文摘
A群链球菌(气)在人类身上强加了一个很大的负担。努力减少相关的发病率和死亡率是一个关键问题。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是调节炎症反应在传染病。然而,GSK-3的规定β在气体感染仍然是未知的。本研究调查GSK-3之间的互动βNF -κB,和可能的相关炎症介质体外和小鼠模型。结果显示,天然气可以激活NF -κB,其次是诱导一氧化氮合酶的表达增加(间接宾语),没有生产小鼠巨噬细胞细胞系。激活GSK-3β气体后发生感染,抑制GSK-3β伊诺表达减少,没有生产。此外,GSK-3β抑制剂减少NF -κB激活和随后的TNF -α生产,这表明GSK-3β徒上游NF -κB在GAS-infected巨噬细胞。类似于体外研究结果,GSK-3管理工作β抑制剂的空气袋气体感染小鼠模型显著降低血清TNF水平α和提高成活率。GSK-3的抑制β到中度炎症效应对气体感染可能是另一种治疗策略。
1。介绍
A群链球菌(气体;酿脓链球菌)是一种重要的人类临床病原体和引发广泛的临床表现包括咽炎、丹毒、坏死性筋膜炎、中毒性休克综合征,败血症,甚至死亡1]。大量的毒性气体的因素,包括表面分子如M蛋白,透明质酸胶囊,ca5的肽酶,或外毒素,如高热所产生的外毒素、链激酶、透明质酸酶,和链球菌溶血素O和年代,使细菌抵抗巨噬细胞的吞噬作用,逃离complement-mediated破坏,妨碍大量炎症细胞,或触发免疫系统的过度反应2- - - - - -6]。尽管先进的支持性护理和有效的抗生素治疗,气体侵入性疾病仍负责世界上每年至少有163000人死亡(2,7,8]。这些事实强调迫切需要有效的抗生素治疗之外的治疗策略。气体急性侵袭性感染,患者il - 6和TNF -高程的大小α的严重程度密切相关的系统性疾病的表现。入侵情况下遭受严重中毒性休克和/或坏死性筋膜炎有更高的频率- 2、il - 6和TNF -α第细胞循环比长程入侵情况下(9,10]。证据表明,细胞因子生产的感应,至少部分,由于超级抗原的气体。激活后超级抗原,细胞因子的生产(如il - 1、TNF -α、il - 6和干扰素-γ),该调解震惊和组织损伤,就会启动。链球菌发热外毒素(SPE) B能够pre-IL-1灭亡β释放il - 1活性形式β(11]。此外,肽聚糖,lipoteichoic酸,和杀微生物能够通过单核细胞诱导肿瘤坏死因子生产在体外(12,13]。因此,临床管理控制加剧炎症反应气体引起的感染可能会进一步降低担保组织损伤和减少发病率和死亡率。
糖原合成酶激酶3 (GSK-3)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与调节许多细胞内的功能,包括细胞分裂,细胞凋亡,细胞命运在胚胎发育过程中,由胰岛素和许多生长因子信号通路的刺激,甚至癌症的疾病过程的失调,糖尿病和神经退行性疾病(14- - - - - -17]。此外,GSK-3在促进[至关重要18)或抑制(19]NF -的活性κB这表明其可能的监管在炎症中的作用。GSK-3抑制剂或核可以降低TNF -的生产α和il - 6,增强il - 10在单核细胞刺激后的生产脂多糖(LPS) [20.]。GSK-3β也显示调节STAT3-mediated LPS-stimulated胶质细胞il - 6生产(21]。此外,GSK-3消极监管mycobacterium-induced生产以及后续IFN - il - 10γ在单核细胞分泌22]。在脓毒症动物模型,用GSK-3抑制剂治疗可以抑制NF -κB-dependent促炎细胞因子表达和从器官损伤和内毒素休克提供保护20.,23,24]。然而,以往的研究调查的角色GSK-3在感染LPS-induced脓毒症模型。很少有研究调查GSK在活细菌感染的作用,它是更具代表性的临床状况25- - - - - -28]。同时,所知甚少GSK在革兰氏阳性细菌感染的作用。
