隆抗-孵化β肌动蛋白(2 h,室温下,1:5000稀释;σ)。洗后TBS / T,膜与anti-mouse孵化辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:15000稀释;Amersham)和特定的复杂的被一个增强化学发光检测系统检测到。没有区别的β肌动蛋白检测车道。所有微单位规范化对每个车道和肌动蛋白表达为硝化unnitrated蛋白质的比例。
2.7。谷氨酰胺合成酶活性
使用谷氨酰胺/ GS活性测定谷氨酸测定工具包(σ)后,制造商的协议。总之,样品(25μL)在200年的最后一卷μL孵化了醋酸缓冲和谷氨酰胺酶1小时37°C与Tris-EDTA-hydrazine缓冲区,其次是孵化NAD解决方案,ADP的解决方案,和谷氨酸脱氢酶在室温下了40分钟。评估NAD的转换+NADH的吸光度340海里了。所有的实验都重复至少两次为每个不同的动物。
2.8。统计分析
结果意味着±SEM。统计分析了使用方差分析Student-Newman-Keuls紧随其后。被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。FeTM-4-PyP5 +抑制NMDA介导的热痛觉过敏
鞘内注射的NMDA老鼠(2 nmol;(49])产生一个热痛觉过敏(图的时间发展1)。预处理的老鼠PN FeTM-4-PyP分解催化剂5 +(0.5 - 2 nmol,鞘内NMDA前15分钟)减少了NMDA-evoked热痛觉过敏在时尚存在剂量依赖的相关性(图1)。这些结果证实了我们以前的观测(11]和强调这样一个事实:自由基是引起的痛觉过敏的重要介质谷氨酸受体激活。
3.2。鞘内NMDA诱发脊髓GluN1 GluN2B酪氨酸硝化
硝化酪氨酸残基的GluN1(表1)和GluN2B(表1)单元NMDAR发生后引起的热痛觉过敏,鞘内注射NMDA (2 nmol)作为评估免疫沉淀反应和免疫印迹分析(数据2和3)。这种效应显著降低了预处理与FeTM-4-PyP老鼠5 +(2 nmol,鞘内NMDA前15分钟)(表1)。
3.3。Superoxide-Mediated硝化的谷氨酸转运体GLT-1由FeTM-4-PyP逆转5 +
鞘内注射NMDA (2 nmol)导致硝化的谷氨酸转运体GLT1免疫沉淀反应试验观察到的腰束脊髓(表1,图4)。预处理与FeTM-4-PyP老鼠5 +(鉴于鞘内NMDA前15分钟)防止GLT1硝化(表1,图4与热痛觉过敏(图)在一起1)。
3.4。鞘内NMDA诱发硝化谷氨酰胺合成酶的腰椎脊髓束
除了NMDAR子单元和GLT1,鞘内注射NMDA (2 nmol)同样促进硝化酪氨酸残基的GS。这种酶被发现几乎只在星形胶质细胞,通常将synaptically释放谷氨酸转化为无毒的谷氨酰胺。Tyrosine-nitrated蛋白质免疫印迹免疫沉淀反应和分析了硝化GS的存在。门冬氨酸(2 nmol,鞘内)诱发脊髓GS硝化(表1,图5),其失活是谷氨酰胺形成的显著减少(如图所示6)。FeTM-4-PyP5 +(2 nmol,鞘内NMDA前15分钟)阻塞PN-mediated硝化(表1)和恢复其酶活性(图6)。
这些数据表明,PN形成诱导在NMDAR激活导致转译后的修改重要的蛋白质参与谷氨酸营业额导致疼痛的途径。
4所示。讨论
脊髓背角的调制的疼痛的地方信息发生C-fiber痛觉受器通过谷氨酸的释放。这里我们已经表明,一旦释放,谷氨酸对其行动NMDAR增加活性氧的生产等,没有,反过来PN导致硝化酪氨酸残基的谷氨酸传输的关键元素。鞘内NMDA政府后,硝化NMDAR子单元,谷氨酸转运体GLT1,观察和GS合成酶在脊髓和这些事件与增强的热痛觉过敏的反应。