巨噬细胞是人类先天免疫的前线组件之一。它扮演着一个重要的角色在清除入侵病原体通过吞噬作用。干扰巨噬细胞功能导致更高的死亡率GAS-infected动物模型(29日]。这意味着感染巨噬细胞对天然气的重要作用。寻找GSK-3的可能作用β在气体引起的炎症反应,我们评估GSK-3的活动β和随后的炎症介质在小鼠巨噬细胞细胞系和小鼠模型。我们的研究结果表明,气体感染诱发GSK-3β活动,NF -κB核易位,伊诺的表情,没有和TNF -α生产。抑制GSK-3β会调节的活动NF -κB和生产没有和TNF -α。GSK-3的影响β抑制剂也观察到GAS-infected老鼠。
2。材料和方法
2.1。老鼠
BALB / c小鼠从杰克逊实验室购买,巴尔港,缅因州,保持在标准实验室食物和水随意在我们的动物中心。他们的后代,从8到10周的年龄,被用于实验。动物使用协议进行审核和批准的机构动物保健和使用委员会(IACUC)。
2.2。菌株
链球菌NZ131(类型M49 T14)从d·r·马丁博士获得新西兰传染病中心,Porirua。这一毒株不包含phage-specificspe一个和speC基因。
2.3。感染的空气袋模型
在先前的研究中,我们建立了天然气感染的小鼠模型使用空气袋(30.,31日]。老鼠被乙醚吸入麻醉然后皮下注射2毫升的空气形成一个空气袋。细菌悬液接种到空气袋。小鼠感染天然气开发菌血症和传播到肾脏,肝脏和脾脏。老鼠死后几天(通常是3 - 7天)内气体的感染。因此这个模型是脓毒症的动物模型。
2.4。气体感染巨噬细胞
小鼠巨噬细胞细胞系生264.7与10%的边后卫在DMEM培养5%股份有限公司2在37°C。264.7原始细胞被播种在2×105/在24-well板包含介质没有抗生素。第二天,NZ131文化生长在TSBY在midlogarithmic收获阶段和添加到原始264.7单层膜在不同感染复数(MOI) 10、50和100。60分钟的孵化后37°C,不依从细胞外的细菌被删除了PBS的培养基和洗涤。附着胞外细菌随后被孵化用新鲜培养基含有10μg / mL青霉素g在特定时间点后感染,对ELISA收集上层清液,整个细胞提取准备免疫印迹分析。
2.5。ELISA
肿瘤坏死因子的水平α在血清或用ELISA试剂盒检测细胞培养上清液(研发系统),根据制造商的指示。所有测量进行了一式三份。
2.6。免疫印迹分析
完整的细胞提取分离利用sds - page和转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。阻塞后,墨迹了兔子总抗体和磷酸化GSK-3 (Ser9)β、总GS和磷酸化(Ser641) GS和鼠标伊诺抗体。小鼠抗体特定GAPDH或α微管蛋白用于内部控制。最后,墨迹与辣根过氧化物酶,(合)杂化共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白G(免疫球蛋白)或山羊anti-mouse免疫球蛋白,孵化与增强化学发光(ECL)解决方案,和接触x射线胶片。
2.7。采用免疫染色
不同时间点采集的细胞固定在4%甲醛10分钟。充分稀释anti-NF -κB p65抗体应用。与主要的抗体反应后在室温下1 h, FITC-labeled二级抗体是申请额外的1 h。DAPI用于核染色。阳性细胞的三个字段(在放大×200)的文化测量。
2.8。没有分析
气体感染后24小时有或没有GSK-3β抑制剂,浮在表面的细胞培养的收集。然后,50μ50 L格里斯试剂混合了μL亚硝酸盐水平的样本进行测量,根据制造商的指示。
2.9。荧光素酶报告实验
NF -κ记者分析,细胞被瞬变cotransfected NF -κ(0.2 B promoter-driven荧光素酶记者μg)和0.004μ克Renillaluciferase-expressing质粒(pRL-TK;Promega)使用干扰机的基因转染试剂(Stratagene)。在转染后24 h,细胞被感染NZ131 1 h,然后替换为介质含有抗生素。荧光素酶测定细胞然后收获(Dual-Glo;Promega)。萤火虫荧光素酶活动被规范化Renilla荧光素酶活性评价转染效率。
2.10。抗体和试剂
鼠单克隆抗体特定的NF -κB p65从Chemicon获得国际公司单克隆anti-mouse伊诺BD生物科学。Peroxidase-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白和山羊anti-rabbit免疫球蛋白是英杰公司集团phospho-GSK-3抗体β(Ser9) GSK-3βphospho-glycogen合成酶(GS) (Ser641),从细胞信号技术和GS, Inc .)抗体GAPDH是密理博公司。抗体α吡咯烷二硫代氨基甲酸微管蛋白是来自圣克鲁斯生物技术有限公司(PDTC), 3 - (2, 4-dichlorophenyl) 4 - (1-methyl-1H-indol-3-yl) 1 h-pyrrole-2 5-dione (SB216763)和3 - [(3-chloro-4-hydroxyphenyl)氨基]4 - (2-nitrophenyl) 1 h-pyrrol-2 5-dione Tocris生物科学(SB415286)。6-Bromo-indirubin-3′肟(生物),氯化锂(氯化锂)和氯化铵(NH4Cl)从Sigma-Aldrich有限公司抗体阻断特定TLR2和isotype-matched抗体控制来自eBioscience, Inc .)
2.11。细胞生存能力
在24 h后气体有或没有GSK-3感染和治疗β抑制剂,原始细胞264.7刷新与培养基6-well盘子。然后,整个培养基吸气。活和死细胞培养基直接计算与锥虫蓝染色后显微镜下。
2.12。气体感染后小鼠存活率
与气体进入空气袋,接种后不同剂量的GSK-3β抑制剂注入到腹膜腔在不同的时间点。观察小鼠感染后的生存每24小时10天。
2.13。统计数据
所有数据都是使用双尾学生的表现5.01的软件以及GraphPad棱镜。的值< 0.05被认为是重要的。分析了鼠标存活率kaplan meier方法。
3所示。结果
3.1。气体感染诱发NF -的激活κB和进气阀打开,没有表达的增加生产RAW264.7细胞
NF -κB是一个无处不在的转录因子,起着重要的作用在宿主体内致病菌。NF -的激活κB可以诱导的表达数量的分子参与炎症反应,如细胞因子和间接宾语(32,33]。感染人类的呼吸道上皮细胞与气体感应激活NF -κB (34]。地址如果感染的巨噬细胞与气体也可以诱导激活NF -κ264.7 B,小鼠巨噬细胞原始细胞感染气体NZ131应变莫伊不同时期的10。通过采用免疫染色和NF -褶皱的计算κB核易位,NF -核易位κB气体后逐渐增加感染和NF -显著激活κB观察4 h后感染(数字1(一)和1(b))。NF -类似的趋势κB激活时也被观察到荧光素酶的活性测定记者试验(图1(c))。
进一步评估伊诺的表达式和后续生产的,我们确定的时间动力学和剂量反应气体通过免疫印迹和格里斯试剂。结果显示,汽油诱导伊诺的表达时间的方式(图1(d))。没有生产增加12 h和莫伊50或100年在24小时的莫伊10(图1(e))。进一步澄清是否伊诺表达和生产主要是通过NF -κ264.7 B-dependent通路,原始细胞处理气体的存在与否NF -κB抑制剂,PDTC。抑制NF -κB活性抑制伊诺和没有生产(数据造成的1(f)和1(g))。这些结果揭示NF -的一个重要的角色κB在调节进气阀打开,没有表情的天然气感染。