脊髓神经元表达谷氨酸受体的三个亚型:门冬氨酸和kainate AMPA (KA) / (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic酸),这都是ligand-gated离子通道和metabotropic受体(mGluRs) [51]。另一方面,NMDAR激活是高度管制,需要几个条件。通道开放需要去极化,引起AMPA受体的激活早期初级传入纤维,为了消除镁生理堵塞,插头通道压敏电阻器的方式(52),同时由两个受体激动剂激活(谷氨酸和甘氨酸)(51,53]。增强突触后细胞的敏感性由谷氨酸诱发事件被称为中枢敏化,通过消除发生的镁块NMDAR离子通道或通过转译后的变化介导的磷酸化受体,这似乎主要是中枢敏化的机制参与维护(54]。之间的平衡的酪氨酸残基磷酸化/脱磷酸作用NMDAR子单元是调节受体的活动(55]。受体磷酸化强化突触电流、钙流入和AMPA-receptor介导反应已知依赖NMDAR激活(51]。在其酪氨酸残基磷酸化的NMDAR发生通过激活Src激酶家族,由PN高度激活(56]。酪氨酸硝化可能防止蛋白质磷酸化形式的执行任务或者模仿磷酸化所强加的结构性变化的后果,因此模仿磷酸化与不同的硝化酪氨酸残基是一个不可逆过程,可以改变正常蛋白的功能增强或抑制他们的活动57]。NMDAR提出了潜在的硝化和网站之前它已经被证明的硝化NMDAR子单元在体外和在活的有机体内缺氧导致的模型增加谷氨酸NMDAR绑定,因此增加钙流入和突触电流(43,58]。我们先前已经表明,在中枢敏化的增加产量,进而导致硝化PN和失活MnSOD [2,11,59]。失活所以导致内源性清除剂的自由基的产量增加,至少在某种程度上,导致痛觉过敏的的维护状态。
在胶质细胞谷氨酸代谢发生只在特定的转运蛋白的存在允许除谷氨酸突触间隙。众所周知,谷氨酸,谷氨酸转运体的吸收系统受损PN (35,37]。最有可能的是,谷氨酸转运体活动的损失是由于转译后的修改,因为它既不是与减少mRNA和基因突变(60,61年]。PN降低谷氨酸的容量从突触谷氨酸转运蛋白去除空间导致神经毒素浓度的神经递质(35]。二硫苏糖醇(DTT),一个特定的二硫化物还原剂和Mn (III) TBAP,非选择性抗氧化,恢复运输活动62年,63年]。酪氨酸硝化转译后的修改,提高对蛋白酶体降解的(29日]。在NMDA-mediated痛觉过敏,我们发现运输车GLT-1经历/ PN攻击,最终导致这种蛋白质硝化。
谷氨酸神经胶质细胞内分解代谢发生主要是通过形成谷氨酰胺酶通过GS是唯一在中枢神经系统,可以禁用这个兴奋性氨基酸。GS是由自由基攻击(灭活64年)导致突触谷氨酸,因此长期积累NMDAR刺激。通过NMDAR谷氨酸介导的神经中枢敏化的发展中起着至关重要的作用。脊髓释放谷氨酸和随后NMDAR激活支持PN积累形成同时,也没有。此外,没有形成,,PN脊髓导致痛觉过敏的发展所导致的鞘内交付NMDA (2]。GS活动是由腺苷酸的酪氨酸残基在每个12相同亚基的酶(65年]。硝化酪氨酸残基会导致完全丧失的adenylylated酶的催化活性在体外(65年,66年观察)和GS活性损失在沙鼠模型缺血/再灌注损伤(67年]。在增强疼痛,神经可塑性的变化发生在脊髓和脊椎上的痛觉调制中心和可能导致过敏的状态称为中枢敏化,这被认为是导致慢性疼痛状态(47]。
我们以前记录的角色PN在疼痛的级联2,11,37,44,59,68年]。这里我们有证明PN维护中枢敏感化和痛觉过敏通过调节谷氨酸传输转译后的硝化NMDAR子单元,GLT1和GS。这些事件是谷氨酸的规定营业额的基础,因此调制的脊髓神经元的输入响应调节中枢敏感化如图7。
更广泛的含义,我们的发现是,PN可能导致各种形式的集中由NMDAR激活诱导痛觉过敏。这些数据连同我们的发现在自由基的识别食腐动物小说nonnarcotic代理(11,37,59,69年)强烈支持这一概念,所以/ PN是可行的治疗目标nonnarcotic止痛剂的发展各种病因的疼痛。事实上,我们发现脊髓NMDA管理导致GLT1, GS硝化和谷氨酰胺生产的不平衡与发展相关联的热痛觉过敏。
利益冲突
作者特此声明无利益冲突。
确认
这项工作是支持由“Investiamo nel成就无缝化”,在其a3 - 00359和gr - 2010 - 2318370。作者要感谢Giovanni Politi先生和小姐Syeda阿伊莎阿里Wasti技术援助。