3.2。气体感染激活GSK-3β和抑制GSK-3β减少伊诺的表达,无生产RAW264.7细胞
自从GSK-3β了行动的上游NF -κB (16,18,35,36),我们调查是否GSK-3β可以调节NF -κB在气体感染,可能是一个潜在的治疗目标。的去磷酸化GSK-3β在丝氨酸9后2小时内观察到气体治疗,这表明GSK-3诱导激活的β在原始细胞感染后气体(图264.72(一个))。GSK-specific底物磷酸化GS,也增加了在感染后2 h(补充图在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/720689)。这些结果表明,天然气感染可能诱发GSK-3β激活。当264.7原始细胞被刺激与heat-inactivated气体,只有轻微的激活GSK-3β(补充图)。
(一)
(b)
(c)
(d)
进一步探索GSK-3的角色β,我们发现伊诺降低了GSK-3的表达β抑制剂(图2 (b))。尽管伊诺表达没有明显的抑制与锂盐治疗与某人化合物和生物治疗相比,没有明显抑制生产的锂(图2 (c))。生物可以有效地抑制生产。在测量气体下的细胞生存能力感染或没有GSK-3β抑制、天然气感染导致29.23%的细胞死亡和GSK-3治疗β抑制剂,锂和生物,可以提高细胞生存能力(图2(一个))。因此,没有生产的减少并不是由于细胞数量减少。这些结果证实GSK-3β激活参与气体GSK-3感染和抑制β减少生产,这意味着可能的感染治疗应用于气体。
3.3。抑制GSK-3β活动会使NF -κB激活和TNF -α264.7生产GAS-Infected原始细胞
进一步确定GSK-3的重要作用β在气体感染,我们研究了GSK-3的效果β抑制NF -κB激活和TNF -α生产。使用免疫细胞化学检测NF -κB p65气体感染后,核易位NF -κB抑制GSK-3后减少β通过各种抑制剂(图3(一个))。NF -的比率κB GSK-3后核易位β抑制剂治疗甚至低于基础水平(图3 (b))。调查是否TNF -α生产也受到NF -κ264.7 B,我们对待原始细胞与PDTC气体感染。肿瘤坏死因子-α生产显著抑制NF -κB抑制(图3 (c))。这意味着气体产生TNF -α表达式通过NF -κB激活。此外,当接受生物和锂,TNF -的生产α也减少了气体感染(图3 (d)并补充图)。这些结果表明GSK-3β参与气体引起的NF -κB激活和TNF -α生产、GSK-3抑制β可以减少气体引起的炎症反应。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。气体内化和TLR-2信号调节TNF -α生产和伊诺表达式
天然气是生存和复制在巨噬细胞和细胞内气体可以调解NF -κB活动(37]。此外,革兰氏阳性菌的细胞壁组成部分可以通过TLR-2诱导炎症反应(38]。我们下一个决定是否气体入侵或坚持质膜可以调节肿瘤坏死因子-α和伊诺表达式。我们发现,内吞作用的抑制或阻断TLR-2信号能部分抑制TNF -α和伊诺表达式(补充和)。这些结果表明,天然气内化和TLR-2信号可能至少部分参与气体引起的炎症反应的调节。
3.5。抑制GSK-3β活动提供了保护气体引起的败血症和抑制血清TNF -α在小鼠模型
自从GSK-3的抑制β导致了NF -κB激活和TNF -α生产在体外,我们下一个决定这是否通过GSK-3保护作用β抑制可以观察到在活的有机体内。管理锂,药物已经用于双相情感障碍,提高了人们的存活率在治疗组()(图4(一))。锂治疗感染后气体可以显著抑制肿瘤坏死因子-α生产(图4 (b))。因此,抑制GSK-3β可以降低TNF水平-α和增加气体引起的脓毒症模型中生存。
(一)
(b)
4所示。讨论
A群链球菌是一种重要的人类病原体,具有很高的临床全球负担7]。减少气体引起的相关并发症和死亡率和发病率感染仍然是一个至关重要的问题。GSK-3,糖原代谢的关键酶,参与细胞内的许多功能(15]。在最近的研究震惊和炎症(16,20.,23,36),GSK-3β抑制剂不仅可以抑制促炎细胞因子的生产,但也会增加抗炎细胞因子。GSK-3β抑制剂还提供了一种生存优势,可以减弱器官损伤在脓毒症动物模型。然而,GSK-3的保护作用β抑制主要是在LPS-induced脓毒症模型和只有少数研究探索GSK-3的可能影响β抑制对活细菌,更类似于临床条件(26]。在目前的工作中,我们证明了气体感染诱导GSK-3的激活β和增加核易位NF -κB,以及伊诺表达式和TNF -α生产。抑制GSK-3的活动β能够表达下调的激活NF -κB和抑制随后的炎症介质,包括进气阀打开,不,和TNF -α气体引起的感染。这一结果也与先前的调查结果,GSK-3一致β徒上游NF -κB (16,18,35,36),目前的研究表明,气体通过GSK-3激活巨噬细胞βnf -κB-dependent通路(图5)。以前的报告表明,heat-inactivated金黄色葡萄球菌也可以调解GSK-3β活动(39]。在目前的研究中,GSK-3β活动仅略增加刺激后heat-inactivated气体(补充图)。是否气体引起GSK-3β活动可能与一些分泌蛋白质,除了细胞壁成分,还有待探索。此外,上游的身份识别受体分子甚至都不清楚。先前的研究[40,41]表明,气体和后续的识别信号转导是MyD88依赖。因此,还需要进一步的研究来阐明GSK-3之间的串扰βMyD88和NF -κB。
GSK-3β众所周知,主要调节真核转录因子NF -κB,参与许多细胞内的过程。经过活化的NF -κB亚基的p50 / p65把从细胞质到细胞核和目标基因转录启动,包括促炎细胞因子、趋化因子、粘附分子,矩阵metalloproteases(基质金属蛋白酶),和进气阀打开42- - - - - -44]。各种报告(16,20.,45,46表明GSK-3β能够影响NF -κB活动由几个不同的机制:(1)通过磷酸化的我κB,(2)促进p50 / p65核易位和绑定到DNA,(3)磷酸化p65,或(4)通过分子。在我们目前的工作中,我们证明了NF -κB气体引起的炎症反应中起着重要的作用。治疗后各种GSK-3β264.7抑制剂GAS-infected原始细胞,核易位NF -的比率κB和水平下降甚至低于未感染组。NF -κB是已知调解许多促炎反应在细菌感染(46),包括气体(34]。我们的研究结果表明NF -κB在TNF -监管中发挥核心作用α和伊诺表达式。我们还发现,GSK-3β、天然气内化,TLR-2调解TNF -α和伊诺表达式。的详细机制GSK-3之间的相互关系β、气体内化和TLR-2信号导致NF -κB激活仍有待澄清。
GSK-3 LPS-induced脓毒症模型β磷酸化在Ser9最初被发现减少但恢复到基线水平后很短的时间内(47- - - - - -49]。相比之下,我们的数据显示GSK-3长期去磷酸化β在Ser9甚至24小时刺激后气体。我们发现,肿瘤坏死因子-的生产α也没有坚持24小时后感染。肿瘤坏死因子-α发挥了至关重要的作用在调节细胞因子级联和巨噬细胞的命运50]。删除TNF受体p60或p80促进LPS-induced凋亡[51),但逐渐脱敏Fas ligand-induced凋亡[52]。监管的双重角色没有炎症也是公认的。不同级别的任何生产和持续时间没有接触有害因素调节炎症和组织损伤的程度(53]。GSK-3持续激活的病理生理作用β在GAS-stimulated巨噬细胞和随后的炎症反应和细胞命运的监管仍然需要进一步调查。
脓毒症是一个复杂的病原体和宿主之间的相互作用。脓毒症是破裂的细胞因子的生产,趋化因子,也没有。这些炎性标记物的转录发生主要通过激活NF -κB和导致后续组织低灌注,凝血系统的器官损伤,和失调(54]。气患者感染、高循环水平的细胞因子,如肿瘤坏死因子-α和il - 6,也与疾病严重程度(10]。因此,封锁NF -的活性κB和促炎介质的生产可能防止进一步的脓毒症的发病率和死亡率。在临床试验中针对促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α或il - 1β脓毒症患者,在没有取得理想的结果(55- - - - - -57]。在以前的研究中,GSK-3的管理β抑制剂透露有前途的好处为生存在动物模型(16,20.,23,36]。在目前的研究中,我们还显示,GSK-3β抑制气体感染提供生存的好处。活细菌感染是细菌的增殖,多个外毒素的生产和各种感染后诱发炎症通路。我们使用的气体压力是一个SPE B-producing应变引起宿主免疫系统的失调,促进入侵的细菌(58]。如果治疗GSK-3β抑制剂只能抑制促炎细胞因子的生产也没有阻止SPE B-induced致病作用,持久的复制和传播的细菌会预期,这将减少GSK-3的治疗效果β抑制剂。然而,由于GSK-3的多效性的影响β包括抗炎、抑制antiapoptosis和组织再生45),GSK-3β抑制可能是一个优越的治疗策略,利用单克隆抗体拮抗剂在脓毒症与抗生素治疗相结合的管理。
5。结论
总之,气感染巨噬细胞可以调解GSK-3的激活βnf -κB信号通路和TNF -的后续生产α也没有。抑制GSK-3β可以表达下调NF -κB及其相关的炎症反应。在动物模型研究中,GSK-3β抑制可以降低TNF -α生产和降低死亡率与对照组相比。自从GSK-3β抑制可以提供抗炎作用在体外和在活的有机体内细胞因子,它可以抵消该州在脓毒症组织损伤,因此作为一种治疗策略除了抗生素治疗。
利益冲突
没有利益冲突应该宣布。
确认
作者感谢罗伯特·安德森博士的批判阅读本文。这项工作是由授予Y.-T nckuh - 10105009 (。Chang)从NSC的国立成功大学医院和101 - 2320 - b - 006 - 021 - my3 Y.-S。林)从美国国家科学委员会,台湾。
补充材料
补充图1。NZ131诱发GSK-3β的激活。免疫印迹分析GSK-3β活动的动态变化,确定其特定的底物,磷酸化在Ser641 GS。
补充图2。Heat-inactivated NZ131介导轻微GSK-3β激活的巨噬细胞。免疫印迹分析用于分析的影响heat-inactivated NZ131 (heat-killed,香港;莫伊:10)的监管GSK-3β活动通过检测在Ser9 phospho-GSK-3β的表达。
补充图3。GSK-3β、气体内化和TLR-2调解TNF-α的生产。264.7原始细胞治疗NZ131 (MOI: 10) GSK-3β抑制剂的存在氯化锂(10毫米),内吞作用抑制剂NH4Cl(10毫米),anti-TLR2抗体(2.5μg /毫升),免疫球蛋白(2.5μg /毫升)的控制。细胞上清液收集后24 h NZ131感染和TNF-α水平取决于使用酶联免疫试剂盒。
补充图4。GSK-3β、气体内化和TLR-2调节伊诺的表达。264.7原始细胞治疗NZ131 (MOI: 10) GSK-3β抑制剂氯化锂的存在,内吞作用抑制剂NH4Cl, anti-TLR-2抗体和免疫球蛋白的控制。细胞溶解产物收集后24 h NZ131感染和伊诺表达式是由免疫印迹分析。